劉永惠，常 靖,，薛陸軍，郭少賢,3，王 瑞，孫 燁，夏欣欣，李恩孝

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西西安 710061； 2. 西安市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，陜西西安 710001；3.中國(guó)人民解放軍第266醫(yī)院腫瘤科，河北承德 067000)

乳腺癌是多種因素、多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，某些癌基因、細(xì)胞因子等對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后影響十分顯著。癌基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前公認(rèn)的與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的因子，其對(duì)維持基因穩(wěn)定性和對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有著重要調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)代中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn),血瘀證是惡性腫瘤的一種常見(jiàn)類型，血瘀是導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要病理基礎(chǔ)[1]。近幾年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀藥物對(duì)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用[2]。我們應(yīng)用活血化瘀藥試圖通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)和活性，抑制腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖。本實(shí)驗(yàn)選取活血化瘀藥物麝香的活性物質(zhì)麝香酮(musk ketone)，檢測(cè)麝香酮對(duì)血瘀證裸鼠皮下移植瘤的VEGF表達(dá)是否存在影響，以探討麝香酮在抗癌方面的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、細(xì)胞系、主要試劑及儀器5周齡雌性裸小鼠60只，體重(20±1)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2007-0005)。飼料提供來(lái)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF環(huán)境下進(jìn)行。乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231s購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。麝香酮標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr(批號(hào)：90527CY)，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，VEGF一抗、VEGF一抗試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，VEGF二抗、VEGF二抗試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鹽酸腎上腺素(1 mL∶1 mg)購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司(批號(hào)：H31021062)。普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231s按常規(guī)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基中50 mL/L CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底80%～90%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，3～5 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3血瘀動(dòng)物模型的建立將40只雌性裸鼠隨機(jī)分為血瘀組(n=30)和空白組(n=10)?？瞻捉M連7 d皮下注射0.2 mL生理鹽水；血瘀組連續(xù)7 d皮下注射0.01%腎上腺素0.2 mL[3]。

1.4測(cè)定指標(biāo)與方法本實(shí)驗(yàn)采用眼球取血法，分別從血瘀組(n=10)和空白組(n=10)中留取血液樣本。取血后及時(shí)用肝素抗凝(20 IU/mL血液)，并由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科測(cè)定在切變率為1 S-1、10 S-1、50 S-1、200 S-1的全血黏度。

1.5接種與給藥將0.2 mL(1×107個(gè))人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231s細(xì)胞懸液注入于血瘀組中剩余的20只裸鼠背部的外上方皮下，并隨機(jī)分為血瘀荷瘤組(n=10)和麝香酮組(n=10)兩組。隨后對(duì)麝香酮組給予2 mg/(kg·d)麝香酮灌胃處理，血瘀荷瘤組給予生理鹽水灌胃作為對(duì)照，連續(xù)灌胃處理14 d。

1.6HE染色法組織切片后進(jìn)行HE染色。實(shí)驗(yàn)具體步驟：腫瘤組織石蠟切片厚度為5 μm，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次脫蠟，乙醇梯度水化；蘇木素染色，淡氨水(10 mL/L)分化，伊紅染色；乙醇梯度脫水；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性樹(shù)膠封片。

1.7免疫組化法檢測(cè)VEGF表達(dá)按常規(guī)處理待檢測(cè)的石蠟或冰凍組織切片或細(xì)胞爬片等樣本，依次在試劑1、試劑2、試劑3、試劑4中室溫孵育，PBS充分漂洗，完成后滴加顯色工作液顯色，最后復(fù)染，脫水透明，封片。

VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)：光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)為棕黃色顆粒的細(xì)胞定為陽(yáng)性染色細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[4]計(jì)數(shù)方法，在高倍鏡(×400)視野下對(duì)每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，讀取陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值。

免疫組織化學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞分為0～3四個(gè)級(jí)：無(wú)棕黃色顆粒為0，1%～10%定為1，11%～50%為2，51%以上定為3；染色強(qiáng)度分0～3級(jí)，陰性定為0，弱陽(yáng)性定為1，中度陽(yáng)性定為2，強(qiáng)陽(yáng)性定為3。這2項(xiàng)數(shù)值之和即為該片的免疫組化評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1兩組裸鼠血液流變學(xué)的比較對(duì)裸鼠進(jìn)行了血液流變學(xué)的檢測(cè)，結(jié)果表明，空白組與血瘀組比較，4個(gè)切變率下的血流變結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。提示兩組本實(shí)驗(yàn)血瘀動(dòng)物模型造模成功，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1兩組裸鼠血液流變學(xué)結(jié)果的比較

檢測(cè)指標(biāo)空白組(mPa.s)血瘀組(mPa.s)1S-129.47±7.2846.02±10.94#5S-19.66±2.7114.54±3.08#30S-14.21±1.506.11±3.46#200S-12.09±1.343.97±1.67#

與空白組比較，#P<0.05。

2.2大體形態(tài)學(xué)觀察、裸鼠體重及瘤體的變化從造模開(kāi)始，裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，飲食、飲水、排便正常，未有拒食，對(duì)外刺激反應(yīng)正常。種植瘤體后接種5 d后可見(jiàn)背部米粒大小腫塊形成，7 d后瘤達(dá)100 mm3左右，成瘤率100%。瘤體生長(zhǎng)于裸鼠外側(cè)背部皮下，色蒼白、質(zhì)硬、活動(dòng)性較差、表面光滑，裸鼠體重稍有降低，估計(jì)與腫瘤負(fù)荷大、消耗增加有關(guān)；解剖全部裸鼠未見(jiàn)明顯胸腔及腹腔臟轉(zhuǎn)移灶。實(shí)驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)全部入組裸鼠進(jìn)行了體重測(cè)量。腫瘤體積(mm3)=1/2×腫瘤最長(zhǎng)徑×(腫瘤最短徑)2。造模裸鼠腫瘤體積見(jiàn)表2。比較血瘀荷瘤組與麝香酮兩組，結(jié)果差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示麝香酮可抑制瘤體生長(zhǎng)。

表2兩組裸鼠體質(zhì)量及瘤體體積的比較

用藥后天數(shù)(d)血瘀荷瘤組(mg)麝香酮組(mg)血瘀荷瘤組(mm3)麝香酮組(mm3)021.04±1.9820.67±2.110.059±0.0110.061±0.010320.65±2.3220.50±1.670.143±0.0160.084±0.011619.92±1.7620.32±1.52*0.496±0.0920.179±0.013△918.37±1.7320.11±1.92*0.735±0.1060.233±0.112△1217.52±0.9320.09±0.98*1.261±0.1020.498±0.072△1516.734±1.9820.12±1.87*1.261±0.1020.689±0.69△

與血瘀荷瘤組比較，*P<0.05，△P<0.05。

2.3兩組抑瘤率的比較計(jì)算抑瘤率：抑瘤率(%)=[模型組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重]/模型組瘤重×100%。對(duì)造模裸鼠抑瘤率進(jìn)行換算，比較以下兩組抑瘤率。結(jié)果顯示，血瘀加瘤組和麝香酮組用藥14 d后的瘤重分別為：(1.452 2±0.363 9)g、(0.868 7±0.144 7)g，抑瘤率分別為-%和40.18%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4免疫組織化學(xué)VEGF表達(dá)及分析免疫組化結(jié)果顯示，在血瘀荷瘤組中，VEGF在瘤體中呈高表達(dá)，而在麝香酮組中，瘤體中VEGF的表達(dá)顯著降低。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，麝香酮組瘤體VEGF評(píng)分(2.90±0.25)顯著低于血瘀荷瘤組(5.08±0.35)，(P<0.05，圖1)。

圖1兩組裸鼠腫瘤的VEGF免疫組化染色

Fig.1 Immunohistochemical staining of VEGF in the tumor of the two groups of nude mice (×400)

A：血瘀荷瘤組；B：麝香酮組；C：兩組VEGF評(píng)分的比較。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，現(xiàn)每年全球新增乳腺癌的患者已超過(guò)100萬(wàn)[5]，在我國(guó)乳腺癌已居?jì)D女惡性腫瘤第1位[6]。目前治療乳腺癌的手術(shù)、化療存在一定的局限性且副作用較大，如果配合生物靶向治療有可能推動(dòng)綜合療法向更高的層次發(fā)展[7-8]。

乳腺癌屬于中醫(yī)的“乳石癰”、“奶巖”等范疇。辨證分為肝郁痰凝證、沖任失調(diào)證、正虛毒熾證、氣血兩虧證這四種證型。但在臨床上，依據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)理論，結(jié)合乳腺癌的特點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤多以血瘀證特征為多見(jiàn)，血瘀與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系極為密切。臨床及實(shí)驗(yàn)室已證實(shí)腫瘤患者的血小板功能異?；罨?；血小板聚集、黏附功能呈現(xiàn)亢進(jìn)狀態(tài)[9]，即血液的濃、黏、聚、凝狀態(tài),認(rèn)為這種現(xiàn)象類似于中醫(yī)所闡述的“血瘀證”。當(dāng)血液處于血瘀證的高凝狀態(tài)，血液流動(dòng)或減緩，或滯而不暢，甚或瘀阻。這樣游離在血管中的腫瘤細(xì)胞就有條件從血管壁的湍流區(qū)貼附于管壁，使其得以著床，繼而腫瘤細(xì)胞大量增殖再通過(guò)血液或淋巴系統(tǒng)進(jìn)行散播，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的形成。因此，可以認(rèn)為血瘀證存在于癌癥的各個(gè)階段，它是腫瘤轉(zhuǎn)移的條件和結(jié)果。這就相當(dāng)于種子與土壤的關(guān)系。血液高度凝聚的血瘀狀態(tài)為大量增殖、積聚的腫瘤細(xì)胞提供良好的散播途徑。血瘀是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要病理基礎(chǔ)。

VEGF是刺激腫瘤血管生成最重要和作用最強(qiáng)的因子[10]。有研究顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后與VEGF關(guān)系密切[11-12]。LINDERHOLM等[13-14]認(rèn)為，VEGF在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其表達(dá)對(duì)乳腺癌病人預(yù)后的判斷有重要意義。故可通過(guò)檢測(cè)乳腺癌組織中VEGF以間接通過(guò)觀測(cè)乳腺癌病理進(jìn)程和預(yù)后。

腫瘤生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要依靠血液。腫瘤血管形成是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。 若抑制腫瘤血管生成，阻斷其賴以生存的“關(guān)卡”，就可以切斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)供給的途徑，腫瘤就會(huì)處于靜止休眠狀態(tài)[15]。所以血管已成為腫瘤治療新的靶點(diǎn)，這將是腫瘤治療的重要策略[16-17]?，F(xiàn)在一些研究人員嘗試通過(guò)使用一些化療藥物抑制VEGF表達(dá)，以期達(dá)到抗腫瘤作用[18-19]。因此，降低VEGF的異常表達(dá)是降低乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

麝香作為藥物已有兩千多年的歷史，其性辛溫，氣味芳香、善走竄，性味辛溫，歸心脾二經(jīng)，有醒腦開(kāi)竅、活血化瘀、消腫止痛之功效。清代許克昌在《外科證治全書(shū)》中已對(duì)乳巖的治療預(yù)后有具體的闡述。現(xiàn)代研究證明，麝香有興奮中樞系統(tǒng)，抗缺氧、強(qiáng)心、抗炎，抑制人體腫瘤細(xì)胞及提高免疫力等作用。藥理學(xué)研究顯示，麝香的提取成分麝香酮亦稱3-甲基環(huán)十五烷酮(C16H30O)，是麝香的重要成分部分和主要生理活性物質(zhì)。我們選用活血化瘀藥物麝香的提取成分麝香酮治療腫瘤，探討麝香酮、血瘀證和乳腺癌相關(guān)因子之間聯(lián)系，為乳腺癌的治療提供新的方法。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，不同組中的裸鼠體質(zhì)量、瘤體體積、腫塊質(zhì)量與對(duì)照組的差異都有明顯差異。經(jīng)麝香酮藥物的干預(yù)后，裸鼠皮毛較光滑，行動(dòng)相對(duì)敏捷，飲食、排便較規(guī)律，各臟器未見(jiàn)明顯改變，麝香酮的抑瘤率達(dá)到40.18%，且麝香酮抑制VEGF的表達(dá)。這初步說(shuō)明通過(guò)麝香酮可下調(diào)乳腺癌細(xì)胞的VEGF的表達(dá)，阻止新生血管生成。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們初步證實(shí)了麝香酮的部分抑瘤作用，它通過(guò)阻斷腫瘤所需的血管系統(tǒng)形成、降低血管通透性，消除細(xì)胞賴以生存的基礎(chǔ)，以發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅曉琴，徐詠梅，唐勇. 從腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子探討非小細(xì)胞肺癌氣虛血瘀證的病理基礎(chǔ)[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2009, 29(10):886-887.

[2] 張國(guó)榮，齊元富. 活血化瘀法治療惡性腫瘤作用機(jī)制探討[J]. 山西中醫(yī)，2010，26(5):60-62.

[3] 和嵐，蔣文躍，毛騰敏. 注射腎上腺素模擬“氣滯”復(fù)制急、慢性血瘀模型初探[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，24(3)：244-245.

[4] NICOLELLA D, MAIONE P, GRIDELLI C. Targeted therapies: focus on a new strategy for gastrointestinal tumors[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2003, 47(3):261-271.

[5] WESTEEL V, DEPIERRE A. Combined modality treatment of breast cancer[J]. Am J Respir Med, 2003, 12(2):477-490.

[6] 李國(guó)利，劉惠，程建. 乳腺癌鈣化點(diǎn)的計(jì)算機(jī)輔助診斷[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)志, 2011, 28(1):171-173.

[7] EPISTOLATO MC, DISCIGLIO V, LIVIDE G, et al. p53 Ar972Pro and MDM2 309 SNPs in hereditary retinoblastoma[J]. J Hum Genet, 2011, 56(9):685-686.

[8] 楊寧，劉艷. 乳腺癌內(nèi)科綜合治療的現(xiàn)狀[J]. 黑龍江醫(yī)學(xué)，2010，34(10):749-750.

[9] 劉永惠，楊曉峰，周冬枝，等. 腫瘤轉(zhuǎn)移與血瘀證的臨床研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002, 8(4):50-58.

[10]GINSBERG MD. Models of cerebral hernia in the rodent[M]. Cerebralischeia Berlin: Springer Vedag, 1991: 2.

[11] 陳文塏，黃玉芳. 麝香“歸經(jīng)入腦”的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中西醫(yī)結(jié)合報(bào), 2004, 2(4):288-291.

[12] Newton. Phage peptide display[J]. Handb Exp Pharmacol, 2008, (185 Pt 2):145-163.

[13]WANG PL, XU WG, DU Y, et al. Primary study of anti-angiogenic effect on human breast cancer metastasis [J]. Clin Med China, 2006, 22(1):26-28.

[14] 李鳳和. 細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤轉(zhuǎn)移[J]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2000, 14(3):206-208.

[15] 朱秀媛. 人工麝香的藥用潛力[J]. 百科知識(shí)，1995，(7)：11.

[16] 石進(jìn)峰，張博愛(ài). 麝香提取物對(duì)大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2010, 30(6):626-628.

[17] LEMAY R. Insulin administration protects neurologic function in cerebral ischemia in rats[J]. Stroke，1998, 19:11-14.

[18] 柳光字，邵志敏，沈鎮(zhèn)宙. 紫杉醇誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制[J].中國(guó)癌癥雜志, 2000, 10(1):93-96.

[19] SHARIFI-SISTANI N, ZARTAB H, BABAKOOHI S, et al. Immunohistochemical comparison of the expression of p53 and MDM2 proteins in arneloblastonma and keratocystic odontogenie tumors[J]. J Craniofac Surg, 2011, 22(5):1652-1656.