李衍常，高媛，徐忠偉，蘭秋艷,2，徐平,2

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206

2 武漢大學(xué)藥學(xué)院 組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430072

蛋白質(zhì)組學(xué)在去泛素化酶研究中的應(yīng)用

李衍常1，高媛1，徐忠偉1，蘭秋艷1,2，徐平1,2

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206

2 武漢大學(xué)藥學(xué)院 組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，湖北 武漢 430072

李衍常, 高媛, 徐忠偉, 等. 蛋白質(zhì)組學(xué)在去泛素化酶研究中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(9): 1341?1350.

Li YC, Gao Y, Xu ZW, et al. Application of proteomics in deubiquitinases research. Chin J Biotech, 2014, 30(9): 1341?1350.

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)特異性降解的主要途徑，參與并調(diào)控細(xì)胞周期、免疫應(yīng)答、信號傳遞和DNA修復(fù)等真核生物體內(nèi)幾乎所有的生命活動。去泛素酶的存在使泛素化修飾成為可逆過程，保證了泛素系統(tǒng)及其相關(guān)生理過程的動態(tài)平衡，其表達(dá)紊亂也是誘發(fā)多種疾病的主要原因。對去泛素化酶進(jìn)行系統(tǒng)、全面的研究是理解其作用機(jī)制并將其作為治療藥物靶點(diǎn)的前提。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為系統(tǒng)深入研究去泛素化酶提供了條件，特別是在去泛素化酶的相互作用網(wǎng)絡(luò)和底物特異性研究等方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用。因此，文中結(jié)合課題組研究工作，對去泛素化酶的分類及功能進(jìn)行介紹并總結(jié)了蛋白質(zhì)組學(xué)在去泛素化酶研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，去泛素化酶，蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白質(zhì)相互作用，質(zhì)譜

泛素(Ubiquitin, Ub)是一種含76個氨基酸，序列高度保守且廣泛存在于真核生物中的小分子蛋白[1-3]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng) (Ubiquitinproteasome system, UPS) 作為真核生物內(nèi)特異、高效并依賴能量的蛋白質(zhì)降解途徑，參與了細(xì)胞周期調(diào)控、免疫應(yīng)答、信號傳遞和DNA修復(fù)等眾多重要的生命活動[4-7]。2004年，以色列科學(xué)家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美國科學(xué)家Irwin Rose因發(fā)現(xiàn)泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑而獲得諾貝爾化學(xué)獎。

泛素修飾是可逆過程，去泛素化酶(Deubiquitinase, DUB) 的存在保證了UPS及其相關(guān)生理過程的動態(tài)平衡穩(wěn)定[4,8-11]。目前已知酵母存在約20種DUB，人類存在約100種DUB。根據(jù)結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，DUB可分為5大類，參與了泛素生成、修剪、回收和底物保護(hù)等多個過程[8]。DUB底物特異性主要表現(xiàn)為泛素鏈形式 (Met1-linear fusion，K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)[12]的特異性和底物蛋白的特異性。如何系統(tǒng)研究眾多DUB的特異性及其調(diào)控規(guī)律已經(jīng)成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)，也是難點(diǎn)。由于DUB是導(dǎo)致多種疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，因此開發(fā)DUB特異性的抑制劑來調(diào)控其在代謝通路中的功能為藥物開發(fā)提供了新思路。

目前，以質(zhì)譜技術(shù)(Mass spectrometry，MS)為代表的蛋白質(zhì)組學(xué) (Proteomics) 在系統(tǒng)揭示生命過程和解釋基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[13-15]。隨著高分辨率質(zhì)譜的迅猛發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)深度測序和精確定量技術(shù)在UPS研究中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢并呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢頭。2010年國際首屆蛋白質(zhì)組學(xué)與泛素相關(guān)會議PPDUP (Proteomics of protein degradationand ubiquitin pathways) 在加拿大溫哥華舉行[16-17]。同樣，蛋白質(zhì)組學(xué)在DUB的相互作用網(wǎng)絡(luò)研究和抑制劑的開發(fā)等方面也取得了眾多成果。因此，本文將結(jié)合實(shí)驗室的研究工作，對DUB進(jìn)行簡要介紹并總結(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)在DUB研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 去泛素化酶介紹

1.1 去泛素化酶的分類

根據(jù)催化機(jī)制，蛋白酶 (Protease) 包含天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和金屬蛋白酶5大類[18]。DUB也屬于蛋白酶，主要包括半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶2種。目前從酵母和人類中分離鑒定出了多種DUB，基于其結(jié)構(gòu)相似性和可能的作用機(jī)制，主要分為泛素羧基末端水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolase, UCH)、泛素特異性蛋白酶 (Ubiquitin-specific protease，USP)、卵巢腫瘤蛋白酶(Otubain protease，OTU)、Machado-Joseph disease蛋白酶 (MJD) 和MPN(+)/JAMM蛋白酶 (JAMM)五種類型，其中前4種屬于半胱氨酸蛋白酶，JAMM為金屬類蛋白酶。

1.1.1 泛素羧基末端水解酶 (Ubiquitin C-terminal hydrolase, UCH)

UCH是最早被發(fā)現(xiàn)和表征的DUB。已知酵母中為YUH1，人類中的4個DUB分別是UCHL1、UCHL3、UCHL5和BAP1。UCH通過裂解C末端76位甘氨酸，將泛素分子從底物蛋白上釋放出來。研究顯示該類DUB底物偏好分子量較小的底物蛋白 (20–30氨基酸)[9]。UCH活性位點(diǎn)上的狹窄裂隙和環(huán)狀結(jié)構(gòu)直徑的限制在一定程度上起到了特異性識別小分子底物的功能[19]。UCH主要功能是將未成熟的串聯(lián)泛素前體或者泛素-核糖體蛋白復(fù)合物進(jìn)行修剪得到成熟的泛素。文獻(xiàn)報道YUH1不僅在泛素生成過程中發(fā)揮作用，還特異性地對類泛素NEDD8/RUB1的生成起調(diào)控作用[20]。UCHL1特異性存在于神經(jīng)元中，其活性與神經(jīng)性疾病帕金森癥 (Parkinson’s disease，PD) 有關(guān)[21-23]。

1.1.2 泛素特異性蛋白酶 (Ubiquitin-specific protease，USP)

USP家族是目前已知的去泛素化酶中成員最多且結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類。已知酵母中為16個，人類約為60個USP。這些酶分子都含有兩個短而保守的催化片段，即半胱氨酸盒和組氨酸盒，其中的催化三聯(lián)殘基 (半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸) 能將泛素分子從底物蛋白上移除[24]。研究顯示在進(jìn)化進(jìn)程上USP和E3的數(shù)目呈現(xiàn)出一致性增加，提示兩者在功能上存在一定的聯(lián)系[23]。該類DUB中研究較多的如USP7/HAUSP、USP2和USP28等。USP7通過對E3酶MDM2和p53的去泛素化作用，使p53處于動態(tài)平衡，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用[19,25-27]。USP28在結(jié)腸癌患者與乳腺癌患者體內(nèi)過量表達(dá)，它通過抑制SCF-Fbxw7連接酶的泛素化活性來穩(wěn)定cyclin E1蛋白和c-Myc蛋白[28]。

1.1.3 卵巢腫瘤蛋白酶 (Otubain protease，OTU)

OTU是根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測，最早在果蠅卵巢內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類DUB[29]。酵母中有2個OTU，分別為OTU1和OTU2；人類中約有14個OTU。該家族也具有由三聯(lián)催化活性位點(diǎn)組成的核心結(jié)構(gòu)域，與UBP家族蛋白在結(jié)構(gòu)上有很大相似性，并且已證明能起到去泛素化的作用。該類DUB中研究較多的有Cezanne、A20和VCIP135等。它們分別參與了NF-κB信號通路調(diào)控、有絲分裂中高爾基體重組等重要的生命過程[29]。

1.1.4 Machado-Joseph disease蛋白酶 (MJD)

MJD同樣是基于生物信息學(xué)預(yù)測鑒定的，含有一個稱為Josephin結(jié)構(gòu)域的DUB[30]。目前有去泛素化酶活性的MJD只有Ataxin-3，而其他經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)的可能的MJD也含有保守的催化核心，但實(shí)驗發(fā)現(xiàn)催化活性很低。在酵母內(nèi)還沒有MJD的報道。目前已發(fā)現(xiàn)Ataxin-3可以水解泛素化溶菌酶，還可以與去泛素化酶抑制劑Ubal結(jié)合[30-31]。

1.1.5 MPN(+)/JAMM蛋白酶 (JAMM)

JAMMs是金屬類蛋白酶。酵母的RPN11和哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的POH1為其典型代表，都是構(gòu)成26S蛋白酶體的重要組成部分[9,32]。其催化中心包括兩個保守的組氨酸殘基和天冬氨酸殘基以及二價鋅離子。其他重要的JAMM還有AMSH和BRCC36等，主要參與調(diào)控胞吞和細(xì)胞周期檢測點(diǎn)等過程[33-34]。

1.2 去泛素化酶功能介紹

DUB利用其催化核心表面的親核基團(tuán) (半胱氨酸) 來攻擊泛素的羧基末端，通過裂解切斷泛素鏈與底物蛋白之間的連接或者泛素鏈之間的連接，使泛素分子從泛素化蛋白底物上或蛋白酶體降解底物中脫離出來，重新進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)蛋白調(diào)節(jié)的循環(huán)中。

1.2.1 去泛素化酶調(diào)控過程

DUB參與了UPS發(fā)生反應(yīng)的的各個環(huán)節(jié)，包括：①泛素前體處理；②回收錯誤連接到親核試劑如谷胱甘肽上的泛素；③編輯或拯救待降解的泛素化蛋白；④拆卸非錨定的游離泛素鏈，回收泛素。具體過程如圖1所示[8]。

上述每個過程都有多種特定的DUB參與，這體現(xiàn)了其分工明確又互相協(xié)調(diào)的作用特點(diǎn)。在泛素前體加工和成熟過程中，UCH類的DUB發(fā)揮了重要作用[8,21]。在編輯或者拯救待降解蛋白方面，大量的DUB特異性地參與了多種代謝通路，體現(xiàn)出了DUB對泛素鏈或者底物的特異性。如USP7特異性地參與了p53和MDM2 (p53的E3) 的去泛素化過程，以陰陽協(xié)調(diào)的方式來實(shí)現(xiàn)對p53的調(diào)控[10,25]。對于游離的非錨定泛素鏈的回收，Wilkinson研究團(tuán)隊[7,35]系統(tǒng)揭示了IsoT (Isopeptidase)在該過程的作用。在酵母中與IsoT同源的DUB是UBP14，我們的研究結(jié)果同樣顯示UBP14對游離的泛素鏈的特異性現(xiàn)象，同時發(fā)現(xiàn)UBP14對不同鏈接形式存在一定的偏好性 (另文發(fā)表)。

圖1 去泛素化酶參與泛素加工的過程[8]Fig. 1 DUB involved in the ubiquition processing[8].

1.2.2 去泛素化酶與疾病關(guān)聯(lián)

由于UPS參與調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)多種生命過程，其表達(dá)紊亂會引起人體內(nèi)的多種病理改變，比如癌癥、神經(jīng)退行性病變以及免疫功能紊亂等。由于DUB參與了泛素降解過程的各個環(huán)節(jié)，作為致癌或抑癌E3連接酶的直接抑制物，同樣也可以作為抗癌治療的作用靶點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)DUB參與并調(diào)控了眾多疾病，如表1所示。

表1 去泛素化酶與疾病之間的關(guān)系Table 1 The relationship between DUB and diseases

目前，以UPS內(nèi)的多種酶 (主要是E3、DUB和Proteasome) 為靶點(diǎn)，開發(fā)了一系列的診斷及治療方法來檢測或治療腫瘤。比如已經(jīng)成功上市的蛋白酶體抑制劑硼替佐米 (Bortezomib，商品名Velcade)，可以用來治療多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)腫瘤。其作用機(jī)制是可逆性地抑制26S蛋白酶體活性位點(diǎn)，阻止NF-κB抑制劑被蛋白酶體降解來發(fā)揮抗癌作用[36]。Velcade的成功帶動了一大批蛋白酶體抑制劑的研發(fā)，突出的例子有PR-171、NPI-0052和CEP-18770等[44]。同樣，對UPS起重要調(diào)控作用的DUB，也可以作為眾多疾病的治療靶點(diǎn)。因此，開發(fā)針對不同DUB的特異性抑制劑可能是研究信號途徑調(diào)控和疾病分子機(jī)制的重要手段。如果能夠在整體水平上系統(tǒng)研究DUB的作用機(jī)制、底物特異性以及生物學(xué)效應(yīng)，將會為我們選擇特定的DUB進(jìn)行特異性抑制劑的篩選研究提供佐證。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在去泛素化酶研究中的應(yīng)用

經(jīng)過近20年的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中的重要力量。目前，對蛋白質(zhì)組的深度測序、精確定量以及生物學(xué)功能研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展的主流[13,15]。高效液相色譜的分辨能力和高精度質(zhì)譜的快速鑒定能力極大地促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展[13,45-48]，各種定量策略的開發(fā)提高了相對定量和絕對定量的應(yīng)用范圍和定量精度[46-47]。同時，有效的蛋白質(zhì)翻譯后修飾富集策略為蛋白質(zhì)組的功能研究打下堅實(shí)的基礎(chǔ)[49-50,54]。

蛋白質(zhì)組學(xué)在UPS的位點(diǎn)鑒定、泛素鏈修飾形式以及底物特異的研究中發(fā)揮著重要的作用。泛素親和結(jié)構(gòu)域 (Ubiquitin binding domain，UBD)[50-52]和K-εGG抗體[53-54]的開發(fā)使泛素化位點(diǎn)的鑒定突飛猛進(jìn)。利用質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測技術(shù) (Selected-reaction monitoring，SRM) 實(shí)現(xiàn)了對不同泛素鏈連接形式的鑒定與絕對定量[12,55]。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)在泛素相關(guān)研究中的應(yīng)用還包括相互作用蛋白的鑒定和特定通路中泛素化底物的篩選等諸多方面[49-54]。

2.1 去泛素化酶的相互作用組

2009年，Sowa等[56]在Cell雜志上發(fā)表了系統(tǒng)研究人類75個DUB的功能和相互作用蛋白鑒定的工作。作者將75個DUB分別構(gòu)建到帶有FLAG-HA (血凝素) 標(biāo)記的質(zhì)粒上，然后轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞內(nèi)，在非變性條件下親和純化，利用LC-MS/MS技術(shù)系統(tǒng)分析鑒定不同DUB的相互作用蛋白。為了得到高可信的相互作用蛋白，他們還開發(fā)了生物信息軟件ComPASS來區(qū)分非特異性背景蛋白或者污染物。該研究鑒定到了774個高可信的相互作用蛋白質(zhì)。通過對鑒定的相互作用蛋白質(zhì)的功能分析，發(fā)現(xiàn)DUB及其相互作用蛋白參與了蛋白質(zhì)降解、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的降解等生物過程。該工作利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法第一次系統(tǒng)地揭示了DUB在人體內(nèi)的系統(tǒng)分布和相互作用關(guān)系，為后續(xù)深入研究DUB的功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了依據(jù)和方向。

除此之外，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定DUB相互作用蛋白的研究還有很多[57-61]。Xie等[57]利用iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) 試劑分別標(biāo)記SMURF1正常組和過表達(dá)組，定量比較分析SMURF1相關(guān)的蛋白復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)了與其有密切相互作用的去泛素化酶FAM/USP9X。該去泛素化酶能夠拮抗SMURF1自身的泛素化修飾從而保護(hù)SMURF1不被蛋白酶體降解。Gomez-Ferreria等[58]利用親和純化技術(shù)得到CEP192相互作用蛋白，通過在線液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定到其與K63特異的去泛素化酶CYLD存在相互作用。在敲除CYLD和CEP192的細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了有絲分裂的紡錘絲生成受抑制的現(xiàn)象，提示了CEP192通過去泛素化酶CYLD在紡錘絲合成中的重要作用。

2.2 去泛素化酶底物特異性鑒定

DUB底物的特異性主要表現(xiàn)在泛素鏈形式的特異性和底物蛋白的特異性，亦或兩者的結(jié)合[7]。質(zhì)譜技術(shù)在系統(tǒng)鑒定蛋白和識別各種泛素鏈連接形式具有獨(dú)特優(yōu)勢，因此蛋白質(zhì)組學(xué)為系統(tǒng)研究DUB與底物之間的特異性關(guān)系提供了條件。

Mevissen等[59]在Cell雜志上發(fā)表了系統(tǒng)評估16個OTU家族DUB與泛素鏈之間的特異性關(guān)系的工作。通過結(jié)合質(zhì)譜鑒定泛素鏈組成的數(shù)據(jù)(未發(fā)表，E. Bennett，University of California, San Diego)，利用體外反應(yīng)實(shí)驗證明了OTU家族與泛素鏈之間的特異性關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)OTU結(jié)構(gòu)域上S1’和S2泛素結(jié)合位點(diǎn)決定了OTU家族區(qū)分不同泛素鏈形式的特異性。Fiil等[60]利用SILAC (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture) 定量策略，親和純化Met1-ub相關(guān)蛋白，實(shí)驗揭示了OTU家族去泛素化酶抑制泛素線性連接形式 (Met1-Ub) 的聚集，同時通過親和純化線性泛素鏈鑒定到RIPK2是NOD2 (Nucleotideoligomerization domain-containing protein 2) 相關(guān)的主要底物，證明了OTU去泛素化酶能夠抑制Met1-Ub在RIPK2的聚集，從而證實(shí)了OTU家族去泛素化酶通過去除底物NOD2上的線性泛素連接形式來調(diào)控免疫反應(yīng)，并抵抗炎癥信號。同樣，我們利用SILAC定量技術(shù)和質(zhì)譜SRM技術(shù)系統(tǒng)研究酵母內(nèi)不同DUB對泛素鏈形式的特異性，也發(fā)現(xiàn)該DUB對不同鏈接形式存在一定的偏好性 (另文發(fā)表)。

除了對泛素鏈形式的特異性選擇外，特定代謝通路中DUB特異性底物的鑒定也同樣可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究。如Debelyy等[61]利用凝膠電泳分離和質(zhì)譜鑒定技術(shù)分析了過氧化物酶體的組成，發(fā)現(xiàn)去泛素化酶UBP15能夠特異性與其發(fā)生相互作用。通過體外驗證實(shí)驗證明了UBP15能夠特異性識別PEX5 (Peroxisomal targeting sequence receptor, Pex5p)，并在PEX5從過氧化物酶體重新返回細(xì)胞質(zhì)的過程中發(fā)生去泛素化作用。本實(shí)驗室同樣開展了利用LC-MS/MS質(zhì)譜平臺系統(tǒng)鑒定DUB底物的工作，試圖通過系統(tǒng)鑒定不同DUB底物蛋白來揭示DUB與底物蛋白的特異性關(guān)系 (另文發(fā)表)。

2.3 基于化學(xué)方法的DUB功能的蛋白質(zhì)組學(xué)

2002年，Borodovsky等[62]結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和化學(xué)技術(shù)發(fā)展了一種“基于化學(xué)的功能蛋白質(zhì)組學(xué)”(Chemistry-based functional proteomics)的方法，來鑒定DUB及其相互作用蛋白。他們開發(fā)了一種稱為HA-Ub-derived probe的功能探針。該探針是在N端含紅細(xì)胞凝集素標(biāo)簽(Hemagglutinin-tag, HA-tag)的Ub，C末端再帶上一個半胱氨酸反應(yīng)基團(tuán)。該反應(yīng)基團(tuán)能與DUB共價結(jié)合，并固定特異目的蛋白。最后經(jīng)抗HA瓊脂糖介質(zhì)分離后利用質(zhì)譜鑒定獲取的蛋白質(zhì)。該方法成功鑒定了24種DUB，還找到19種可能與DUB相互作用的蛋白。同樣，Hemelaar等[63]利用該方法發(fā)現(xiàn)了包含OTU結(jié)構(gòu)域的DUB，并用來評估DUB的活性。如果結(jié)合現(xiàn)在已有的高精度蛋白質(zhì)組學(xué)平臺，這種活性探針策略可在DUB發(fā)現(xiàn)及其相互作用蛋白研究方面發(fā)揮更大的作用。

2.4 去泛素化酶抑制劑

正如前文所述，開發(fā)關(guān)于DUB的抑制劑能夠為我們更好地研究DUB在代謝通路中的功能提供利器。如何將抑制劑開發(fā)成藥物也是科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)[18,64-68]。Altun等[67]基于活性-化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué) (Activity-based chemical proteomics)來鑒定和選擇能夠?qū)μ囟―UB存在抑制活性的抑制劑。他們選取了小分子廣譜DUB抑制劑PR-619為對照，利用無標(biāo)定量 (Label-free quantification) 的方法來評估P22077對各種DUB的抑制情況，發(fā)現(xiàn)其對USP7存在特異性的抑制效應(yīng)。由于USP7在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，因此該抑制劑具有進(jìn)一步發(fā)展為癌癥治療藥物的潛力。

2012年，Perry等[68]借助質(zhì)譜確定了蛋白酶體相關(guān)去泛素化酶USP14為抑制劑WP1130的作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)使用DUB抑制分子WP1130能顯著抑制Norwalk病毒在鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。因此，我們發(fā)現(xiàn)通過使用特殊的DUB抑制劑可以特異地阻滯特定病毒感染，為抗病毒治療提供新靶點(diǎn)。

3 前景與展望

綜上所述，UPS內(nèi)的DUB涉及到許多重要的生理過程和部分疾病與腫瘤的發(fā)生。因此研究針對DUB關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的調(diào)控成為抗癌治療的重點(diǎn)。借鑒抗癌藥物Velcade抑制蛋白酶體活性的思路，可為基于重要DUB作為靶點(diǎn)的抗癌藥物開發(fā)提供思路。為實(shí)現(xiàn)這個目標(biāo)，要對DUB的功能及其在生物體內(nèi)復(fù)雜的動態(tài)過程的作用進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。因此，將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到DUB的研究中顯得特別重要。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組的深度測序和精確定量已經(jīng)成為可能。因此，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以對DUB及其相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深度覆蓋和精確定量，系統(tǒng)闡釋DUB的功能與疾病調(diào)控機(jī)制。利用功能化的蛋白質(zhì)組學(xué)來揭示DUB底物特異性，更多地發(fā)現(xiàn)可能的DUB調(diào)控規(guī)律與特點(diǎn)，通過開發(fā)特異的DUB抑制劑還可為研究USP相關(guān)疾病的治療提供新的技術(shù)手段。

REFERENCES

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Application of proteomics in deubiquitinases research

Yanchang Li1, Yuan Gao1, Zhongwei Xu1, Qiuyan Lan1,2, and Ping Xu1,2
1 Beijing Institute of Radiation Medicine, State Key Laboratory of Proteomics, National Center for Protein Sciences Beijing, Beijing Proteome Research Center, National Engineering Research Center for Protein Drugs, Beijing 102206, China
2 Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Wuhan University), Ministry of Education, and Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan 430072, Hubei, China

As the major pathway mediating specific protein degradation in eukaryotes, ubiquitin-proteasome system (UPS) is involved in various physiological and pathological processes such as cell cycle regulation, immune response, signal transduction and DNA-repair. Deubiquitinases (DUB) maintain the balance of UPS and related physiological processes via reversibly removing ubiquitin from the covalently modified protein substrates, which have been implicated in various disease processes in case of their imbalance expression. Because DUB plays critical regulating roles in the UPS pathway, they may be also the ideal drug targets for severe and intractable human diseases, such as cancer and neurodegenerative disease. With the rapid development of proteomic technology, systematical investigation of specific substrates and interacting proteins of varied DUB via mass spectrometry approach may shed light on these DUB’s biological function and regulating roles in the physiological and pathogenic states. In this review, we briefly introduce the characteristics of DUB and summarize the recent application and progresses of proteomics in DUB research.

ubiquitin-proteasome system, deubiquitinase, proteomics, interactome , mass spectrometry

December 23, 2013; Accepted: February 10, 2014

Ping Xu. Tel: +86-10-83147777-1314; Fax: +86-10-80705155; E-mail: xupingghy@gmail.com

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2011CB910600, 2013CB911200), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. SS2012AA020502, 2011AA02A114), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31070673, 31170780), Beijing Natural Science Foundation (No. 5112012), Foundation of State Key Lab of Proteomics (No. SKLP-Y201102).

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)發(fā)展研究計劃 (973計劃) (Nos. 2011CB910600，2013CB911200)，國家高技術(shù)發(fā)展計劃 (863計劃) (Nos. SS2012AA020502, 2011AA02A114)，國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31070673, 31170780)，北京市自然科學(xué)基金 (No. 5112012), 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室基金 (No. SKLP-Y201102) 資助。

Received: December 23, 2013; Accepted: February 10, 2014

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (Nos. 2011CB910600, 2013CB911200), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. SS2012AA020502, 2011AA02A114), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31070673, 31170780), Beijing Natural Science Foundation (No. 5112012), Foundation of State Key Lab of Proteomics (No. SKLP-Y201102).

Corresponding author: Ping Xu. Tel: +86-10-83147777-1314; Fax: +86-10-80705155; E-mail: xupingghy@gmail.com

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