王艷艷，張春雨，王興春，劉斌

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，山西 太谷 030801

一種基于核酸外切酶Ⅲ的PCR產(chǎn)物克隆方法

王艷艷1,2,3*，張春雨2*，王興春1，劉斌2

1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801

2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081

3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，山西 太谷 030801

基因克隆作為一種常規(guī)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于DNA及蛋白質(zhì)的研究。在傳統(tǒng)的基因克隆中，一般利用限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA片段進(jìn)行消化，然后使用DNA連接酶完成連接，因此這種方法受到插入片段和載體酶切位點(diǎn)的限制。一些ligase-free 克隆技術(shù)雖然克服了酶切位點(diǎn)的限制，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本較高。為了彌補(bǔ)其他ligase-free技術(shù)的不足，文中介紹了一種新的利用核酸外切酶Ⅲ進(jìn)行l(wèi)igase-free克隆的方法，反應(yīng)時(shí)間僅需要30 min，提高了克隆效率并有效降低經(jīng)濟(jì)成本，有利于大規(guī)模基因克隆的應(yīng)用。

核酸外切酶Ⅲ，LIC系統(tǒng)，PCR產(chǎn)物克隆

為了提高克隆效率，近年來一些ligase-free技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)用于高效克隆PCR產(chǎn)物，包括GATEWAY系統(tǒng)[1-3]、In-fusion系統(tǒng)[4-6]、尿嘧啶DNA糖基化酶 (Uracil-DNA glycosylase，UDG)[7-9]、序列和連接反應(yīng)的高效克隆基因方法(Sequence-ligation independent cloning，SLIC)[10]，以及基于T4 DNA 聚合酶的連接反應(yīng)克隆(Ligation-Independent cloning，LIC)[11-15]等。但它們依然存在一些缺陷，例如GATEWAY系統(tǒng)操作步驟繁瑣，引物的兩端需加入較長(zhǎng)特定序列，反應(yīng)所需的酶類價(jià)格昂貴，并需要特定的載體[10]。In-fusion雖然反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，效率較高，但昂貴的酶讓人望而卻步，在大規(guī)模的克隆中消耗太大。LIC作為一種快速高效的方法被應(yīng)用于大規(guī)模的基因克隆[16]及載體構(gòu)建[17-19]。這種方法利用T4 DNA聚合酶的外切酶活性作用于載體與PCR產(chǎn)物的兩端，從而產(chǎn)生互補(bǔ)的5′粘性末端，在退火條件下不需要連接酶的作用，而直接通過5′突出的粘性末端發(fā)生重組，重新環(huán)化成新的質(zhì)粒[20]。但LIC方法需要在重疊區(qū)段缺少某個(gè)特定核苷酸[11-15]，因此需要特定的載體或通過PCR的方法將載體線性化。另外，如果這段粘性末端在編碼區(qū)內(nèi)，就會(huì)在重組蛋白的N端出現(xiàn)多余的肽段，這些都在一定

程度上限制了該方法的廣泛應(yīng)用[11]。

核酸外切酶是從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸作用的酶，核酸外切酶Ⅲ作用于雙鏈DNA，沿3′→5′方向逐步催化去除單核苷酸[21-22]從而產(chǎn)生類似于限制性內(nèi)切酶消化所產(chǎn)生的粘性末端[23]。已有報(bào)道利用核酸外切酶Ⅲ進(jìn)行亞克隆方法的研究[22-24]，但在這些方法中，依然存在操作步驟繁瑣、消耗時(shí)間、工作效率低等問題。文中介紹了一種快速、高效的核酸外切酶Ⅲ亞克隆，很好地解決了上述問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài) (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，pUC19克隆載體，gus質(zhì)粒。

1.1.2主要試劑

核酸外切酶Ⅲ，10×NE Buffer 1，BamHⅠ(NEB公司)，10×NE Buffer 3，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，高保真的KOD酶 (Toyobo公司)，50×TAE，1×TAE，SYBR GreenⅠ染料 (北京普博新生物科技有限公司)，BM5000 DNA Marker (Biomed公司)。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

gus-BamHⅠ-F (pUC19)：5′-CGGTACCCGGGG ATCTTTCGATGCGGTCACTCA-3′；gus-BamHⅠ-R (pUC19)：5′-CGACTCTAGAGGATCCACTT GCGGACGGGTATC-3′。

1.2.2 gus片段的擴(kuò)增和回收

PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L F/R引物，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，10×Buffer 5 μL，KOD酶 1 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，模板 (質(zhì)粒) 1 μL，加滅菌的超純水至總體積50 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 25 s，32個(gè)循環(huán)。

將PCR反應(yīng)得到的目的產(chǎn)物，按照AXYGEN的Axyprep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.2.3載體線性化

利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ (參考NEB公司的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的反應(yīng)體系) 線性化pUC19克隆載體，按照PCR片段與載體摩爾數(shù)為5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶5的比例將兩者在冰上混合；加入無菌水使反應(yīng)體系達(dá)到8 μL；在冰上加入1 μL的10×NE Buffer 1；將100個(gè)單位的核酸外切酶Ⅲ用水稀釋10倍，吸取1 μL加入體系，冰上孵育30 s至3 min。

PCR程序?yàn)椋?0 ℃ 20 min，42 ℃ 10 min，待PCR儀加熱至70 ℃后，立即將反應(yīng)體系放到PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，吸取2 μL反應(yīng)液用于轉(zhuǎn)化。

1.2.4大腸桿菌(DH5α)的熱轉(zhuǎn)化

DH5α感受態(tài)細(xì)胞放置在冰上溶解；在感受態(tài)細(xì)胞中加入2 μL反應(yīng)混合液，輕輕混勻后，冰浴30 min；42 ℃熱激45 s；冰上放置2 min；加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩預(yù)培養(yǎng)60 min；將200 μL培養(yǎng)液涂布到含50 mg/L卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12–16 h。

隨機(jī)挑取96個(gè)單克隆，置于96孔板進(jìn)行菌落PCR，來估計(jì)總克隆數(shù)和陽性克隆數(shù)，找出最佳片段與載體摩爾比。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)探索最佳片段與載體的最佳濃度、冰上孵育的最佳時(shí)長(zhǎng)、最佳退火溫度，具體內(nèi)容參考結(jié)果與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 片段與載體的最佳摩爾比

通過保持載體濃度、改變PCR片段的濃度，調(diào)整反應(yīng)體系中PCR片段與載體摩爾數(shù)的比值。如圖1所示，隨著片段與載體摩爾比的降低，總的克隆數(shù)逐漸上升，并在比值為2∶1時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)片段與載體的摩爾比在1∶1時(shí)，總的克隆數(shù)依然保持較高值，而當(dāng)片段濃度低于載體時(shí)，總克隆數(shù)出現(xiàn)了較大幅度的下降，并隨著摩爾比的降低呈急劇下降的趨勢(shì)。陽性克隆率一直保持較高水平，說明在片段的摩爾數(shù)等于或大于載體的摩爾數(shù)時(shí)，克隆效率較高，并當(dāng)PCR片段與載體的摩爾數(shù)比為2∶1時(shí)，效率最高。

2.2 片段與載體的最佳濃度

在保持片段與載體摩爾比為2∶1的條件下，設(shè)置7個(gè)PCR片段濃度。如圖2所示，隨著片段濃度的增加，總的克隆數(shù)首先呈現(xiàn)出直線上升的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)體系中片段濃度達(dá)到50 ng時(shí)即有較高的克隆數(shù)，并在150 ng時(shí)總克隆數(shù)達(dá)到最大值，且陽性克隆比率也到達(dá)到最高。說明該濃度為反應(yīng)的最佳濃度。當(dāng)體系中PCR片段濃度大于150 ng時(shí)，總的克隆數(shù)則表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镈NA片段過多而反應(yīng)體系小，或DNA片段過多而外切酶切割不充分造成的。

2.3 冰上孵育最佳時(shí)長(zhǎng)

冰上孵育時(shí)間對(duì)總克隆數(shù)及陽性克隆率的影響如圖3A所示，隨著冰上孵育時(shí)間的增加，總的克隆數(shù)表現(xiàn)出了逐漸下降的趨勢(shì)，孵育時(shí)間越長(zhǎng)，下降的幅度則越大。當(dāng)孵育時(shí)長(zhǎng)為30 s時(shí)，克隆數(shù)最多，轉(zhuǎn)化效率最高。但考慮到操作時(shí)間問題，在實(shí)際的操作中，冰上孵育時(shí)間至多不應(yīng)超過3 min。

圖2 片段濃度對(duì)總克隆數(shù)和陽性克隆數(shù)的影響Fig. 2 Effect of the fragment concentration on the total number of clones and the number of positive clones.

冰上孵育的過程中，應(yīng)將PCR儀預(yù)先升溫至70 ℃。孵育結(jié)束后立即將反應(yīng)體系放在70 ℃的PCR儀上加熱20 min，使酶失去活性。如果將反應(yīng)體系放到PCR儀后升溫，則會(huì)嚴(yán)重影響DNA片段的連接效率 (圖3B)。這可能因?yàn)楹怂嵬馇忻涪笤跍囟戎饾u上升至滅火溫度的過程中，對(duì)DNA片段過度切割造成的。

2.4 最佳退火溫度

如圖4所示，70 ℃滅活20 min后，將PCR儀溫度下調(diào)進(jìn)行退火。在設(shè)置的6個(gè)不同梯度的退火溫度中，以42 ℃時(shí)總的克隆數(shù)最多，說明此時(shí)為最佳的退火溫度。較低的退火溫度并未對(duì)總的克隆數(shù)及陽性克隆率造成明顯影響，相反，當(dāng)退火溫度高于42 ℃時(shí)，總的克隆數(shù)隨著溫度的上升而逐漸下降，說明過高的溫度不利于PCR片段與載體重組。因此，在設(shè)置退火溫度時(shí)應(yīng)避免溫度過高而導(dǎo)致效率的降低。

圖3 冰浴時(shí)間以及PCR儀預(yù)熱70 ℃對(duì)總克隆數(shù)和陽性克隆數(shù)的影響Fig. 3 Effect of the incubation time on ice (A) and the temperature of PCR machine (B) on the total number of clones and the number of positive clones.

圖4 退火溫度對(duì)總克隆數(shù)和陽性克隆數(shù)的影響Fig. 4 Effect of the annealing temperature on the total number of clones and the number of positive clones.

2.5 與其他ligase-free技術(shù)的比較

將文中新方法分別與基于T4的ligase-free技術(shù)和In-fusion系統(tǒng)進(jìn)行比較 (Clontech In-Fusion HD克隆試劑盒是一種基于痘病毒DNA聚合酶3′-5′外切酶活性的ligase-free系統(tǒng)，該酶同樣能沿著載體及PCR片段兩端3′羥基方向消化產(chǎn)生互補(bǔ)單鏈，從而完成重組)[17]。T4的方法參考Li等[10]的方法并略有修改，In-fusion參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。文中的方法轉(zhuǎn)化效率介于T4和In-fusion之間，其中以In-fusion的轉(zhuǎn)化效率最高，三者陽性率都處于較高的水平 (表1)，但在價(jià)格方面E3則占據(jù)最大的優(yōu)勢(shì)，低于T4且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于In-fusion (圖5A)。雖然In-fusion的轉(zhuǎn)化效率稍高，但從總克隆數(shù)與每個(gè)反應(yīng)價(jià)格的比值可以看出，E3的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種方法 (表2和圖5B)。

表1 三種亞克隆方法的克隆效率比較Table 1 Comparative analysis of cloning efficienty of the three different cloning methods

圖5 三種酶的效價(jià)比Fig. 5 Comparative analysis of the potency ratio of the three kinds of enzymes. (A) The price per reaction of the three different enzymes. (B) The total number of clones of the three different enzymes.

表2 三種亞克隆方法的價(jià)格效價(jià)比Table 2 Comparative analysis of the price of the three methods of the clone potency ratio

3 討論

本文介紹了一種新的利用核酸外切酶Ⅲ進(jìn)行PCR片段亞克隆的方法，實(shí)驗(yàn)流程如圖6所示。

核酸外切酶Ⅲ主要在冰上完成對(duì)DNA片段的切割，形成較長(zhǎng)的粘性末端，從而使重組變得更穩(wěn)定并且不需要其他的連接反應(yīng)[23]。在其他ligase-free技術(shù)中，人們往往通過在重組序列中缺失某一特定堿基[11-15]，或利用尿嘧啶基化酶[7-9]等方法經(jīng)過外切酶活性消化產(chǎn)生固定長(zhǎng)度的單鏈末端，但這在一定程度上限制了此類方法的使用。本方法利用核酸外切酶Ⅲ在冰上消化PCR產(chǎn)物及載體產(chǎn)生單鏈末端，未采用特殊方法控制切割長(zhǎng)度，這并沒有對(duì)轉(zhuǎn)化效率及陽性率造成影響。有報(bào)道表明，在4 ℃條件下，核酸外切酶Ⅲ每分鐘能夠切割25個(gè)堿基，因此仍需要控制反應(yīng)體系在冰上的孵育時(shí)間。時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)破壞DNA片段的結(jié)構(gòu)，或?qū)е录?xì)菌對(duì)重組后的質(zhì)粒無法完成修復(fù)?？刂票戏跤臅r(shí)間在較短范圍內(nèi)，并在孵育后立即到70 ℃滅活，對(duì)于提高克隆效率至關(guān)重要。

圖6 基于核酸外切酶Ⅲ的克隆圖解Fig. 6 Schematic diagram of exonuclease Ⅲ based cloning.

有研究表明，在LIC系統(tǒng)中，被T4 DNA聚合酶處理的載體經(jīng)凝膠純化后，克隆的重組率能夠達(dá)到100%[25]，即使不經(jīng)過純化，克隆的重組率依然很高，能夠達(dá)到96%以上[15]。本方法在各種處理下，陽性克隆率均大于95%，且變化幅度不明顯，表明該方法同樣具有其他ligase-free技術(shù)高陽性率的優(yōu)勢(shì)。但當(dāng)載體經(jīng)酶切后，一般會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)堿基互補(bǔ)的粘性末端，如果將退火溫度設(shè)置過低，它們可能會(huì)發(fā)生重組環(huán)化成不含有插入片段的空質(zhì)粒。因此，建議退火溫度不宜設(shè)置過低而導(dǎo)致陽性率降低。

載體與PCR片段重組序列的長(zhǎng)度決定著LIC系統(tǒng)的連接效率。有研究表明，12個(gè)堿基是連接的最小長(zhǎng)度，當(dāng)長(zhǎng)度為10個(gè)堿基時(shí)，轉(zhuǎn)化效率下降到25%，而當(dāng)長(zhǎng)度縮短為8個(gè)堿基時(shí)，則沒有克隆出現(xiàn)[15]。而本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化效率可能與退火溫度存在密切的關(guān)系。本方法中載體兩端與PCR片段同源的15個(gè)堿基的Tm值分別為52 ℃和46 ℃ (A-T為2 ℃，G-C為4 ℃)，以此可以推算其退火溫度約在40–50 ℃之間，這與結(jié)果中42 ℃為最佳退火溫度相符。因此，在設(shè)定退火溫度時(shí)，應(yīng)參考互補(bǔ)序列的Tm值，這可以提高載體與插入片段的連接效率。

T4 DNA聚合酶能夠利用其3′-5′外切酶活性消化DNA片段3′末端序列，并用某種dNTP終止反應(yīng)，從而產(chǎn)生5′突出的單鏈末端[25]。因此，T4 DNA聚合酶被廣泛應(yīng)用于LIC系統(tǒng)[10-11,15,20,25-26]。本文參照Li等的方法[10]，利用T4 DNA聚合酶消化DNA片段產(chǎn)生5′突出的單鏈末端，然后在75 ℃條件下滅活20 min，最后退火環(huán)化成新的質(zhì)粒。該方法的轉(zhuǎn)化效率雖然低于E3，但仍然處于較高水平。因此，采用熱滅火終止反應(yīng)適用于此類利用外切酶活性克隆PCR產(chǎn)物的方法。

與其他ligase-free方法相比該方法有下列優(yōu)點(diǎn)：1) 在PCR引物上僅添加了與載體上同源的15個(gè)堿基，重組后不會(huì)編碼多余蛋白；2) 幾乎適用于所有的載體，不需要帶有特定接頭的商業(yè)化載體或通過PCR擴(kuò)增載體；3) 陽性率高，DNA片段的過度切割未影響到轉(zhuǎn)化效率及克隆的陽性率；4) 操作步驟簡(jiǎn)潔，反應(yīng)僅約30 min；5) 價(jià)格低廉，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于in-fusion等其他ligase-free技術(shù)。因此適用于大規(guī)?；蚩寺≈?，具有良好的應(yīng)用前景。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

A method for PCR product cloning based on exonuclease Ⅲ

Yanyan Wang1,2,3＊, Chunyu Zhang2＊, Xingchun Wang1, and Bin Liu2

1 College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China
2 Crop Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
3 Graduate School, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China

Gene cloning is one of the most important and widely used technologies in molecular biology research.Generally, DNA fragment is cut with restriction enzyme, and then the product is ligated to a linearized vector with complementary sticky end or blunt end by DNA-ligase. This traditional DNA cloning method requires compatible enzyme recognition sites existing in both PCR fragment and targeted vector. Several ligase-free methods have been established to avoid the using of restriction enzyme. However, those methods are time-consuming, labor-intensive and expensive. To overcome these shortcomings, we developed an Exonuclease Ⅲ based DNA cloning method that takes only 30 minutes with high cloning efficiency and significant economic advantage. Therefore, this method is suitable for large-scale gene cloning.

exonuclease Ⅲ, LIC system, PCR cloning product

Junuary 19, 2014; Accepted: March 14, 2014

Xingchun Wang. Tel: +86-354-6287191-306; E-mail: wxingchun@163.com

王艷艷, 張春雨, 王興春, 等. 一種基于核酸外切酶Ⅲ的PCR產(chǎn)物克隆方法. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8): 1266?1273.

Wang YY, Zhang CY, Wang XC, et al. A method for PCR product cloning based on exonuclease Ⅲ. Chin J Biotech, 2014,30(8): 1266?1273.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31171352, 31100235), Natural Science Foundation of Shanxi Province, China (No. 2013011028-1).

Bin Liu. Tel: +86-10-82108435; E-mail: liubin05@caas.cn

* These authors contributed equally to this study.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31171352, 31100235)，山西省自然科學(xué)基金 (No. 2013011028-1) 資助。

時(shí)間：2014-04-02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140042.html