曹　峰, 許　霞

(1.萊蕪市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東萊蕪 271100;2.萊蕪市第一中學(xué),山東萊蕪 271100)

萊蕪姜酒是以全國(guó)名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品“萊蕪生姜”為主要原料,配以大棗、枸杞等輔料,經(jīng)酶解、發(fā)酵、蒸餾、萃取、精濾、調(diào)配等工藝生產(chǎn)的一種具有濃郁姜香的低度保健酒[1-2],具有抗菌抑菌、抗老防衰、抗癌防癌之功效[3].

紐甜(neotame)是新型的二肽類強(qiáng)力甜味劑,系阿斯巴甜的衍生物[4],是一種安全可靠、高甜度(甜度為蔗糖的8 000～13 000倍[5])、低熱量、無(wú)致齲性、口味較接近蔗糖的非營(yíng)養(yǎng)型甜味劑[6],GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定紐甜可在各類食品中按生產(chǎn)需要使用.酒中適量添加紐甜可改善酒質(zhì),協(xié)調(diào)平衡酒的香氣、口感,降低固形物含量,使酒的風(fēng)味更加醇厚[7].

目前食品中紐甜的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、流動(dòng)注射分析法等[8-11],其中高效液相色譜法是最常用的測(cè)定方法.國(guó)標(biāo)方法[12]中運(yùn)用梯度洗脫的方法能夠較好地對(duì)復(fù)雜樣品體系中紐甜組分與干擾組分進(jìn)行分離測(cè)定,但是此方法分析時(shí)間長(zhǎng),在樣品處理過(guò)程中需經(jīng)過(guò)提取、固相萃取等步驟,操作繁瑣,不利于日常檢測(cè).盡管已有相關(guān)研究[7-8,13-16]對(duì)酒類樣品處理過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化,利用加熱除去乙醇后用純水定容直接上機(jī)測(cè)定,但由于姜酒營(yíng)養(yǎng)豐富,酒體中含有較多的蛋白質(zhì)等大分子成分[17],如不加處理,極易堵塞色譜柱,造成柱效下降.本文參照相關(guān)研究[18],在樣品處理過(guò)程中利用乙腈沉淀酒體中的蛋白,較好地解決了這一問(wèn)題,降低了對(duì)色譜柱的損害,并建立了一種采用等度洗脫,可簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確測(cè)定萊蕪姜酒中紐甜含量的高效液相色譜法.

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

紐甜標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%),美國(guó) Nutra-Sweet公司;乙腈(色譜純)、磷酸氫二銨(優(yōu)級(jí)純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;萊蕪姜酒購(gòu)于萊蕪銀座商城.

1.2　儀器與設(shè)備

Alliance e2695型高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司;2489型紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司;Symmertry Shield RP18型色譜柱(4.6 mm×150 mm,5.0μm),美國(guó)Waters公司;UV-9000S型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司;TGL-20M型臺(tái)式高速離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司.

1.3　方法

1.3.1色譜條件

流動(dòng)相為乙腈與0.02 mol/L磷酸氫二銨(體積比為30∶70),流速為1 mL/min,進(jìn)樣量10μL,柱溫30℃,紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)218 nm.以保留時(shí)間定性,峰面積定量.

1.3.2樣品處理

稱取10 g姜酒樣品(精確至0.001 g)加熱除乙醇后置于離心管中,加入40 mL乙腈,渦旋混勻3 min,于10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min.取上清液5 mL置于10 mL容量瓶中,用純水定容,混勻,經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾,濾液待測(cè).

2　結(jié)果與分析

2.1　色譜條件的優(yōu)化

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)紐甜標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)190～350 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1　紐甜紫外可見(jiàn)分光光譜Fig.1　Absorption spectrum of neotame

由圖1可以看出,紐甜在波長(zhǎng)218 nm處有最大吸收,由于在最大吸收波長(zhǎng)條件下檢測(cè)干擾少,靈敏度高,因此本研究選擇218 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).

2.1.2流動(dòng)相及洗脫條件的選擇

參照文獻(xiàn)[7,14-16],本研究同時(shí)對(duì)比了甲醇與0.02 mol/L乙酸銨、乙腈-離子對(duì)緩沖液(辛烷磺酸鈉)、乙腈與0.02 mol/L磷酸氫二銨、乙腈與0.02 mol/L硫酸銨4種流動(dòng)相體系,結(jié)果表明乙腈與0.02 mol/L磷酸氫二銨緩沖液體系的分離效果最佳.

將乙腈與0.02 mol/L磷酸氫二銨在體積比分別為10∶90,20∶80,25∶75 及30∶70 的條件下對(duì)紐甜標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行等度洗脫(檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm,柱溫30℃),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者體積比為10∶90及20∶80時(shí)紐甜30 min內(nèi)未出峰,體積比在25∶75時(shí)紐甜出峰時(shí)間在16 min左右,但體積比為30∶70時(shí)紐甜能在7 min內(nèi)出峰,且峰形良好,為提高檢測(cè)效率,本研究選擇乙腈與0.02 mol/L磷酸氫二銨體積比為30∶70.

2.1.3柱溫及色譜條件的確定

在1.2的條件下,本研究分別考察了25,30,35,40℃ 4個(gè)溫度條件下紐甜的分離情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)在此溫度范圍內(nèi)柱溫對(duì)紐甜色譜峰峰形及保留時(shí)間的影響均不顯著,本研究選擇柱溫為30℃.

通過(guò)實(shí)驗(yàn),最終確定色譜條件:流動(dòng)相為乙腈與0.02 mol/L磷酸氫二銨(體積比為30∶70),流速為1 mL/min,進(jìn)樣量10μL,柱溫為30℃,紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)218 nm.在此條件下,紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜圖如圖2,萊蕪姜酒樣品色譜圖見(jiàn)圖3.

圖2　紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2　Chromatogram of neotame standard solution

圖3　萊蕪姜酒樣品色譜圖Fig.3　Chromatogram of Laiwu Ginger-liquor

2.2　紐甜的線性和檢出限

在優(yōu)化的色譜條件下,對(duì)質(zhì)量濃度在5.0～100.0 mg/L的紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示在此范圍內(nèi)濃度和峰面積之間有良好的線性關(guān)系.紐甜的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4,回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R)、檢出限(在色譜條件下,以3倍信噪比為檢出限)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表1.

圖4　紐甜的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of neotame

2.3　檢測(cè)方法精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取萊蕪姜酒樣品按1.3方法處理后,在優(yōu)化的色譜條件下對(duì)姜酒樣品平行測(cè)定6次,結(jié)果見(jiàn)表2.

2.4　樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

稱取適量姜酒樣品,按線性范圍加入一定量的紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按照1.3中的方法處理后,進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),測(cè)定6次,結(jié)果見(jiàn)表3.

從表3中結(jié)果可以看出,在優(yōu)化的分析條件下姜酒中紐甜的平均加標(biāo)回收率為98.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.95%,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,完全滿足日常檢測(cè)要求.

表1　回歸曲線的基本參數(shù)及檢出限Tab.1　Fundamental parameters of regression equation and detection limit

表2　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2　Results of the precision test

表3　加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Tab.3　Recovery test

3　結(jié) 論

本方法以乙腈與0.02 mol/L磷酸氫二銨(體積比為30∶70)為流動(dòng)相,紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)218 nm,一次進(jìn)樣,可以在8 min內(nèi)完成萊蕪姜酒中紐甜的分析,紐甜在質(zhì)量濃度在5.0～100.0 mg/L有良好的線性關(guān)系(R=0.9999),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%(n=6),平均加標(biāo)回收率為98.7%,檢出限為2.5×10-4g/kg.研究結(jié)果表明,該方法分離效果好、快速簡(jiǎn)便、精密度好,適合檢測(cè)機(jī)構(gòu)日常檢測(cè).