王亞杰，李厚華，付婉藝，高艷，王冰潔，李玲

西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

水母雪蓮紅色細(xì)胞系類黃酮含量和相關(guān)基因表達(dá)

王亞杰，李厚華，付婉藝，高艷，王冰潔，李玲

西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100

水母雪蓮為中國傳統(tǒng)名貴中藥，具有散寒除濕、活血通經(jīng)、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效，其主要藥用成分為類黃酮化合物。以水母雪蓮白色系愈傷組織和經(jīng)低溫、高糖、強(qiáng)光誘導(dǎo)得到的紅色系為材料，比較不同細(xì)胞系中類黃酮活性成分、結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的差異。結(jié)果表明，紅色系中總黃酮含量為白色系的3.60倍；重要的藥用成分為蘆丁，其含量達(dá)到干重的0.25%，是白色系的2.40倍；紅色系中花青苷含量極高，矢車菊素3-O-己糖苷和矢車菊素3-O-琥珀酰己糖苷的含量分別達(dá)到干重的0.12%和0.19%；紅色系中CHS、F3'H、FNS、FLS、DFR和ANS基因的表達(dá)均明顯高于白色系；紅色系中轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40的表達(dá)也均明顯高于白色系，其中MYB的表達(dá)量為白色系的19.70倍，說明紅色系中轉(zhuǎn)錄因子的高水平表達(dá)增強(qiáng)了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高了類黃酮的合成。紅色系中bHLH和WD40表達(dá)水平相似，而與MYB的表達(dá)水平相差很大，推測可能在水母雪蓮中bHLH和WD40兩種轉(zhuǎn)錄因子形成二元復(fù)合體后，和MYB共同調(diào)控類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。

水母雪蓮，轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，結(jié)構(gòu)基因，類黃酮生物合成，表達(dá)分析

水母雪蓮Saussurea medusa Maxim是多年生菊科鳳毛菊屬植物，自然生長緩慢，為我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有散寒除濕、活血通經(jīng)、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，水母雪蓮中的主要藥用活性成分為類黃酮化合物[2]，水母雪蓮提取物具有延緩衰老、抗疲勞抗缺氧、清除自由基、抗早孕、抗輻射及抗腫瘤等作用[3-4]。其中，蘆丁具有泄熱涼血止血、擴(kuò)張冠狀動脈、降低血壓[5]、抗氧化和抗惡性細(xì)胞增生[6]等作用?；ㄇ嘬帐羌兲烊坏目顾ダ蠣I養(yǎng)補(bǔ)充劑，具有保護(hù)腦神經(jīng)系統(tǒng)的作用[7]，以及美容養(yǎng)顏、降脂減肥、抗衰抗癌、增加視力的功效[8]。

植物中類黃酮生物合成的起始底物為丙二酰輔酶A (Malonyl-CoA) 和4-香豆酰輔酶A (4-coumaroyl-CoA)，丙二酰輔酶A來自乙酰輔酶A，香豆酰輔酶A來源于苯丙素代謝途徑，其途徑相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因有PAL、C4H和4CL[9]。類黃酮生物合成途徑的結(jié)構(gòu)基因有PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3'H、F3'5'H、FNS、FHT、FLS、DFR及ANS等基因[10]，這些基因受到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控 (圖1)。調(diào)控類黃酮生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子主要分為3類：MYB、bHLH和WD40蛋白。一般認(rèn)為，3類轉(zhuǎn)錄因子可以形成三元復(fù)合體MBW (MYB-bHLH-WD40)，共同調(diào)控植物體內(nèi)類黃酮的合成[11-13]。

目前，水母雪蓮野生資源由于受到過度采挖，已瀕臨滅絕。近年來，趙德修等[14-15]通過對水母雪蓮進(jìn)行細(xì)胞組織培養(yǎng)，獲得了水母雪蓮的愈傷組織。本研究擬通過測定水母雪蓮白色細(xì)胞系和經(jīng)低溫、高糖、強(qiáng)光誘導(dǎo)得到的紅

圖1 類黃酮生物合成途徑及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控簡圖[11-13]Fig. 1 Simplified scheme of the flavonoid biosynthesis pathway and transcription factors[11-13]. MYB (M), bHLH (B) and WD40 (W) transcription factors controll the anthocyanin pathway in Arabidopsis and maize and putative MBW complexes are indicated. PAL, phenylalanine ammonia lyase; C4H, cinnamic acid 4-hydroxylase; 4CL, 4-coumarate CoA ligase; CHS, chalcone synthase; CHI, chalcone isomerase; FHT, Flavanone 3 beta-hydroxylase; F3'H, flavanone 3'-hydroxylase; F3'5'H, flavanone 3'5'-hydroxylase; FNS, flavone synthase; DFR, dihydroflavonol reductase; FLS, flavonol synthase; ANS, anthocyanidin synthase.

色細(xì)胞系的類黃酮含量，以及類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況，探討水母雪蓮中類黃酮合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)構(gòu)基因以及進(jìn)一步的對類黃酮生物合成的調(diào)控機(jī)制，為通過栽培措施或生物技術(shù)提高水母雪蓮中藥用活性成分以及通過細(xì)胞培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)高保健功能的水母雪蓮生藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

水母雪蓮白色細(xì)胞系由中國科學(xué)院植物研究所趙德修研究員惠贈，保存于M1培養(yǎng)基(MS+2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.7%瓊脂+3%蔗糖，pH (5.8)[14]，其培養(yǎng)條件為光強(qiáng)45–55 μmol/(m2·s)、光周期16/8 h、溫度 (22±1) ℃，30 d繼代一次。水母雪蓮紅色細(xì)胞系為本研究組在M2培養(yǎng)基 (MS+3.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.7% 瓊脂+3%蔗糖，pH 5.8) 和光強(qiáng)90–100 μmol/(m2·s)、光周期16/8 h、溫度 (10±1) ℃的條件下誘導(dǎo)得到部分紅色愈傷組織基礎(chǔ)上，通過多次挑選繼代獲得，保存于M1培養(yǎng)基中。

色譜級標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、圣草酚、對香豆酸、兒茶素、矢車菊素、矢車菊素半乳糖苷購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞中總黃酮的含量測定

總黃酮測定采用AlCl3顯色法，以蘆丁作為參照品，蘆丁標(biāo)樣在烘箱里105 ℃烘至恒重，用乙醇溶解成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置入10 mL離心管中，加入0.2 mL 5 %的 NaNO2搖勻后靜置6 min；加入0.2 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后靜置6 min；再加入1 mL 4% NaOH，搖勻后室溫靜置15 min；加入60%乙醇溶液定容至10 mL，于450–540 nm波長范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長 (510 nm)[16]。測定上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液在該波長下的光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

細(xì)胞中總黃酮的含量測定參照李娟等[16]的方法，稱取真空冷凍干燥36 h后的樣品，每0.1 g樣品加入5 mL無水乙醇，室溫下提取48 h，其間振蕩4–6次，使提取液充分浸提樣品，每隔20 min向樣品中加入5 mL無水乙醇，共計3次。然后12 000 r/min離心10分鐘，吸取上清提取液，加入到帶有刻度的離心管中，用70%乙醇定容至20 mL。吸取0.2 mL提取液，按照蘆丁參照品的方法處理，于510 nm處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞中總黃酮含量，每個樣品重復(fù)3次。

1.2.2 高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD) 檢測類黃酮和花青苷含量

取培養(yǎng)12 d的水母雪蓮白色和紅色細(xì)胞系，真空冷凍干燥36 h后，稱取干燥至恒重的兩種雪蓮細(xì)胞系0.45 g各兩份，一份加入10 mL甲醇進(jìn)行提取，用于檢測黃酮類物質(zhì)，另一份加入10 mL 1%甲醇鹽酸進(jìn)行提取，用于檢測花青苷類物質(zhì)。于室溫下浸提48 h，其間振蕩4–6次，使其充分浸提。取上清浸提液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮[17]。

高效液相色譜分析儀器為日立L-2000色譜儀，檢測器為日立二極管陣列檢測器，色譜柱型號：Lachrom-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm色譜柱(Hitachi, Japan)。流動相參數(shù)：A：0.04%的甲酸水溶液；B：色譜級乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?–40 min，A 95%–0%, B 5%–100%；40–60 min，A 0%, B 100%。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流速0.5 mL/min，測定波長為280 nm、535 nm[18]。所有樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)分析，每個樣品重復(fù)3次。所測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，確定提取液中類黃酮的種類及其濃度[18]。

1.2.3 實(shí)時定量PCR檢測相關(guān)基因的表達(dá)

取培養(yǎng)12 d的兩種水母雪蓮細(xì)胞系樣品各0.1 g，使用E.Z.N.A Plant RNA Kit (OMEGA，USA) 提取RNA。取1 μg RNA使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Thermo Fisher, USA) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時定量PCR采用SYBR Green法在IQTM5多重實(shí)時熒光定量PCR儀 (Bio-Rad，USA) 上進(jìn)行，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每個樣品重復(fù)3次。所測相關(guān)基因引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 水母雪蓮兩種細(xì)胞系總黃酮含量

總黃酮含量用比色法測定，根據(jù)結(jié)果計算得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其吸光度的直線方程: C=0.5324A–0.0070，R2=0.9999，測定波長為510 nm。以蘆丁的含量進(jìn)行換算，得到白色和紅色兩種細(xì)胞系中總黃酮含量。水母雪蓮紅色系總黃酮含量為(25.30±0.163) mg/g DW，是白色系 ((7.02±0.301) mg/g DW) 的3.60倍 (圖2)。

表1 實(shí)時定量PCR引物Table 1 Primers of semi-quantitative interpretation PCR

圖2 水母雪蓮總黃酮含量分析Fig. 2 Total flavonoids contents of S. medusa.

2.2 水母雪蓮兩種細(xì)胞系主要活性成分含量

在水母雪蓮兩種細(xì)胞系中均檢測出兒茶素、蘆丁、對香豆酸和圣草酚等類黃酮化合物(圖3)，細(xì)胞系間各種組分存在明顯差異，總體上，紅色系中各種類黃酮成分含量明顯高于白色系，尤其是重要的藥用成分蘆丁，其含量為(2.526 0±0.273 0) mg/g DW，達(dá)到0.25%，是白色系的2.40倍；紅色系中的兒茶素和圣草酚含量尤其突出，分別達(dá)到 (5.897 6±0.192 0) mg/g DW和(0.042 7±0.009 1) mg/g DW，分別為白色系的6.92倍和14.23倍；紅色系中對香豆酸的含量為(0.428 6±0.003 2) mg/g DW，是白色系中的2.80倍。

水母雪蓮紅色系中花青苷主要有矢車菊素3-O-己糖苷、矢車菊素3-丙二酰己糖苷和矢車菊素3-O-琥珀酰己糖苷，其含量分別為 (1.215 4± 0.038 0)、(0.226 4±0.112 0) 和 (1.920 6±0.059 0) mg/g DW，分別達(dá)到干重的0.12%、0.02%和0.19%。較高的花青苷含量是紅色系的最主要顯色原因，而白色系中未檢測到花青苷 (圖3)。

圖3 水母雪蓮主要活性成分成分含量分析Fig. 3 Main active components contents of S. medusa.

2.3 水母雪蓮兩種細(xì)胞系類黃酮相關(guān)基因表達(dá)分析

2.3.1 結(jié)構(gòu)基因表達(dá)分析

在類黃酮合成途徑各結(jié)構(gòu)基因中，PAL、C4H和4CL均屬于苯丙素合成途徑，即合成類黃酮前體的代謝酶基因，細(xì)胞系間差異不大。水母雪蓮紅色系中CHS、F3'H、FNS和ANS基因表達(dá)均明顯高于白色系，分別為白色系的8.57、6.41、7.78和6.02倍。另外CHI、F3'5'H、FLS和DFR基因的表達(dá)分別為白色系的1.75、1.74、2.41和3.16倍。而FHT基因在紅色系中表達(dá)水平有所降低 (圖4)。

2.3.2 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

水母雪蓮紅色系中3種轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH、WD40的表達(dá)量均比白色系中表達(dá)量高，與類黃酮含量成正相關(guān)關(guān)系。其中紅色系的MYB基因 (與擬南芥AtMYB90有較高的同源性) 表達(dá)量極高，為白色系表達(dá)量的19.70倍；紅色系中bHLH和WD40的表達(dá)分別為白色系的6.32和6.54倍。另外，紅色系中bHLH和WD40的表達(dá)水平成等比關(guān)系 (圖5)，但與MYB的表達(dá)水平明顯不同，因此在水母雪蓮中可能是bHLH和WD40兩種轉(zhuǎn)錄因子形成了二元復(fù)合體，與MYB共同參與對類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的調(diào)控。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)對類黃酮合成的調(diào)控

圖4 結(jié)構(gòu)基因表達(dá)分析Fig. 4 Relative expression levels of structural genes in flavonoids pathway.

圖5 轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)分析Fig. 5 Relative expression levels of transcription factor genes in flavonoids pathway.

水母雪蓮紅色細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40的表達(dá)明顯高于白色系中3種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。3種轉(zhuǎn)錄因子通過MYB單獨(dú)調(diào)控和/或MBW復(fù)合體的共同調(diào)控[11,13]，上調(diào)了紅色系中結(jié)構(gòu)基因PAL、CHS、CHI、F3'H、F3'5'H、FNS、FLS、DFR和ANS的表達(dá)，其中上調(diào)最明顯的基因?yàn)镃HS、F3'H、FNS、和ANS。查爾酮合成酶CHS是類黃酮合成途徑的限速酶[10]，結(jié)構(gòu)基因CHS在紅色系中的高水平表達(dá)為整個類黃酮合成途徑提供了大量的底物，進(jìn)而影響到其他類黃酮的合成積累。黃酮醇合成酶FLS是蘆丁合成途徑中重要的催化酶[10]，結(jié)構(gòu)基因FLS的上調(diào)表達(dá)引起了紅色系中蘆丁的積累量的增加。花青素合成酶ANS催化無色花青素合成花青素，進(jìn)而生成花青素的衍生物[10]，紅色系中ANS的高水平表達(dá)明顯地增加了矢車菊素及其衍生物的含量。另外，紅色系中F3'H和DFR基因的上調(diào)表達(dá)也影響了圣草酚和兒茶素的積累。以上結(jié)果說明，紅色系中轉(zhuǎn)錄因子的高水平表達(dá)，有效地上調(diào)了其結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了類黃酮的生物積累。劉永剛等[19]的研究表明水母雪蓮細(xì)胞的抗氧化活性隨細(xì)胞中類黃酮含量的增加而增強(qiáng)，而且在天山雪蓮Saussurea involucrate中類黃酮含量的增加也提高了其抗氧化能力[3]。水母雪蓮紅色細(xì)胞系中類黃酮含量明顯高于白色系，因此紅色系的抗氧化能力等藥用活性也相應(yīng)高于白色系，其藥用價值高于白色系。

3 討論

植物類黃酮合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)不只受到自身的調(diào)控，同時會受到外界環(huán)境因子的影響。強(qiáng)光處理可以激活玉米Zea mays MYB和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，低溫下蘋果Malus domestica MdMYBA轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)會增強(qiáng)，蔗糖處理可以強(qiáng)烈上調(diào)花青素苷合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)[20]。本實(shí)驗(yàn)中，水母雪蓮白色愈傷組織在低溫、高糖和強(qiáng)光條件的誘導(dǎo)下，表面出現(xiàn)少量深紅色愈傷組織，經(jīng)過挑選后再培養(yǎng)，得到穩(wěn)定遺傳的紅色系愈傷組織。

相比于水母雪蓮白色細(xì)胞系，紅色系中含有大量的蘆丁、花青苷、兒茶素、對香豆酸和圣草酚等活性成分，具有降血脂、抗菌消炎、抗氧化、抗衰抗癌、美容養(yǎng)顏的功效[6,8]，因此水母雪蓮紅色細(xì)胞系有作為保健食品、化妝品和天然色素原料的潛力。

由外植體分化的愈傷組織可以分化為白、紅兩色細(xì)胞系且穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象不僅僅在水母雪蓮中出現(xiàn)，在天山雪蓮[21]、金蕎麥Fagopyrum dibotrys[22]、大花紅景天Rhodiola coccinea[23]等植物中亦有報道，且這些植物均為類黃酮含量高、具有較高藥用價值的植物。水母雪蓮的紅色愈傷組織相比于白色愈傷組織，總黃酮含量高且增殖能力明顯強(qiáng)于白色系。這對其他藥用活性成分為花青苷或類黃酮的藥用植物的高保健成分細(xì)胞系培養(yǎng)具有一定的借鑒作用。

水母雪蓮紅色系中類黃酮合成途徑相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因CHS、F3'H、DFR和ANS的表達(dá)均明顯高于白色系，同時紅色系中也檢測到含量豐富的花青苷；紅色系中FLS基因表達(dá)水平是白色系的2.41倍，而紅色系中蘆丁的含量是白色系中的2.40倍。以上結(jié)果表明，類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的增強(qiáng)，提高了紅色系中相關(guān)產(chǎn)物的含量。MYB、bHLH和WD40這3種轉(zhuǎn)錄因子通過MYB單獨(dú)調(diào)控和/或MBW復(fù)合體共同調(diào)控生物體內(nèi)的類黃酮生物合成[11,13]，紅色系中3種轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40的表達(dá)量明顯高于白色系，同時紅色系中主要結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量也明顯高于白色系，說明紅色系中轉(zhuǎn)錄因子的高水平表達(dá)，上調(diào)了結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了類黃酮的生物合成，提高了水母雪蓮紅色細(xì)胞系的藥用價值[4,19]。

本研究結(jié)果表明，水母雪蓮紅色系中轉(zhuǎn)錄因子bHLH和WD40的表達(dá)水平成等比關(guān)系，但與MYB的表達(dá)水平相差極大。因此在水母雪蓮中，有可能是bHLH和WD40兩種轉(zhuǎn)錄因子形成二元復(fù)合體，進(jìn)而和MYB共同調(diào)控類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，以此調(diào)控類黃酮的生物合成。

此外，在愈傷組織變紅的過程中，我們觀察到水母雪蓮愈傷組織顏色的轉(zhuǎn)變是從其表面開始的，可能的原因有：由于位置效應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)部激素分布變化，引起轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)提高[24-25]，從而對類黃酮途徑進(jìn)行調(diào)控；或者由于基因突變，引起體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子啟動子的去甲基化，明顯增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[26]，進(jìn)而提高了類黃酮的合成。

REFERENCES

[1] Yi T, Zhao ZZ, Yu ZL, et al. Comparison of the anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of three medicinal plants known as "Snow Lotus" herb in traditional Uighur and Tibetan medicines. J Ethnopharmacol, 2010, 128: 405–411.

[2] Liu CZ, Saxena PK. Saussurea medusa cell suspension cultures for flavonoid production. Methods Mol Biol, 2009, 547(1): 53–59.

[3] Fan C, Yue J. Biologically active phenols from Saussurea medusa. Bioorg Med Chem, 2003, 11:703–708.

[4] Qiu J, Gao FH, Shen GA, et al. Metabolic engineering of the phenylpropanoid pathway enhances the antioxidant capacity of Saussurea involucrate. PLoS ONE, 2013, 8(8): e70665.

[5] Jiang QB, Chen XZ. Extraction of rutin by microwave irradiation with alkali-base and development of compound health care tea from pagoda-tree flowers. J Central South Univ For Tech, 2008, 28(1): 158–161 (in Chinese).

姜清彬, 陳學(xué)澤. 2008. 蘆丁的提取及槐花復(fù)合保健茶的研制. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 28(1): 158–161.

[6] La Casa C, Villegas I, Alarcón LC, et al. Evidence for protective and antioxidant properties of rutin, a natural flavone, against ethanol induced gastric lesions. J Ethnopharmacol, 2000, 71(1/2): 45–53.

[7] Zhao XL. Research progress of ingredient and healthy function of blueberry. Chin Wild Plant Resour, 2011, 30(6): 19–23 (in Chinese).

趙秀玲. 藍(lán)莓的成分與保健功能的研究進(jìn)展. 中國野生植物資源, 2011, 30(6): 19–23.

[8] Zhao X. Research on extraction, purification and reducing blood-fat of natural anthocyanin [D]. Harbin: Northeast Forestry University, 2005 (in Chinese).

趙鑫. 天然花青苷提取純化及降血脂作用的研究[D]. 哈爾濱: 東北林業(yè)大學(xué), 2005.

[9] Wang YC, Chen S, Yu O. Metabolic engineering of flavonoids in plants and microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91(4): 949–956.

[10] Masahiro N, Takashi N. Genetic engineering of flavonoid pigments to modify flower color in floricultural plants. Biotechnol Lett, 2011, 33(3): 433–441.

[11] Petroni K, Tonelli C. Recent advances on the regulation of anthocyanin synthesis in reproductive organs. Plant Sci, 2011, 181(3): 219–229.

[12] An XH, Tian Y, Chen KQ, et al. The apple WD40 protein MdTTG1 interacts with bHLH but not MYB proteins to regulate anthocyanin accumulation. J Plant Physiol, 2012, 169(7): 710–717.

[13] Zhao L, Gao LP, Wang HX, et al. The R2R3-MYB, bHLH, WD40, and related transcription factors in flavonoid biosynthesis. Funct Integr Genomics, 2013, 13(1): 75–98.

[14] Zhao D, Xing J, Li M, et al. Optimization of growth and jaceosidin production in callus and cell suspension cultures of Saussurea medusa. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2001, 67(3): 227–234.

[15] Zhao D, Huang Y, Jin Z, et al. Effect of aggregate size in cell cultures of Saussurea medusa on cell growth and jaceosidin production. Plant Cell Rep, 2003, 21(11): 1129–1133.

[16] Li J, Zhang LG, Zhang Y. A study on extraction and determination of total flavonoids in orange colour chinese cabbages. Acta Hortic Sin, 2007, 34(4): 923–928(in Chinese).

李娟, 張魯剛, 張昱. 橙色大白菜球葉總黃酮提取與測定方法的研究. 園藝學(xué)報, 2007, 34(4): 923–928.

[17] Li L, Li HH, Wang YJ, et al. Pigments analysis of Berberis thunbergii cv. atropurpurea leaves. J Northeast For Univ, 2013, 41(7): 58–62 (in Chinese).

李玲, 李厚華, 王亞杰, 等. 紫葉小檗葉片色素成分分析. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 41(7): 58–62.

[18] Li HH, Flachowsky H, Fischer TC, et al. Maize Lc transcription factor enhances biosynthesis of anthocyanins, distinct proanthocyanidins and phenylpropanoids in apple (Malus domestica Borkh.). Planta, 2007, 226(5): 1243–1254.

[19] Liu YG, Gao M, Cui JY, et al. Flavonoid biosynthesis and antioxidant activities in the suspension culture of Saussurea medusa cells. Acta Bot Bor-Occid Sin, 2005, 25(7): 1421–1427 (in Chinese).

劉永剛, 高敏, 崔建云, 等. 水母雪蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)合成黃酮及抗氧化活性. 西北植物學(xué)報, 2005, 25(7): 1421–1427.

[20] Hu K, Han KT, Dai SL. Regulation of plant anthocyanin synthesis and pigmentation by environmental factors. Chin Bull Bot, 2010, 45(3): 307–317 (in Chinese).

胡可, 韓科廳, 戴思蘭. 環(huán)境因子調(diào)控植物花青素苷合成及呈色的機(jī)理. 植物學(xué)報, 2010, 45(3): 307–317.

[21] Jia JM, Wu CF, Wu LJ. Studies on the production of total flavonoids by the callus of Saussurea involucrata Kar. et Kir. Res Inform Tradit Chin Med, 2005, 7(7): 11–15 (in Chinese).

賈景明, 吳春福, 吳立軍. 天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)與次生代謝物形成的研究. 中藥研究與信息, 2005, 7(7): 11–15.

[22] Liu GD, Zhu QL, Guo YL, et al. The acquisition of high flavonoids-producing callus line and its cDNA library construction of Fagopyrum dibotrys. J Agro-Environ Sci, 2006, 25(6): 1679–1684 (in Chinese).

劉光德, 祝欽瀧, 郭余龍, 等. 資源植物金蕎麥高類黃酮含量愈傷系的獲得及其cDNA文庫的構(gòu)建. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2006, 25(6): 1679–1684.

[23] Sha H, Tang F, Gao Y, et al. Callus induction and plant regeneration in Rhodiola coccinea. J Xinjiang Agric Univ, 2008, 31(3): 58–61 (in Chinese).

沙紅, 唐芳, 高燕, 等. 大紅紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生體系的建立. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008, 31(3): 58–61.

[24] Guo JC, Hu XW, Duan RJ. Interactive effects of CKs, light and sucrose on the phenotypes and the syntheses of anthocyanins, lignins in cytokinin over-producing transgenic Arabidopsis. J Plant Growth Regul, 2005, 24: 93–101.

[25] Kumar PD, Shin DH, Choi SB, et al. Sugar-hormone cross-talk in anthocyanin biosynthesis. Mol Cells, 2012, 34(6): 501–507.

[26] Wang ZG, Meng D, Wang AD, et al. The methylation of the PcMYB10 promoter is associated with green-skinned sport in Max Red Bartlett pear. Plant Physiol, 2013, 162: 885–896.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Flavonoids contents and expression analysis of related genes in red cell line of Saussurea medusa

Yajie Wang, Houhua Li, Wanyi Fu, Yan Gao, Bingjie Wang, and Ling Li

College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

Saussurea medusa is a rare traditional Chinese medicinal herb. Besides anti-inflammatory and analgesic activities, it has effects of disinhibiting cold, dispelling dampness and promoting blood circulation. Flavonoids are the main medicinal compounds in S. medusa. Contents of flavonoids and expression of flavonoids biosynthesis related genes in white and red (induced by low temperature, high sucrose and high light) callus were analyzed. The results showed that the total flavone in red line was 3.60 times higher compared to white line. The accumulation of rutin in red line (0.25% of dry weight) was 2.40 times higher compared to white line. Anthocyanins were abundant in red line, with the contents of cyanidin 3-O-glucosidechloride and cyanidin 3-O-succinyl glycoside 0.12% and 0.19% of dry weight respectively. CHS, F3'H, FNS, FLS, DFR and ANS genes were highly expressed in red line compared to white line. Expression of three transcription factors (MYB, bHLH and WD40) in red line was significantly higher than that in white line, especially the expression of MYB (19.70 times higher compared to white line). These results indicated that high expression levels of transcription factors induced high expression of structural genes in red line, thereby enhancing the flavonoids biosynthesis. The expression of bHLH and WD40 was similar, whereas it was significantly different from that of MYB, indicating that bHLH and WD40 could form a binary complex to regulate expression of structural genes and flavonoids biosynthesis.

Saussurea medusa, transcription factors complex, structural genes, flavonoids biosynthesis, expression analysis

October 18, 2013; Accepted: December 16, 2013

Houhua Li. Tel: +86-15114800050; E-mail: lihouhua73@163.com

王亞杰, 李厚華, 付婉藝, 等. 水母雪蓮紅色細(xì)胞系類黃酮含量和相關(guān)基因表達(dá)分析. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(8):1225?1234.

Wang YJ, Li HH, Fu WY, et al. Flavonoids contents and expression analysis of related genes in red cell line of Saussureamedusa. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1225?1234.

Supported by: National Forestry Public Welfare Industry Research Special (No. 201204308), Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20120204120006).

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng) (No. 201204308)，高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 (No. 20120204120006) 資助。

時間：2014-02-25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130536.html