張學敏，金莉莉，王錚，王秋雨

遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036

抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達

張學敏，金莉莉，王錚，王秋雨

遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036

抗菌肽作為新一代抗生素的潛在應用價值使其備受關注，大量高純度的抗菌肽是開展基礎及臨床實驗的關鍵。天然來源的抗菌肽資源有限、純化困難，化學合成抗菌肽成本高、活性不穩(wěn)定，因此通過基因重組表達得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法。目前采用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得抗菌肽已成為研究者的首選，通常以形成融合蛋白的方式表達，這不僅可避免抗菌肽對宿主的殺傷作用，也保護了抗菌肽免受蛋白酶降解。文章結合課題組的研究工作，綜述了近年來抗菌肽在大腸桿菌中表達的融合載體、融合蛋白的裂解方法及表達條件優(yōu)化的研究進展。

抗菌肽，載體蛋白，融合表達，裂解方法，條件優(yōu)化

抗菌肽是由生物防御系統(tǒng)產生的一類小分子肽類物質[1]，通常由10-50個氨基酸組成，大多帶有一定量的正電荷?？咕木哂袕V譜抗菌活性，對細菌、真菌及一些包膜病毒都表現(xiàn)出顯著活性，而且抗菌肽主要與微生物膜作用，阻礙了微生物產生抗藥性的能力。由于抗菌肽本身的優(yōu)勢，它作為一種新型抗生素引起了人們廣泛的興趣，低成本生產大量抗菌肽是對其進行基礎研究及廣泛應用的前提。重組DNA技術為蛋白生產提供了一種經(jīng)濟有效的方式，許多抗菌肽已經(jīng)通過基因重組技術在多種異源宿主中成功表達[2]，如酵母、昆蟲、大腸桿菌等。酵母表達系統(tǒng)具有完備的基因表達調控機制和對產物的加工修飾能力，畢赤酵母表達系統(tǒng)是其中的典型代表，該系統(tǒng)表達的抗菌肽多為分泌表達，產物對宿主菌沒有明顯的抑制作用，但存在著表達效率低、發(fā)酵周期長和易污染等弱點[3]。昆蟲表達系統(tǒng)是另一類應用廣泛的真核表達系統(tǒng)，如以桿狀病毒為載體，在昆蟲細胞Sf-9中表達抗菌肽Shiva-1a[4]，該表達系統(tǒng)具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉移外源蛋白的能力，蛋白表達水平較高、成本低，但缺點是翻譯后加工修飾體系操作繁瑣[5]。大腸桿菌是表達異源重組蛋白應用最為廣泛的宿主，與酵母表達系統(tǒng)及昆蟲表達系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有能在較短的時間內高水平地表達多種蛋白、發(fā)酵條件易掌控和表達成本低等優(yōu)勢，但其也具有翻譯后加工修飾體系不完善、表達產物的生物活性較低等弱點[5]。鑒于抗菌肽分子量較小，且基本不需要翻譯后的加工修飾，所以綜合考慮大腸桿菌表達系統(tǒng)應是抗菌肽重組表達的第一選擇。

另外，抗菌肽一般是陽離子小分子多肽，它極易被蛋白酶降解，且對宿主細胞具有一定的殺傷作用，因此在抗菌肽異源表達時經(jīng)常會將目的肽與融合載體連接，融合載體的作用類似于天然抗菌肽產生過程中能夠保護抗菌肽及宿主細胞的前導肽部分，在生物合成中保護肽和宿主免受傷害[6]。融合蛋白形成以后，可以通過酶解法或化學裂解方法進行切割，然后進一步分離純化獲取抗菌肽。在大腸桿菌中常用的載體蛋白主要包括兩類：促進可溶性表達的載體蛋白和促進包涵體形成的載體蛋白。此外，自身可降解蛋白和信號肽由于可自動切割標簽，引導分泌表達，亦可分別作為載體蛋白應用[7]。本文結合課題組的研究工作，綜述了近年來抗菌肽在大腸桿菌體系中重組表達使用的融合載體、融合蛋白的裂解方法及表達條件優(yōu)化的研究進展。

1 協(xié)助抗菌肽可溶性表達的載體蛋白

硫氧還蛋白是一個常用的分泌表達抗菌肽的載體蛋白，它不僅能夠增加重組蛋白的可溶性，降低重組蛋白被宿主蛋白酶降解的機率，而且能夠催化胞質中重組蛋白二硫鍵的形成[8]?？咕闹亟M生產數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，硫氧還蛋白載體蛋白的使用頻率最高，大約占融合表達總數(shù)的25%以上，它分子質量小 (11.8 kDa)，且高度可溶，這些性質使硫氧還蛋白成為在大腸桿菌細胞質中表達重組抗菌肽廣泛使用的融合載體[9-10]，而且會提高融合蛋白的產量。最近的一項研究表明，在被測的13種不同的載體蛋白中，盡管硫氧還蛋白整體表達水平并不是最高的，但其融合肽的產量卻是最高的[11]。Li在大腸桿菌中成功表達了與硫氧還蛋白融合的人源性抗菌肽LL-37，融合蛋白的產量為31.5 mg/L[12]。Xia等將硫氧還蛋白與抗菌肽cecropinXJ在大腸桿菌中融合表達，鎳柱純化后，融合蛋白的產量為10 mg/L，對金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，最小抑菌濃度 (MIC) 為0.4 μmol/L[13]。Aleinein等將抗菌肽ranalexin與硫氧還蛋白融合表達，經(jīng)過兩次親和層析純化后，融合蛋白的產量為1 mg/L，該融合蛋白對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及釀膿鏈球菌都顯示了較好的抑菌活性[14]。硫氧還蛋白需要與親和標簽融合以便于目的蛋白的分離純化，最常用的親和標簽是His標簽。

谷胱甘肽轉移酶 (GST) 是另一種常用的融合蛋白表達載體，有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高其穩(wěn)定性、可溶性，并可作為標簽，通過親和層析純化表達產物。所以抗菌肽同GST標簽融合表達將顯著提高其表達量、降低生產成本。但是由于GST分子量比較大(27 kDa)，而抗菌肽通常是小分子量多肽，這樣會造成抗菌肽在融合蛋白中比例偏低，降低表達效率[15]。

SUMO是一種新型的融合載體，SUMO與泛素結構類似但功能不同，已經(jīng)證明它能提高目的蛋白的折疊效率和溶解度[16-17]。SUMO分子質量小 (11.2 kDa)，有利于提高抗菌肽的產量。SUMO蛋白酶能夠特異識別SUMO的三級結構，這樣就能夠完全避免對目的抗菌肽的切割，使酶切后的目的蛋白具有天然的N-端結構，這對于保持抗菌肽活性至關重要[17-19]。2008年，美國喬治亞州埃默里大學的一個研究小組獲得了SUMO表達系統(tǒng)生產抗菌肽的專利[20]。近日，該研究小組進一步證明在大腸桿菌中使用該系統(tǒng)生產抗菌肽具有低成本高效益特點[21]。研究證明應用SUMO融合系統(tǒng)，一些比較難表達的蛋白質如非典型肺炎病毒蛋白已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達[22]。同硫氧還蛋白一樣，SUMO也需要與親和標簽融合方便目的蛋白的分離純化，最常用的親和標簽是His標簽。

2 協(xié)助抗菌肽包涵體表達的載體蛋白

與可溶性表達相比，包涵體表達減輕了抗菌肽對宿主的毒性作用，而且保護目的肽免受降解。然而，正如前文所述，很多抗菌肽都成功地以可溶的方式融合表達，這說明促使融合蛋白形成包涵體對保護宿主和目的肽并不是必要的。不過包涵體表達產量高、蛋白穩(wěn)定、融合蛋白易于純化仍是其難以替代的優(yōu)勢。包涵體是不溶性組分，裂解細胞后通過離心可以初步提取，再通過清洗、固定化金屬親和層析(IMAC)進一步純化。類固醇異構酶[23]、PurF片段[24]、PaP3.30[25]和TAF12組蛋白折疊結構域[26]屬于這類載體蛋白。Lee等將PurF片段與抗菌肽MSI-344融合，融合蛋白以包涵體形式表達，表達量約占細胞總蛋白的30%[24]。Majerle等將乳鐵蛋白與類固醇異構酶融合，高效獲得了易純化，穩(wěn)定性較高的融合蛋白[23]。本文課題組將東北林蛙皮抗菌肽Dybowskin-2CDYa、抗菌肽AWRK6分別與hEGF (人表皮生長因子) 基因融合，在大腸桿菌體系內成功以包涵體形式表達了融合蛋白，表達量高、易純化，實驗數(shù)據(jù)顯示在未酶切的狀態(tài)下融合蛋白即具有抑菌功能又有促成纖維細胞分裂功能 (未發(fā)表數(shù)據(jù))。

3 可自我剪切的載體蛋白

內含肽(Intein)是內含子對應的多肽序列，能夠自我催化蛋白質的剪接，使自身從前體蛋白中切除，并將兩側外顯肽連接形成成熟蛋白[27]。利用內含肽的自我剪接特性，可以構建親和標簽-內含肽-抗菌肽體系，表達目標蛋白后，利用親和標簽進行融合蛋白的純化，通過改變溫度、pH或加入巰基試劑等方法誘導內含肽自我剪切，從而實現(xiàn)蛋白質“一步一柱法純化”。至今已有多種抗菌肽通過內含肽載體實現(xiàn)了表達，如Gu等構建了內含肽介導PHB純化人源抗菌肽LL-37體系，高效表達LL-37融合蛋白，并成功純化了目的蛋白[28]。自我剪接的內含肽消除了外源蛋白酶及化學試劑的消耗，同時也簡化了純化過程。不過它也存在一些缺點，如自我剪切的誘導條件不易控制，而且有些自我剪切的誘導劑如巰基試劑會影響目標蛋白的二硫鍵及相應結構[29]。另外內含肽的分子量較大，影響目的肽的表達量。

4 信號肽載體蛋白

大腸桿菌周質是一個比細胞質的氧化性更高的環(huán)境，有利于外源蛋白的正確折疊。信號肽介導的分泌表達簡化了蛋白純化工藝。此外，分泌表達后會切除信號序列，外源蛋白前端的甲硫氨酸殘基不復存在，保證了外源蛋白N?端無多余殘基。大腸桿菌中常用的信號序列包括OmpA、PelB、PhoA和HlyA等。用大腸桿菌分泌表達抗菌肽需要考慮抗菌肽對宿主菌的殺傷作用。也有研究表明信號序列的存在可能無法保證目的蛋白的分泌表達，表達的蛋白仍然可以只形成包涵體[30]。Wu等以分泌的形式在大腸桿菌中成功表達了信號肽PelB、Cherry標簽和抗菌肽metchnikowin融合蛋白，該融合蛋白在誘導18 h后表達量為300 μg/mL[31]，Cherry 標簽的存在抑制了抗菌 metchnikowin對宿主的殺傷作用。Cherry標簽是細胞色素的血紅素結合域[32]，具有可視化特點，利用這一特性目前已開發(fā)了Cherry標簽可視化蛋白表達系統(tǒng)，表達出的融合蛋白會帶有Cherry的紅色標簽，這樣不僅可以簡單快速檢測出目的蛋白的濃度，而且由于Cherry標簽的高溶解度也提高了目的蛋白的溶解性。表1列舉了大腸桿菌中融合表達的部分抗菌肽及其融合載體。

5 融合蛋白的裂解方法

抗菌肽融合表達有助于目標蛋白的正確折疊和溶解，但也可能會產生不利影響，融合標簽的存在可能會影響目的蛋白的結構，抑制目的蛋白的活性。因此，在研究抗菌肽性質或功能時，需要考慮融合標簽移除的必要性。除了裂解后進行自我裂解的內含肽和信號肽，其他融合蛋白都需要外源性的化學物質或是蛋白酶來釋放目標抗菌肽。

表1 在大腸桿菌中融合表達的部分抗菌肽及其融合載體Table 1 A part of fusion antimicrobial peptides expressed in E. coli and its carrier

表1 在大腸桿菌中融合表達的部分抗菌肽及其融合載體Table 1 A part of fusion antimicrobial peptides expressed in E. coli and its carrier

Size represents the number of amino acid residues; NA: not available.

Fusion solubility Yield (mg/L) Soluble 346.0 Soluble 23.0 Soluble 11.2 Soluble 1.2 Soluble 5.2 Soluble 31.5 Soluble 10.0 Soluble 1.0 Soluble 2.0 Soluble 1.8 Soluble 1.5 Soluble 16.7 Soluble 3-4 Soluble 1.5 Soluble 1.5 Insoluble 167.0 Insoluble 131.0 Insoluble 2.4 Partially soluble 3.2 Soluble NA Soluble 300

溴化氰、甲酸和羥胺是3個主要用于融合標簽去除的化學試劑?；瘜W裂解的主要原理是：在目標蛋白與融合標簽之間插入一個甲硫氨酸殘基，誘導表達并純化后，用溴化氰或羥胺處理所純化的融合蛋白，使融合蛋白在插入的甲硫氨酸殘基處斷裂，從而使標簽從目標蛋白脫離[47]。Zhang等制備新型降鈣素時就用到了溴化氰裂解，裂解后的蛋白經(jīng)過S-Sepharose純化得到新型降鈣素前體，純度達到97.6%[48]。雖然溴化氰比其他兩者應用得更廣泛，不過抗菌肽序列中甲硫氨酸的存在限制了它的應用。此外，載體中或是連接區(qū)域的甲硫氨酸可以使后續(xù)的純化變得復雜且低效。甲酸和羥胺很少產生非特異性裂解?；瘜W裂解法具有效率高、成本低等優(yōu)點，不過卻容易破壞目的蛋白的結構和功能，且化學裂解試劑具有毒性，不適合藥用蛋白的處理及研究。

腸激酶、凝血酶、Xa因子、TEV蛋白酶、SUMO蛋白酶是幾種常用的融合蛋白裂解酶。它們可以識別蛋白質的特殊序列，在融合標簽和目的蛋白之間加入蛋白酶識別序列，可以實現(xiàn)融合蛋白標簽的移除。研究發(fā)現(xiàn)，腸激酶、Xa因子和凝血酶的切割效率較低，可能是因為目的蛋白聚集使酶切位點不易接近[49]或是周圍殘基的影響[50]。對于切割效率低的蛋白酶，通常需要延長酶切時間，這樣容易產生非特異性切割，且長時間酶切可能會造成目的蛋白的失活[51-52]。TEV蛋白酶是一種不受低濃度尿素控制的蛋白酶，在很多情況下可以產生原始的N-末端[53]，其生產方式相對容易，成本相對較低。本課題組在His標簽和hEGF-AWRK6 融合蛋白之間加入了TEV蛋白酶識別位點，已證明TEV 蛋白酶在4 ℃過夜條件下可將標簽切掉。SUMO蛋白酶只識別SUMO的三級結構，此酶不在目的蛋白內部裂解，而且目的蛋白具有原有的N-末端[54]，其在2 mol/L尿素中依然保持活力。酶切后可以利用酶的親和標簽二次過柱除去蛋白酶。幾種常用的裂解融合蛋白的物質及特點見表2。

6 表達條件的優(yōu)化

為實現(xiàn)抗菌肽基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功表達并提高表達量，對目的基因的密碼子以及環(huán)境條件如菌體生長溫度、IPTG的濃度、pH、通氣量等的優(yōu)化也是必要的研究內容。研究發(fā)現(xiàn)，即使一個同義密碼子的替換，也可能會影響基因的表達水平、蛋白質的折疊以及蛋白質結構及功能的改變[55]。抗菌肽的小分子量意味著其編碼基因可以廉價合成，密碼子的變化可能會導致大腸桿菌表達蛋白水平的巨大改善。Li等根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性，改造了人β防御素基因，使其在大腸桿菌中高效融合表達，融合蛋白占細菌總蛋白的50%以上，是野生型基因的9倍[56]。

大腸桿菌最適生長溫度是37-39 ℃，在此溫度下極易形成包涵體，低溫條件可增加外源蛋白可溶性表達的比例。如Isopenicillin-N-synthase在25 ℃以可溶性形式表達的蛋白比37 ℃高出10%-29%[57]，Murine protein Mx在30 ℃時，50%以可溶性方式表達，在37 ℃則以包涵體表達[58]。此外，構建促進二硫鍵形成的宿主，也將有可能極大地提高可溶蛋白的表達水平[59]。某些外源蛋白的活性和穩(wěn)定性與某些金屬離子密切相關，因此向培養(yǎng)基中添加外源蛋白所需金屬離子也可能提高蛋白的可溶性和穩(wěn)定性[60]。

表2 幾種常用的裂解融合蛋白的物質Table 2 Several commonly used substances to cleave fusion protein

7 小結

與天然來源和化學合成生產抗菌肽相比，大腸桿菌融合表達的獨特優(yōu)勢使其成為大規(guī)模生產抗菌肽最具成本效益的方式，硫氧還蛋白是融合表達生產抗菌肽使用最多的載體蛋白，在適宜條件下可以獲得大量的可溶性融合蛋白，分子量小、高度的溶解性等優(yōu)良性能使其特別適用于抗菌肽的生產。SUMO被證明是一種能高效表達可溶性重組蛋白的載體蛋白，其具有高度的特異性和穩(wěn)定性。去除融合蛋白標簽的酶解法效率并不高，TEV蛋白酶、SUMO蛋白酶是兩種活性和特異性相對較高的蛋白酶。化學裂解法雖然通常是有效的，卻容易受到極端pH和高溫的影響。為實現(xiàn)抗菌肽的高效表達，需要對其表達條件進行優(yōu)化，進而生產大量滿足需要的產物。

生產成本高依然是抗菌肽應用的主要障礙，雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多提高生產效率和降低生產成本的系統(tǒng)和方法，但離商業(yè)上可接受的范圍依然很遠。因此，開發(fā)不同的系統(tǒng)、提高抗菌肽表達效率、簡化分離純化過程對于生產具有生物活性的抗菌肽依然具有重要意義。

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(本文責編 郝麗芳)

Fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli

Xuemin Zhang, Lili Jin, Zheng Wang, and Qiuyu Wang

Life Science School, Liaoning University, Shenyang 110036, Liaoning, China

Due to their potential application as novel antibiotics, antimicrobial peptides are attracting much attention. Large quantities of highly purified peptides are crucial to basic and clinical studies. Natural resources of antimicrobial peptides are limited and hard to purify, chemical synthesis is of high-cost and unstable, so recombinant expression of antimicrobial peptides is a cost-effective way. Escherichia coli has been the most widely used as host to expressantimicrobial peptides with fusion protein, which can not only avoid the lethal effect towards the host, but also protect the peptide from degradation by proteases. Combined with our research, the present article reviews the progress of fusion vector, cleavage methods and optimization options for antimicrobial peptides production with fusion protein in Escherichia coli.

antimicrobial peptides, carrier protein, fusion expression, cleavage methods, condition optimizing

October 10, 2013; Accepted: November 21, 2013

Qiuyu Wang. E-mail: qiuyuwang@lnu.edu.cn

張學敏, 金莉莉, 王錚, 等. 抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達. 生物工程學報, 2014, 30(8): 1172?1181.

Zhang XM, Jin LL, Wang Z, et al. Fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli. Chin J Biotech, 2014,30(8): 1172?1181.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31071916), Project of Shenyang Science and Technology Plans (No. F12-277-1-40).

國家自然科學基金 (No. 31071916)，沈陽市科技計劃項目 (No. F12-277-1-40) 資助。

時間：2013-12-17 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131217.1121.003.html