劉鳳嬌,李順興, ,鄭鳳英, ,黃旭光, ,李艷彩, ,宋 鈺,吳 衍,陳妹貞

(1.南師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,福建 漳州 363000;2.現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 漳州 363000)

目前,海洋石油烴污染越來(lái)越嚴(yán)重,污染源主要包括海上作業(yè)、陸地、大氣的人為源排放以及自然界排放。石油泄漏事故在世界各地頻發(fā),據(jù)估算,全球每年泄漏到大海的石油總量超過(guò)1 300 000 t[1-2]。石油烴會(huì)通過(guò)海洋食物鏈富集,生物體,特別是海洋食品,累積濃度超過(guò)健康標(biāo)準(zhǔn),給人類帶來(lái)健康威脅[3-4]。海洋浮游植物生長(zhǎng)受石油烴(如0號(hào)柴油、萘、1,2,4-三甲苯、氧甲酚、鄰甲苯胺)的影響[5-6]。

土霉素(OTC)是四環(huán)素類抗生素,成本低,效力高,廣泛用于海水養(yǎng)殖中細(xì)菌性疾病的治療[7-9]?？股貎H 20%～30%被魚類吸收,70%～80%進(jìn)入水環(huán)境[10-11]。鏈霉素影響淡水浮游藻類小球藻(Chlorella vulgaris)和銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)生長(zhǎng)已被證實(shí)[12]。

河口和近岸海域富營(yíng)養(yǎng)化(即氮和磷濃度超標(biāo))已成為嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題[13-14]。海洋生物吸收氮磷遵循Redifield比例 [即n (N)︰n (P)= 16][15]。富營(yíng)養(yǎng)化顯著影響海洋浮游生物的生長(zhǎng)、細(xì)胞形狀、細(xì)胞干質(zhì)量和生化組成 (如碳水化合物、蛋白質(zhì)、葉綠素和堿性功能團(tuán))[13,16]。丙二醛(MDA)具細(xì)胞毒性,是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一,也是自由基產(chǎn)生以及組織損傷程度的指示物[17-18]。超氧化物歧化酶(SOD)是含金屬元素的活性蛋白酶,對(duì)于活性氧(含超氧陰離子O2?、過(guò)氧化氫H2O2、羥基自由基·OH、單線性氧1O2)的歧化作用起催化作用,可為需氧有機(jī)體的生存提供保護(hù)[18-19]。 氮、磷、石油烴及抗生素等近海常見(jiàn)污染物對(duì)自由基的形成、海洋藻體抗自由基機(jī)制的研究,迄今未見(jiàn)報(bào)道。

威氏海鏈藻是海洋硅藻的模式種之一、優(yōu)良的開(kāi)口餌料[20]。作者對(duì)比研究了硝酸鹽、土霉素和 0號(hào)柴油濃度對(duì)威氏海鏈藻生長(zhǎng)及生化組成(葉綠素a、蛋白質(zhì)、MDA含量和SOD活性)的影響,為近海污染物對(duì)海洋浮游植物的毒性評(píng)價(jià)研究提供前期背景數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-75602PCS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司);雙人單面超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);SPX-300 IC 微電腦人工氣候箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);DM LB2生物顯威鏡(德國(guó),Leica儀器公司);蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器 Yz2515x(保定蘭格恒流泵有限公司);Milli-Q凈水器(美國(guó),Millipore公司);布萊森-102C超聲波破碎儀(中國(guó)布萊森超聲波公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

硝酸鉀配制N標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 mmol/L);磷酸二氫鉀配制 P標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(360 mmol/L);氯化銨溶液(4.67 mol/L);No.0柴油儲(chǔ)備液100 mg/L(No.0柴油,購(gòu)于中國(guó)石化加油站);土霉素(0.25 g/片,江西國(guó)藥有限責(zé)任公司);實(shí)驗(yàn)用去離子水由 Milli-Q離子交換凈水系統(tǒng)處理(電阻率 18 M?cm)。溶液均用去離子水配制。

1.3 藻類培養(yǎng)條件

海水取自東海外海,用0.2 μm濾膜過(guò)濾,于4℃下保存 6個(gè)月。用銅鎘柱還原法[21]和抗壞血酸還原磷鉬藍(lán)法[22]測(cè)海水中氮、磷含量,平行測(cè)定3次,得海水中氮、磷的背景值分別為1.2、0.2 μmol/L。

威氏海鏈藻來(lái)自廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,保存于海水中(添加 Na2SiO3·H2O 保持 Si濃度為21.1 mmol/L)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中海水P濃度保持在1.0 μmol/L,c(N)分別為 8.0,16.0,32.0,64.0 μmol/L、c(WAFs)分別為 0.1,0.5,1.0,5.0 mg/L、c(OTC)分別為 1.0,3.0,5.0,10.0 mg/L。光照強(qiáng)度 140 μmol/(m2s);光暗比14 h︰10 h;水溫19℃。適當(dāng)攪拌(100 r/min)海藻懸浮液,模擬海水流動(dòng),同時(shí)減少WAFs和OTC在容器壁上的吸附。生物平行樣重復(fù)測(cè)定 3次。每24 h監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中 N、P濃度,適時(shí)補(bǔ)充 KNO3和KH2PO4,保持氮磷的濃度和比值不變。

1.4 參數(shù)測(cè)定方法

顯微鏡計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)后海藻細(xì)胞的藻密度。取藻液100 mL,用0.2 μm濾膜過(guò)濾,在暗處冷凍條件下用5 mL 90%丙酮萃取10 h,離心(4 000 r/min)10 min。取上清液,分別在 λ663、λ645、λ630、λ750處測(cè)定吸光值,用 λ663、λ645、λ630的吸光值減去 λ750的吸光值,以校正微粒濁度空白的吸光度,將所得數(shù)據(jù)參照文獻(xiàn)[23]計(jì)算葉綠素a含量。

取藻液800 mL,用0.2 μm濾膜過(guò)濾,于藻體中加入5 mL磷酸緩沖液(預(yù)冷,0.1 mol/L,pH=7.8),在冰浴中用超聲波破碎儀破碎 30 min,勻漿液離心(10 000 r/min)10 min,上清液為粗酶液,采用氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原反應(yīng)法[24]測(cè)SOD活性,硫代巴比妥酸(TBA)法[25]測(cè)定MDA含量,考馬斯亮藍(lán)法[26]測(cè)蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 近海污染物對(duì)威氏海鏈藻生長(zhǎng)的影響

細(xì)胞增長(zhǎng)率取決于細(xì)胞分裂率。以東海外海海水(c(N)= 1.2 μmol/L,c(P)=0.2 μmol/L)為對(duì)照組,據(jù)圖1～圖3所示,N、OTC和WAFs均對(duì)威氏海鏈藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的影響。添加 OTC,在整個(gè)生長(zhǎng)周期,藻細(xì)胞密度均高于對(duì)照組,即起促進(jìn)作用;添加N,在指數(shù)期,藻的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于對(duì)照組,N起促進(jìn)效應(yīng),在穩(wěn)定期,卻呈反作用;添加 WAFs,在適應(yīng)期,有利于藻生長(zhǎng),指數(shù)期之后,抑制藻生長(zhǎng)。當(dāng)c(N)、c(OTC)、c(WAFs)分別為 8.0～32.0 μmol/L,1.0～5.0 mg/L,0.1～0.5 mg/L時(shí),細(xì)胞密度隨濃度增加而增加;當(dāng) c(N)、c(OTC)、c(WAFs)分別為 64.0 μmol/L、10.0 mg/L、5.0 mg/L時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制。.

圖1 硝酸鹽添加對(duì)威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響Fig.1 Influence of N addition on the cell density of T.weissflogii

圖2 0號(hào)柴油分散液添加對(duì)威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響Fig.2 Influence of water accommodated fractions of No.0 diesel oil on the cell density of T.weissflogii c(N)=1.2 μmol/L,c( P)=0.2 μmol/L

圖3 土霉素添加對(duì)威氏海鏈藻細(xì)胞密度的影響Fig.3 Influence of OTC addition on the cell density of T.weissflogii (n (N)︰n (P)=1.2︰0.2)

添加 WAFs,細(xì)胞密度最高值與對(duì)照組相比明顯減少,當(dāng)劑量為5.0 mg/L時(shí),細(xì)胞密度僅為對(duì)照組的0.3倍。OTC能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng),濃度5.0 mg/L作用最大,是對(duì)照組的 1.4倍。3種污染物對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)毒性影響程度為: WAFs＞N＞OTC,即3者對(duì)紡錘體的形成影響不同。3種污染物均使藻的生長(zhǎng)周期縮短,除5.0 mg/L WAFs縮短5 d,其他條件下縮短 2～3 d。

2.2 近海污染物對(duì)葉綠素a含量的影響

葉綠素是浮游植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì),葉綠素 a含量可用來(lái)估算初級(jí)生產(chǎn)力,也是浮游植物生命力的重要表征。葉綠素a是一種色素-蛋白質(zhì)復(fù)合體,氮是其合成的主要合成原料,當(dāng)培養(yǎng)介質(zhì)中N缺乏,必然限制藻體中葉綠素a的合成[15]。實(shí)驗(yàn)探究不同濃度N、OTC和WAFs對(duì)葉綠素a 含量的影響如圖4所示。

圖4 硝酸鹽、土霉素及0號(hào)柴油分散液添加對(duì)葉綠素a含量的影響Fig.4 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of chlorophyll a

當(dāng)c(N)低于8.0 μmol/L,即氮相對(duì)不足,葉綠素a合成受限,葉綠素a 含量最低;當(dāng)c(N)為32.0 μmol/L時(shí),威氏海鏈藻處于最佳生長(zhǎng)狀況,葉綠素 a 含量最高;當(dāng)c(N)高于32.0 μmol/L時(shí),威氏海鏈藻生長(zhǎng)受抑制,對(duì)葉綠素合成不利。上述影響與營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生化組成的影響類似[18]。c(OTC)為1.0～5.0 mg/L能促進(jìn)藻生長(zhǎng),但濃度為10.0 mg/L抑制藻生長(zhǎng),從而影響藻體中葉綠素a合成。浮游植物能降解石油烴,通過(guò)同化作用將 0.1～1.0 mg/L的WAFs做為營(yíng)養(yǎng)源,促進(jìn)自身生長(zhǎng),但石油烴濃度過(guò)大(5.0 mg/L),影響光合作用和呼吸作用,抑制葉綠素a合成。

3種污染物對(duì)葉綠素 a合成影響程度為 N＞OTC＞W(wǎng)AFs,此結(jié)果證明 N是葉綠素合成的主要限制因素之一、葉綠素合成與藻的生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。

2.3 近海污染物對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響

N是生理過(guò)程的主要參與者,對(duì)蛋白質(zhì)積累和合成起關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)主要是N同化作用產(chǎn)物,其濃度可作為新陳代謝能力和能源供應(yīng)條件的指示物。硝酸還原酶是NO3-N轉(zhuǎn)為NH4+N過(guò)程中的速率控制酶[27]。谷氨酰胺合成酶是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶,可增強(qiáng)N活性,有利于同化作用,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。

圖5所示,c(N)=16.0 μmol/L時(shí),藻生長(zhǎng)狀況最佳,蛋白質(zhì)含量最高;c(N)＜16.0 μmol/L 時(shí),藻細(xì)胞密度增幅較小且提前進(jìn)入衰亡期,N成為限制因子,沒(méi)有足夠 N供蛋白質(zhì)合成之用,藻體中硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性降低,N吸收和同化效率降低;在c(N)＞16.0 μmol/L時(shí),隨著N濃度增加蛋白質(zhì)合成受抑制,可能是 N過(guò)量誘發(fā)羥基自由基過(guò)量,抑制硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性[27]。當(dāng)c(OTC)、c(WAFs)分別為 1.0～3.0 mg/L、0.1～1.0 mg/L 時(shí),蛋白質(zhì)含量隨其濃度增加而增加;當(dāng)c(OTC)＞3.0 mg/L、c(WAFs)＞1.0 mg/L時(shí),蛋白質(zhì)含量隨之降低,這歸因于OTC和WAFs含量過(guò)高致使細(xì)胞提前進(jìn)入衰亡期,硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性下降。

圖5 硝酸鹽、土霉素及0號(hào)柴油分散液添加對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of protein

3種污染物對(duì)蛋白質(zhì)合成的影響程度為N＞W(wǎng)AFs＞OTC,因?yàn)镹濃度控制著蛋白質(zhì)合成和藻的生長(zhǎng)狀態(tài),過(guò)量的 N和 WAFs可促進(jìn)羥基自由基的產(chǎn)生[27],從而影響硝酸還原酶及谷氨酰胺合成酶活性而使蛋白質(zhì)合成受抑制。

2.4 近海污染物對(duì)SOD活性的影響

浮游植物可通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)(如SOD、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)的協(xié)同作用保護(hù)機(jī)體[26],過(guò)量活性氧類物質(zhì)會(huì)破壞脂質(zhì)膜、蛋白質(zhì)、色素、核酸,致生產(chǎn)力嚴(yán)重下降,甚至使之死亡[24]。SOD活性與活性氧物質(zhì)數(shù)量有關(guān)。營(yíng)養(yǎng)鹽N的光解作用和海洋浮游植物的光化學(xué)反應(yīng)均會(huì)產(chǎn)生·OH[29],藻細(xì)胞的生化組成會(huì)影響其光化學(xué)活性,因此,SOD活性受N、OTC和WAFs的影響,具體情況見(jiàn)圖6。

圖6 硝酸鹽、土霉素及0號(hào)柴油分散液添加對(duì)SOD酶活性的影響Fig.6 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the activity of SOD

當(dāng)c(N)低于32.0 μmol/L時(shí),N濃度較低,藻生長(zhǎng)狀況較差,藻細(xì)胞抗氧化能力較弱,故 SOD活性較低;當(dāng) c(N)為 32.0 μmol/L時(shí),藻生長(zhǎng)狀況最佳,抗氧化能力增強(qiáng),SOD活性最高;當(dāng)c(N)超過(guò)32.0 μmol/L時(shí),N 的光解作用誘發(fā)產(chǎn)生大量·OH,抑制 SOD 活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明海水中·OH的產(chǎn)生受N影響[28,30]。SOD 活性與藻類生長(zhǎng)狀況密切相關(guān),當(dāng) c(OTC)和c(WAFs)分別為 1.0～5.0 mg/L 和 0.1～0.5 mg/L 時(shí),SOD 酶活性隨濃度增大而逐漸增加;當(dāng) c(OTC)和c(WAFs)分別超過(guò)3.0 mg/L和0.5 mg/L時(shí),SOD活性隨濃度增大而降低,說(shuō)明藻細(xì)胞進(jìn)入衰老期,抗氧化能力減弱。

3種污染物對(duì)藻細(xì)胞抗氧化能力(即 SOD活性)的影響程度為: WAFs＞N＞OTC,與對(duì)藻生長(zhǎng)(即藻細(xì)胞密度)的影響一致。

2.5 近海污染物對(duì)MDA含量的影響

不同濃度N、OTC和WAFs對(duì)MDA含量的影響如圖7。N、OTC和WAFs的毒性效應(yīng)可能源自過(guò)量自由基的危害。N、OTC和 WAFs可促進(jìn) O2?、H2O2、·OH和1O2生成[3,12,28],致機(jī)體受到多種損害。

圖7 硝酸鹽、土霉素及0號(hào)柴油分散液添加對(duì)MDA含量的影響Fig.7 Influence of N,OTC,and WAFs addition on the content of MDA

當(dāng)c(N)= 8.0 μmol/L時(shí),葉綠素和蛋白質(zhì)合成受限,活性氧過(guò)量積累,致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加強(qiáng),MDA含量最大;當(dāng) c(N)= 32.0 μmol/L時(shí),藻處最佳生長(zhǎng)狀況,生命力最強(qiáng),脂質(zhì)過(guò)氧化程度低,MDA濃度最低。當(dāng) c(OTC)和c(WAFs)分別為1.0～5.0 mg/L和0.1～0.5 mg/L時(shí),可促進(jìn)藻細(xì)胞新陳代謝、葉綠素及蛋白質(zhì)合成,可減少脂質(zhì)過(guò)氧化,MDA含量隨之降低;當(dāng) c(N)＞32.0 μmol/L,c(OTC)和 c(WAFs)分別為10.0 mg/L和0.5 mg/L時(shí),脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng),使得藻細(xì)胞提前進(jìn)入衰亡期,MDA含量增加。

3種污染物對(duì)藻細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化(即MDA含量)的影響程度為OTC?N ＞W(wǎng)AFs.

3 結(jié)論

當(dāng) N、OTC、WAFs濃度分別為 8.0～32.0 μmol/L,1.0～5.0 mg/L,0.1～0.5 mg/L時(shí),威氏海鏈藻的細(xì)胞濃度、SOD活性、葉綠素a和蛋白質(zhì)含量隨之增加而增加,MDA濃度隨之增大而減少;當(dāng)N、OTC、WAFs濃度分別大于32.0 μmol/L,5.0 mg/ L和0.5 mg/L時(shí),影響趨勢(shì)與上述情況相反,即藻生長(zhǎng)及SOD活性受抑制,葉綠素和蛋白質(zhì)含量降低,MDA濃度增加。

氮營(yíng)養(yǎng)鹽、抗生素、石油烴對(duì)藻生長(zhǎng)(即藻細(xì)胞密度)、葉綠素a合成、蛋白質(zhì)生成、藻細(xì)胞抗氧化能力(即超氧化物歧化酶活性)、脂質(zhì)過(guò)氧化(即丙二醛含量)的影響程度分別為 WAFs＞N＞OTC、N＞OTC＞W(wǎng)AFs、N＞W(wǎng)AFs＞OTC、WAFs＞N＞OTC、OTC?N＞W(wǎng)AFs。影響程度的差異,揭示近海各污染物的毒性作用機(jī)制及靶位不同。

氮營(yíng)養(yǎng)鹽、抗生素、石油烴污染影響海洋浮游植物的生長(zhǎng)和生化組成,而海洋浮游植物是海洋的初級(jí)生產(chǎn)力,故海洋的食物鏈穩(wěn)定和食物鏈中能量的傳遞會(huì)受近海污染物影響。

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