張爽，薛正蓮，陳環(huán)，蘇燕南，王洲

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000)

一種電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌方法的優(yōu)化

張爽，薛正蓮，陳環(huán)，蘇燕南，王洲

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000)

提出了一種電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的方法。該方法通過調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)和電擊轉(zhuǎn)化過程中培養(yǎng)基和溶液成分來調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，提高細(xì)胞在高電場強(qiáng)度電擊后的存活率而達(dá)到提高轉(zhuǎn)化效率的目的。優(yōu)化前的轉(zhuǎn)化率為5.0×105cfu/μg，經(jīng)優(yōu)化后轉(zhuǎn)化效率可達(dá)8×106cfu/ μg，比優(yōu)化前提高了15倍。

枯草芽孢桿菌;電擊轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化率

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種重要的工業(yè)微生物，其遺傳學(xué)和生理學(xué)特性已得到深入研究［1］，人們對其遺傳背景和生理特性的了解僅次于E.coli［2］?？莶菅挎邨U菌能直接將目的基因產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，且表達(dá)產(chǎn)物可溶、可正確折疊，具有生物活性，同時表達(dá)產(chǎn)物與胞內(nèi)蛋白分離，無需破碎細(xì)胞，利于分離純化，是極具應(yīng)用前景的基因表達(dá)宿主［2］。

但是，在枯草芽孢桿菌工程菌構(gòu)建過程中，能自發(fā)形成感受態(tài)的菌株極少，且感受態(tài)持續(xù)時間短暫，分子克隆效率低，從而限制了外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)［3］。目前外源基因?qū)胨拗骶闹饕侄斡懈惺軕B(tài)法［4］、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法［5］和電擊轉(zhuǎn)化法［6］。其中，電擊轉(zhuǎn)化法被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化效率最高的一種方法。然而，電擊轉(zhuǎn)化過程中需要平衡轉(zhuǎn)化效率和死亡率的關(guān)系，隨著電場強(qiáng)度的增加，外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的可能性越大，死亡率也隨之增加。陸雁等［7］以不同預(yù)培養(yǎng)時間優(yōu)化復(fù)制子轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中，最高轉(zhuǎn)化率為2.58×104cfu/μg;王培培等［8］對枯草芽孢桿菌NCD電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，最高效率為6.07×104cfu/μg;而目前芽孢桿菌電擊轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率最高為1.4×106cfu/μg［9-10］，還不能滿足高效率轉(zhuǎn)化，如構(gòu)建基因文庫的要求。本實驗通過對枯草芽孢桿菌制備感受態(tài)時生長狀態(tài)、穿梭載體加入量、回復(fù)培養(yǎng)基、電擊轉(zhuǎn)化緩沖液以及電擊時電壓的選擇等方面條件的優(yōu)化，使枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化率增大，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌WB600、大腸桿菌JM109、穿梭載體pHY-p43均由江南大學(xué)生物工程學(xué)院余曉斌教授(實驗室)惠贈;分子生物學(xué)試劑及試劑盒均購買于生工生物(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基的制備方法:胰蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L，酵母提取物質(zhì)量濃度為5 g/L，氯化鈉質(zhì)量濃度為10 g/L，pH值為7.2。

LB固體培養(yǎng)基的制備方法:胰蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L，酵母提取物質(zhì)量濃度為5 g/L，氯化鈉(NaCl)質(zhì)量濃度為10 g/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度為1.5 g/L，pH值為7.2。

SLB培養(yǎng)基的制備方法:蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度為5 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L，山梨醇的濃度為0.5mol/L，pH值為7.2。

ORM培養(yǎng)基的制備方法:蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度為5 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L，山梨醇的濃度為0.8 mol/L，pH值為7.2。

RM培養(yǎng)基的制備方法:蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度為5 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L，山梨醇的濃度為0.5 mol/L，pH值為7.2。

1.1.3 試劑

氨芐青霉素:儲存濃度為50 mg/mL，工作濃度為50 μg/mL;

四環(huán)素:儲存濃度為5 mg/mL，工作濃度為50 μg/mL;

SMG緩沖液:0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10 g/L甘油。使用去離子水配制，121℃滅菌20 min;

SG緩沖液:0.5 mol/L山梨醇，10 g/L甘油，使用去離子水配制，121℃滅菌20 min;

MG緩沖液:0.5 mol/L甘露醇，10 g/L甘油，使用去離子水配制，121℃滅菌20 min;

Gly緩沖液:10 g/L甘油，使用去離子水配制，121℃滅菌20 min。

1.2 枯草芽孢桿菌制備

從4℃冰箱中取出保藏的枯草芽孢桿菌WB600，活化菌株;用移液槍吸取1 mL過夜培養(yǎng)物在無菌凈化臺接種于40 mL SLB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.7;將菌液冰水浴10 min后，放入離心管中，4℃，5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞;在無菌凈化臺上用0℃預(yù)冷的40 mL SMG緩沖液通過移液槍吹懸步收集的細(xì)胞，4℃，5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，漂洗4次;用2 mL SMG緩沖液吹懸收集的細(xì)胞，分裝于離心管(60 μL/管)中，-80℃保存，每管約有6×108個感受態(tài)細(xì)胞。

1.3 電擊轉(zhuǎn)化

取50 ng pHY-P43質(zhì)粒DNA，加入到1管感受態(tài)細(xì)胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使pHY-P43質(zhì)粒DNA和感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，冰浴2 min;將體系轉(zhuǎn)移至0℃預(yù)冷的電擊杯(1 mm)中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊(電壓21 kV/cm，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊1次，時間常數(shù)=5 ms);立即向電擊杯中加入1 mL ORM培養(yǎng)基，通過移液槍反復(fù)輕輕吹打混勻;將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)2小時后，將培養(yǎng)體系涂布于含有氨芐青霉素和四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃，過夜培養(yǎng)。然后隨機(jī)挑取生長出來的單克隆，提取質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳，在5 kb左右可見清晰的質(zhì)粒條帶，說明驗證轉(zhuǎn)化成功。計數(shù)菌落，計算轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率為每μg質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化子的驗證

根據(jù)1.4節(jié)的步驟將pHY-p43轉(zhuǎn)化至WB600中，電擊后涂布在含有終濃度為50 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃，過夜培養(yǎng)。然后隨機(jī)挑取生長出來的單克隆，提取質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖1所示，在5 kb左右有清晰可見的質(zhì)粒的條帶，說明轉(zhuǎn)化成功。在平板上計數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)量，平均轉(zhuǎn)化率為5.0×105cfu/μg。

圖1 轉(zhuǎn)化子的PCR驗證電泳結(jié)果

2.2 枯草芽孢桿菌細(xì)胞生長OD值的優(yōu)化

為了考察枯草芽孢桿菌不同的生長狀態(tài)對感受態(tài)的制備和后期轉(zhuǎn)化的影響，培養(yǎng)細(xì)胞OD600值分別為0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3和1.5時，收集細(xì)胞，根據(jù)感受態(tài)制備方法，制備不同生長時期的感受態(tài)。將穿梭載體pHY-p43 50 ng通過電擊轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐青霉素和四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基平板，計數(shù)轉(zhuǎn)化菌落，計算轉(zhuǎn)化率。由圖2可知:當(dāng)OD600值為0.7時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，平均為9.8×105cfu/μg。

圖2 不同生長OD值對轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 穿梭載體加入量的優(yōu)化

在優(yōu)化穿梭載體加入量的影響時，選擇了枯草芽孢桿菌生長OD值為0.7時制備感受態(tài)。在點擊轉(zhuǎn)化中分別加入20，40，60，80，100和120 ng的穿梭載體pHY-p43，再進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，計算轉(zhuǎn)化率。由圖3可知:當(dāng)穿梭載體的加入量為80 ng以上時，轉(zhuǎn)化達(dá)到平衡為2.3×106cfu/μg，所以最終選擇的載體的加入量為80 ng。

圖3 不同載體加入量對轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 電擊后回復(fù)培養(yǎng)基的優(yōu)化

在OD600值為0.7時收集細(xì)胞用于感受態(tài)細(xì)胞的制備，在電擊轉(zhuǎn)化步驟時加入80 ng的穿梭載體進(jìn)行電轉(zhuǎn)化;電擊完成后向電擊杯中加入1 mL回復(fù)培養(yǎng)基，選擇的山梨醇濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1和1.2 mol/L，其余實驗條件與優(yōu)化前相同。實驗結(jié)果如圖4所示:當(dāng)山梨醇濃度為0.8 mol/L時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值為3.1×106cfu/μg;當(dāng)山梨醇的濃度大于0.8 mol/L時，轉(zhuǎn)化效率快速下降，這可能是因為山梨醇濃度過大影響了細(xì)胞的滲透壓。

圖4 山梨醇含量對轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 電擊轉(zhuǎn)化緩沖液的優(yōu)化

在OD600值為0.7時收集細(xì)胞用于感受態(tài)細(xì)胞的制備，在電擊轉(zhuǎn)化步驟時加入80 ng的穿梭載體進(jìn)行電轉(zhuǎn)化;電擊完成后向電擊杯中加入1mL回復(fù)培養(yǎng)基，回復(fù)培養(yǎng)基中山梨醇濃度為0.8 mol/L，選擇不同的電擊轉(zhuǎn)化緩沖液:SMG、SG、MG、Gly，其余實驗條件與優(yōu)化前相同，如圖5所示。結(jié)果表明:使用SMG緩沖液作為電轉(zhuǎn)緩沖液時轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)4.5×106cfu/μg。

圖5 不同電擊轉(zhuǎn)化緩沖液對轉(zhuǎn)化率的影響

2.6 電擊時電壓的優(yōu)化

在OD600值為0.7時收集細(xì)胞用于感受態(tài)細(xì)胞的制備，將制備的感受態(tài)細(xì)胞用SMG緩沖液重懸，在電擊轉(zhuǎn)化步驟時加入80 ng的穿梭載體進(jìn)行電轉(zhuǎn)化;電擊完成后向電擊杯中加入1 mL回復(fù)培養(yǎng)基，其中的山梨醇濃度為0.8 mol/L。選擇不同的電壓進(jìn)行電轉(zhuǎn)化操作:12 kV/cm、15 kV/cm、18 kV/cm、21 kV/cm、24 kV/cm，其余實驗條件與優(yōu)化前相同。由圖5可知:在電壓為21 kv/cm時轉(zhuǎn)化率最高，為8.0×106cfu/μg。

圖6 不同電壓對轉(zhuǎn)化率的影響

3 結(jié)束語

當(dāng)細(xì)胞生長OD600值為0.7、質(zhì)粒DNA加量為80 ng、回復(fù)培養(yǎng)基山梨醇濃度為0.8mol/L、電轉(zhuǎn)緩沖液為SGM以及電場強(qiáng)度為21 kv/cm時，枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化率最高。經(jīng)實驗可知，其最高轉(zhuǎn)化率為8.0×106cfu/μg，比報道技術(shù)效率高4.71倍。該方法為枯草芽孢桿菌的基因工程育種、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)研究提供了參考。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Optimization of a Method about Electro-transformation in Bacillus Subtilis

ZHANG Shuang，XUE Zheng-lian，CHEN Huan，SU Yan-nan，WANG Zhou
(Institute of Biologic＆Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China)

This article provides a method of electro-transformation in Bacillus Subtilis.This method is to regulate cell osmotic pressure and solution composition by regulating cell culture and shock in the process of transformation medium，for improving the survival rate after cells in high electric field intensity of electric shock and achieving the goal that improve the transformation efficiency.The transformation rate is 5.0×105cfu/μg before optimizing.After optimizing，the transformation efficiency is up to 8×106cfu/μg，being 15 times higher than before optimization.It greatly promotes the conversion efficiency.

Bacillus subtilis;electro-transformation;transformation efficiency

Q785

A

1674-8425(2014)08-0060-04

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2014.08.013

2014-04-08

安徽省自然科學(xué)基金項目(11040606M81);安徽省高校自然科學(xué)基金項目(KJ2009A168)

張爽(1989—)，女，安徽宿州人，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究;通訊作者薛正蓮(1967—)，女，安徽巢湖人，碩士，教授，主要從事酶工程研究。

張爽，薛正蓮，陳環(huán)，等.一種電擊轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌方法的優(yōu)化［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2014 (8):60-63.

format:ZHANG Shuang，XUE Zheng-lian，CHEN Huan，et al.Optimization of a Method about Electro-transformation in Bacillus Subtilis［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(8):60-63.