李志紅，Qiming Jane Wang

1 三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002

2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

蛋白激酶D1催化結構域在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)內的表達、純化和活性測定

李志紅1,2，Qiming Jane Wang2

1 三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002

2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

蛋白激酶D (Protein kinase D, PKD) 是一種新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol, DAG) 受體，參與細胞內多種生理生化過程。為獲得高純度的PKD1的催化結構域 (PKD1-cat)用于晶體學結構的研究，將帶有GST標簽的PKD1-cat基因克隆到桿狀病毒轉移載體pFastBac1中，構建了重組質粒。將重組質粒轉化到含穿梭載體Bacmid的DH10Bac感受態(tài)細胞中，轉座后獲得了含目的基因GST-PKD1-cat的重組Bacmid。重組Bacmid DNA轉染Sf9昆蟲細胞后，獲得重組桿狀病毒并擴毒。將毒種以5 PFU/cell的感染復數(shù)感染懸浮培養(yǎng)的T.ni昆蟲細胞，SDS-PAGE和Western blotting檢測表達產(chǎn)物。結果顯示，表達產(chǎn)物在分子量約68 kDa處有一特異條帶可與GST單克隆抗體發(fā)生反應。經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析純化和 PreScission Protease 切除GST標簽后，得到了純度很高的分子量約42 kDa的目的蛋白PKD1-cat。體外PKD激酶活性實驗結果顯示，隨著PKD1-cat濃度的增加，激酶活性增高。這些結果顯示截短的重組PKD1-cat有很高的催化活性和純度，為采用核磁共振或晶體學方法解析PKD1-cat的三維結構奠定了基礎。

蛋白激酶D，催化結構域，昆蟲細胞，桿狀病毒表達系統(tǒng)，表達，純化

蛋白激酶D (Protein kinase D，PKD) 是一種新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol, DAG) 受體，能傳遞G蛋白偶聯(lián)受體或酪氨酸激酶受體的信號[1]。目前已鑒定的PKD家族成員有3個：PKD1、PKD2和PKD3。3種PKD亞型都包含N端的調節(jié)結構域和C端的催化結構域。N端調節(jié)域內有幾個保守的模體：丙氨酸-脯氨酸富集的非極性區(qū)域、富含半胱氨酸的DAG結合結構域、酸性結構域和可能參與催化活性抑制調節(jié)的普列克底物蛋白同源域[2-3]。

PKD在細胞內具有多種功能，如參與細胞增殖與分化、細胞凋亡與細胞保護、高爾基復合體功能的調節(jié)、細胞遷移、侵潤和粘附等[4-8]。由于PKD參與了細胞內諸多的生理生化過程，因此作為一個潛在的腫瘤治療靶位，在最近幾年受到了更多的關注[9-14]。然而遺憾的是，到目前為止，尚無任何一個關于PKD蛋白或其功能域的三維結構的研究成果，這極大地阻礙了我們對PKD所介導的信號轉導通路的深入認識，也影響了以PKD及其配體為特異靶點的化學抑制藥物的篩選研究[15-18]。

要想獲得PKD的晶體結構信息，首先必須得到高純度、高活性的蛋白。由于PKD蛋白分子量較大、其結構域復雜難于獲得全長蛋白的結晶，本文首先在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達并純化得到了高純度、高活性的PKD1的催化結構域 (PKD1-cat)，為后續(xù)PKD1-cat晶體學結構的研究奠定了基礎。公司，羊抗鼠IgG-HRP購自Bio-Rad公司；ECL顯色試劑盒購自Thermo公司；蛋白質定量檢測試劑盒購自Bio-Rad公司；Sf-900Ⅱ SFM培養(yǎng)基購自Gibco公司；HyClone SFX-Insect培養(yǎng)基購自Thermo公司；胎牛血清購自Invitrogen公司；[γ-32P]ATP 購自Perkin Elmer Life Sciences公司；Histone Deacetylase 5 (HDAC5) 由Biobasic Canada Inc公司合成。

1.2 方法

1.2.1目的基因GST-PKD1-cat的PCR擴增

以本試驗室構建并保存的pGEX6p-PKD1-cat質粒為模板，以GST-EcoRⅠ-F為正向引物，以PKD1-SpeⅠ-R為反向引物 (表1，由Invitrogen公司合成)，擴增GST-PKD1-cat目的基因。PCR反應條件：94 ℃變性5 min；以94 ℃變性15 s，68 ℃退火及延伸3 min為1個循環(huán)，共30個循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min。反應結束后，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2重組質粒pFastBac-GST-PKD1-cat的構建及鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切后，克隆到同樣酶切的pFastBac1載體中，轉化E. coli XL-1 Blue感受態(tài)細胞，提取重組質粒進行EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切鑒定，篩選出的重組質粒由Invitrogen公司進行測序。測序無誤后將重組質粒命名為pFastBac-GST-PKD1-cat，于?20 ℃冷凍保存。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、質粒和細胞

大腸桿菌Escherichia coli菌株DH10Bac和質粒pFastBac1購自Invitrogen公司；草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda Sf9昆蟲細胞購自美國ATCC；粉紋夜蛾Trichoplusia ni昆蟲細胞購自Allele公司；pGEX6p-PKD1-cat重組質粒由本實驗室構建。

1.1.2酶和主要試劑

pfx DNA聚合酶購自Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和SpeⅠ限制性內切酶購自BioLabs公司；蛋白酶抑制劑 (Protease Inhibitor)購自Roche公司；PreScission Protease購自GE公司；CellfectinⅡ試劑購自Invitrogen公司；n-Octyl-β-D-Glucopyranoside (OG) 購自Anatrace公司；谷胱甘肽瓊脂糖 (Glutathione Sepharose)購自GE公司；鼠GST單克隆抗體購自Santa Cruz

表1 文中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3重組Bacmid的構建及鑒定

按照Invitrogen公司Bac-to-Bac?Baculovirus Expression System說明書進行。簡述如下：將重組質粒pFastBac-GST-PKD1-cat轉化到含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細胞DH10Bac中，藍白斑法篩選重組菌落。挑取白色菌落提取Bacmid DNA，利用M13正向 (M13-F) 和反向(M13-R) 引物 (表1)，用PCR檢測Bacmid DNA中是否含有目的基因。如果轉座成功，PCR產(chǎn)物的大小應約為2 300 bp＋目的基因大小。

1.2.4 Sf9昆蟲細胞的培養(yǎng)和重組桿狀病毒的獲得

Sf9昆蟲細胞于Sf-900 Ⅱ SFM 培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清) 中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度27 ℃。重組Bacmid DNA在CellfectinⅡ試劑介導下轉染生長狀態(tài)良好的Sf9昆蟲細胞，具體轉染方法按Invitrogen 公司的CellfectinⅡ試劑說明書進行。待細胞出現(xiàn)明顯病變后收集上清作為P1代重組病毒。將P1代病毒按1∶10稀釋后，感染Sf9細胞，27 ℃培養(yǎng)48–72 h，待細胞出現(xiàn)明顯病變后收集上清即得P2代病毒。用空斑試驗 (見Bac-to-Bac?Baculovirus Expression System說明書) 進行病毒滴度測定。

1.2.5 Western blotting檢測重組蛋白GST-PKD1-cat的表達

收集有明顯病變的Sf9細胞液，1 200 r/min離心5 min，沉淀內加入細胞裂解液 (PBS，內含蛋白酶抑制劑 和 1% OG) 裂解30 min，12 000 r/min離心25 min。取上清加入SDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸5 min后，進行SDS-PAGE。SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白電轉印至硝酸纖維素膜。將轉印好的硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉封閉，然后與鼠GST單克隆抗體結合。經(jīng)TBST洗滌后與HRP標記羊抗鼠IgG作用，最后以ECL顯色，觀察特異性條帶。

1.2.6 T.ni昆蟲細胞的大量懸浮培養(yǎng)和病毒感染

在500 mL無菌錐形瓶中 (內裝培養(yǎng)基200 mL) 進行T.ni細胞的大量懸浮培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為HyClone SFX-Insect (勿需添加胎牛血清)，培養(yǎng)條件為27 ℃，95 r/min。每天進行細胞計數(shù)，將細胞的生長密度控制在0.5×106–2×106個/mL。當細胞密度達到2×106個/mL后，將細胞鋪板到15 cm的培養(yǎng)皿內，使細胞密度為70%–80%。待細胞貼壁后 (約10 min)，以感染復數(shù) (MOI) 為5 pfu/cell的比例加入P2代病毒，于27 ℃培養(yǎng)箱內進行病毒感染。

1.2.7 PKD1-cat的純化和SDS-PAGE檢測

病毒感染72 h后，細胞出現(xiàn)明顯病變。收集細胞液，1 200 r/min離心5 min。細胞沉淀內加入細胞裂解液裂解30 min，12 000 r/min離心25 min。取上清與Glutathione Sepharose Beads在4 ℃結合1 h，500×g離心5 min沉淀Beads。用PBS洗Beads去除雜蛋白后，在Beads中加入切割緩沖液 (20 mmol/L Tris，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，1% OG)和PreScission Protease，4 ℃切割過夜。10 000×g離心5 min，取上清，該上清中即含有純化的目的蛋白。取少量上清進行蛋白質濃度測定和SDS-PAGE分析。蛋白質濃度測定采用Bio-Rad公司的蛋白質定量檢測試劑盒，具體方法按試劑盒說明書進行。其余上清用超濾管濃縮后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8純化蛋白PKD1-cat的活性檢測

以Histone Deacetylase 5 (HDAC5) 為底物，[γ-32P]ATP為磷的供體進行純化蛋白的體外激酶活性實驗[19]。反應混合物中含1.2 μmol/L HDAC-5，1 μCi [γ-32P]ATP，不同濃度的純化蛋白PKD1-cat，50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，4 mmol/L MgCl2和10 mmol/L β-巰基乙醇。在30 ℃反應10 min后，取反應液25 μL置于Whatman P81濾紙上。為排除同位素直接黏附到濾紙或底物蛋白的可能性，將濾紙吹干后，用0.5%磷酸溶液洗3次，每次5 min，以洗去未摻入底物的γ-32P。將濾紙烘干，置于含10 mL蒸餾水的液閃瓶中，用Beckman LS6500液閃儀測定放射活性 (cpm)，并按以下公式計算激酶的活性 (pmol/min)。每個樣品同時做3個平行管。

其中，校正后的放射活性=所測放射活性－空白管的放射活性，反應時間為10 min，反應體積為50 μL，點樣體積為25 μL。

2 結果與分析

2.1 目的基因PCR產(chǎn)物和重組質粒的鑒定

以pGEX6p-PKD1-cat質粒為模板，采用PCR技術擴增GST-PKD1-cat基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 500?2 000 bp之間出現(xiàn)特異性條帶，長度與預期值 (約1 800 bp) 相符 (圖1A)。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切后，克隆到同樣酶切的pFastBac1載體上，構建重組質粒。提取重組質粒進行EcoRⅠ和SpeⅠ酶切鑒定，電泳后檢測到2條譜帶：1條為pFastBac1載體，另1條約1 800 bp，與目的條帶GST-PKD1-cat的預期結果相符 (圖1B)。測序結果顯示該重組質粒中確實含有目的基因片段，且讀碼框正確，表明重組質粒pFastBac-GST-PKD1-cat 構建成功。

圖1 GST-PKD1-cat的PCR產(chǎn)物鑒定 (A) 和重組質粒的酶切鑒定 (B)Fig. 1 Identification of PCR product of GST-PKD1-cat (A) and recombinant plasmid by enzyme digestion (B). (A) M: DNA marker; 1: PCR product. (B) M: DNA marker; 1: recombinant plasmid digestion by EcoRⅠand SpeⅠ.

2.2 重組Bacmid的鑒定

重組質粒pFastBac-GST-PKD1-cat轉化含穿梭載體Bacmid的DH10Bac細胞，挑取白色菌落提取Bacmid DNA。用M13引物進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳顯示在約4 100 bp處出現(xiàn)了特異性條帶 (圖2)，與預期結果 (約2 300 bp＋目的片段大小1 800 bp) 一致，表明轉座成功，目的基因已轉座到Bacmid上，得到了重組Bacmid。

2.3 Western blotting檢測重組蛋白GST-PKD1-cat的表達

重組Bacmid DNA轉染生長狀態(tài)良好的Sf9昆蟲細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變后收集細胞。裂解細胞，用鼠GST單克隆抗體作為一抗，對細胞裂解液進行Western blotting分析。結果顯示，表達產(chǎn)物在蛋白相對分子質量約68 kDa處有一特異條帶 (圖3)，與預計的GST-PKD1-cat融合蛋白的相對分子質量相同 (GST的相對分子質量約26 kDa，PKD1-cat約42 kDa)，表明GST-PKD1-cat融合蛋白在Sf9昆蟲細胞中得到成功表達。

2.4 GST-PKD1-cat的大量表達及PKD1-cat的純化

圖2 重組Bacmid的PCR鑒定Fig. 2 Identification of PCR product of recombinant bacmid. M: DNA marker; 1: PCR product of recombinant bacmid using primer M13.

大量懸浮培養(yǎng)T. ni昆蟲細胞，感染重組桿狀病毒，收集有明顯病變的細胞裂解、離心。上清液與Glutathione Sepharose Beads結合，用PBS洗去雜蛋白后，加入PreScission Protease切除GST標簽。離心后取上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，在蛋白相對分子質量約42 kDa處出現(xiàn)單一條帶 (圖4)，與預期的PKD1-cat的相對分子質量相同，表明PKD1-cat得到成功純化。采用Bio-Rad 公司的蛋白質定量檢測試劑盒進行蛋白質濃度測定，通過對不同批次純化的PKD1-cat蛋白的濃度測定，1 000 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞均可純化得到高純度的PKD1-cat蛋白約1 mg。

圖3 表達產(chǎn)物的Western blotting分析Fig. 3 Western blotting analysis of expression product. M: protein marker; 1: lysate of Sf9 cells infected with recombinant bacmid.

圖4 SDS-PAGE分析純化結果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified protein. M: protein marker; 1: lysate of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus; 2: purified PKD1-cat.

2.5 純化蛋白PKD1-cat的活性檢測

以HDAC-5為底物，[γ-32P]ATP為磷的供體進行純化蛋白的體外激酶活性實驗。反應混合物中含1.2 μmol/L HDAC-5，1 μCi [γ-32P]ATP和不同濃度的PKD1-cat。30 ℃反應10 min后，用液閃儀測定放射活性 (cpm) 并計算不同濃度下激酶的活性 (pmol/min)。結果顯示 (表2)，隨著PKD1-cat濃度的增加，激酶活性增高，說明純化的PKD1-cat有很好的催化活性。

表2 PKD1-cat的體外激酶活性實驗結果Table 2 Result of in vitro kinase assay using purified PKD1-cat

3 討論

PKD最早于1994年由Valverde等[20]發(fā)現(xiàn)，曾一度被認為是PKC家族中的一類非典型成員(Protein kinase Cμ，PKCμ)[21]，但在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)PKD的激酶結構域 (Kinase domain) 與鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶 (Calcium/ calmodulin-dependent protein kinase, CAMK) 家族的同源性要高于PKC家族，故現(xiàn)已歸類為CAMK家族激酶[22]。

PKD在細胞內發(fā)揮信號轉導作用，需要其DAG結合結構域與DAG結合，以及其催化結構域與底物結合，因此這兩個結構域對其功能的實現(xiàn)極其重要[2,23]?？紤]到PKD蛋白分子量較大 (110 kDa)、且結構域復雜難于得到全長蛋白的結晶，我們選擇了首先在體外表達PKD1的催化結構域 (PKD1-cat)。

昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)是近年來應用較多的真核表達系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中表達的外源蛋白產(chǎn)量高，能夠進行翻譯后修飾、加工，且表達的外源蛋白大多是可溶性的，其生物學活性、結構與功能等與天然蛋白極其相似，因此選擇該系統(tǒng)作為本研究的蛋白表達系統(tǒng)[24]。

為提高該蛋白在昆蟲細胞中的表達產(chǎn)量，我們對表達條件進行了優(yōu)化。首先，對于重組桿狀病毒的擴增，我們選擇在貼壁生長的Sf9昆蟲細胞中進行。用于感染細胞的病毒不易傳代過多，一般使用P2、P3代毒種進行細胞的病毒感染。其次，對于蛋白的大量表達，我們選擇在T.ni昆蟲細胞中進行。可用500 mL、

1 000 mL或更大體積的錐形瓶進行T.ni細胞的大量懸浮培養(yǎng)，錐形瓶內所裝培養(yǎng)基的體積不超過錐形瓶容積的2/5。在27 ℃、95 r/min的培養(yǎng)條件下，T.ni細胞生長很快，一般21 h可擴增一代。每天進行細胞監(jiān)測，控制細胞密度在0.5×106?2×106個/mL。當細胞密度達到2×106個/mL后，將懸浮培養(yǎng)的T.ni細胞鋪板到15 cm的培養(yǎng)皿內，待細胞貼壁后再進行病毒感染，因為在貼壁生長的細胞中，病毒感染效率更高。

在蛋白純化方面，為便于純化蛋白，我們先表達了帶GST標簽的GST-PKD1-cat融合蛋白，再通過Glutathione Sepharose親和層析純化和PreScission Protease切除GST標簽，獲得了PKD1-cat目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，該蛋白純度高，無其他雜蛋白，體外激酶活性實驗也顯示該蛋白具有很好的催化活性，可用于蛋白結晶條件的篩選。因此本研究為PKD1-cat晶體學結構的研究奠定了基礎。

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(本文責編 陳宏宇)

Expression, purification and characterization of catalytic domain of protein kinase D1 in baculovirus-insect cell expression system

Zhihong Li1,2, and Qiming Jane Wang2

1 College of Medical Science, China Three Gorges University, Yichang 443002, Hubei, China
2 Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

Protein kinase D (PKD) is a novel family of serine/threonine kinases and diacylglycerol (DAG) receptors and has been documented in a variety of cellular processes. To get high purity catalytic domain of PKD1 (PKD1-cat) for crystallography study, the GST-tagged PKD1-cat gene was cloned into a baculovirus transfer vector pFastBac1 (donor plasmid). When the recombinant plasmid was transformed into DH10Bac competent Escherichia coli, which contains a baculovirus shuttle vector (bacmid), transposition occurs to generate a recombinant bacmid containing the gene of interest (GST-PKD1-cat). The recombinant bacmid DNA was transfected into Spodoptera frugiperda Sf9 insect cells to generate recombinant baculovirus, which was then amplified through multiple rounds of infection in Sf9 cells. After that, Trichoplusia ni insect cells in suspension culture were infected with baculoviral stock at a multiplicity of infection (MOI) of 5 PFU/cell. SDS-PAGE and Western blotting analysis confirmed the detection of a 68 kDa protein by the glutathione S-transferase (GST) monoclonal antibody. The recombination protein was purified by Glutathione sepharose affinity chromatography and cleaved by PreScission Protease to remove GST tag, and a highly pure 42 kDa protein which was consistent with the molecular weight of the expected PKD1-cat protein was detected on SDS-PAGE. The activity of purified PKD1-cat protein was determined by in vitro PKD kinase assay. Our data showed that the kinase activity increased with the concentration of purified PKD1-cat protein. These results showed that the truncated recombinant PKD1-cat protein was highly active and pure, and could potentially be used for solving 3D structure of this protein by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) or crystallography.

protein kinase D, catalytic domain, insect cell, baculovirus expression system, protein expression, purification

October 9, 2013; Accepted: December 16, 2013

Zhihong Li. Tel/Fax: +86-717-6396818; E-mail: lizhihong923@163.com

李志紅, Qiming Jane Wang. 蛋白激酶D1催化結構域在昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)內的表達、純化和活性測定. 生物工程學報, 2014, 30(8): 1291?1298.

Li ZH, Wang QJ. Expression, purification and characterization of catalytic domain of protein kinase D1 in baculovirus-insectcell expression system. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1291?1298.

Supported by: Scientific Research Foundation for the Talents of China Three Gorges University (No. KJ2008B054).

QJ Wang. Tel: +1-412-383-7754; Fax: +1-412-648-1945; E-mail: qjw1@pitt.edu

三峽大學人才科研啟動基金 (No. KJ2008B054) 資助。

時間：2014-02-17 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130517.html