馮永懷，吳柳松，方寧，馮子芳，陳琦

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴州遵義 563003)

髓性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面CD40、CD40L的表達(dá)及其意義

馮永懷，吳柳松，方寧，馮子芳，陳琦

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴州遵義 563003)

目的研究共刺激分子CD40、CD40L在人急、慢性髓性白血病治療前后骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面的表達(dá)特點(diǎn)，探討其與臨床療效的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)了37例急性髓性白血病及20例慢性髓性白血病患者治療前后骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD40L的表達(dá)。另取8例健康人骨髓作為正常對(duì)照組。結(jié)果①治療前急性髓性白血病(AML)患者中，除急性早幼粒細(xì)胞白血病(M 3)外，CD40表達(dá)均低于正常對(duì)照組(P＜0.05)；②治療后完全緩解(CR)和部分緩解(PR)患者CD40較其治療前顯著增高(P＜0.05)，CR患者接近對(duì)照者，而未緩解(NR)患者CD40的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；③CD40在慢性粒細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞上的表達(dá)與正常對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；④所有急、慢性髓性白血病患者及正常對(duì)照骨髓單個(gè)核細(xì)胞上的CD40L均存在表達(dá)缺陷，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論CD40是參與急性髓性白血病(AML)發(fā)病和抗白血病免疫反應(yīng)的重要共刺激分子，其表達(dá)與白血病分化程度及分型有關(guān)，CD40表達(dá)異?？赡苁茿ML發(fā)病機(jī)制之一，且與臨床療效密切相關(guān)；調(diào)節(jié)單個(gè)核細(xì)胞上CD40的表達(dá)，糾正AML白血病患者細(xì)胞免疫功能缺陷，可能是免疫基因治療人類急性髓性白血病的重要手段之一，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

髓性白血病；單個(gè)核細(xì)胞表面；CD40；CD40L

CD40-CD40L是繼B7-CD28后發(fā)現(xiàn)的又一重要的共刺激信號(hào)。CD40/CD40L交聯(lián)可活化NF-KB，進(jìn)而激活磷酸酪氨酸激酶(PTK)和絲氨酸激酶，促進(jìn)B細(xì)胞存活、增殖、分化。此外，二者交聯(lián)可增加Fas表達(dá)，促進(jìn)Fas介導(dǎo)的凋亡，上調(diào)共刺激因子MHCII、CD58、CD80/CD86的表達(dá)，這使得CD40-CD40L參予的雙向T-B合作在腫瘤免疫中起著重要作用[1]。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)了臨床常見各型白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD40L的表達(dá)情況，并與正常健康對(duì)照骨髓單個(gè)核細(xì)胞相比較，以期為sCD40L用于靶向治療白血病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2007年1月至2009年2月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的急性骨髓性白血病(AML)患者(初治或復(fù)治)37例(男性16例，女性21例)，中位年齡34(14～68)歲，按FAB分型，并于北京海思特檢驗(yàn)中心及我院流式細(xì)胞工程室進(jìn)行免疫分型，其中急性早幼粒細(xì)胞白血病(M 3)10例，急性單核細(xì)胞白血病(M 5)15例，急性粒細(xì)胞白血病部分分化型(M 2)6例，其他類型AML(M-other)6例[(包括急性粒細(xì)胞白血病未分化型(M 1)、急性粒單核細(xì)胞伴嗜酸性粒細(xì)胞增多(M 4EO)、急性巨核細(xì)胞性白血病(M 7)各2例)]。均經(jīng)常規(guī)聯(lián)合化療，療效標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]。其中，完全緩解(CR)18例，部分緩解(PR)12例，未緩解(NR)7例。慢性粒細(xì)胞白血病組(CML)20例初診慢性期患者，男性12例，女性8例，中位年齡34(24～60)歲，Ph染色體均陽性。正常對(duì)照組8例，男性7例，女性1例，中位年齡30(19～35)歲，均為健康自愿者的正常骨髓。

1.2 試劑與儀器用于免疫分型的相關(guān)單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗人CD40L單抗、FITC標(biāo)記的抗人CD40單抗及同型對(duì)照購自BD/Pharm ingen公司。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞表面CD40、CD40L的檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)直接免疫熒光標(biāo)記法參照此前本研究小組操作方法[3]，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，與對(duì)照抗體比較。結(jié)果用熒光閾值強(qiáng)度計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。用Facscalibur cellquest軟件分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用SPSS16.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，各組患者與正常對(duì)照組的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40、CD40L的表達(dá)37例AML及20例CML患者CD40有不同程度的表達(dá)，前者與正常對(duì)照組相比較，其表達(dá)低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而后者與正常對(duì)照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；所有受測(cè)白血病患者與健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面CD40L表達(dá)均缺陷，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 髓性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40、CD40L的表達(dá)(%，±s)

表1 髓性白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40、CD40L的表達(dá)(%，±s)

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別AML組CML組正常對(duì)照組CD40L 1.057±2.434 1.106±1.667 0.696±0.883例數(shù)37 20 8 CD401.549±2.771a3.793±3.220 6.875±4.124

2.2 各型AML骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40、CD40L的表達(dá)對(duì)不同類型的AML進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)M 2、M 5組CD40表達(dá)均低于正常對(duì)照(P＜0.05)，M 3組CD40存在一定表達(dá)，與正常對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；M-other組(包括M 1、M 4EO、M 7各2例)其CD40表達(dá)低于正常對(duì)照(P＜0.05)。CD40L在各型AML的表達(dá)均較低，與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 各型AM L骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40、CD154的表達(dá)(%，±s)

表2 各型AM L骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40、CD154的表達(dá)(%，±s)

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別例數(shù)CD40CD40L M 3組M 5組M 2組其他類型AML正常對(duì)照組10 15 668 4.1258±2.97 1.555±2.459a0.182±0.153a0.443±0.060a6.875±4.100 1.222±1.127 1.430±0.328 0.628±1.369 0.302±0.319 0.696±0.883

2.3 化療前后AML骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40、CD40L的表達(dá)治療后CR和PR患者CD40較其治療前顯著增高(P＜0.05)，CR患者接近對(duì)照者，而NR患者CD40的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CD40L在各組AML中的表達(dá)均較低，與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 化療前后AM L骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40和CD40L的表達(dá)(%，±s)

表3 化療前后AM L骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD40和CD40L的表達(dá)(%，±s)

注：與化療前組比較，aP＜0.05。

組別CR組PR組NR組化療前組0.687±1.506 0.890±1.089 1.342±1.430 1.057±2.434 18 12 7 37 6.409±2.012a4.024±1.010a1.232±1.706 1.549±2.771 CD40L例數(shù)CD40

3 討論

CD40是NGFR超家族成員，也屬于腫瘤壞死家族成員之一，可在多種細(xì)胞表達(dá)。CD40L即CD40配體，屬于TNF超家族成員，與CD40分子相互作用，在腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞、免疫應(yīng)答反應(yīng)和細(xì)胞的增殖調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用[4]。sCD40L具有抗腫瘤效應(yīng)，主要是在胃癌、肺癌等實(shí)體瘤方面研究較多。Li等[5]研究表明體外培養(yǎng)的胃癌AGS細(xì)胞株高表達(dá)CD40，利用激發(fā)型抗CD40單克隆抗體活化CD40信號(hào)可抑制AGS細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且顯著提高了其對(duì)化療藥物的敏感性。陳文學(xué)等[6]研究發(fā)現(xiàn)sCD40L對(duì)高表達(dá)CD40信號(hào)分子的肺癌A594細(xì)胞株的生長(zhǎng)有顯著地抑制作用，提示sCD40L對(duì)高表達(dá)CD40分子的腫瘤細(xì)胞可能有一定的抗腫瘤作用。此外，sCD40L在血液系統(tǒng)疾病的研究也發(fā)現(xiàn)，AML患者化療后血漿sCD40L水平較化療前升高[7]。李杰等[8]的研究發(fā)現(xiàn)sCD40L可明顯抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞的增值，其抗白血病的機(jī)制可能與上調(diào)CD95、下調(diào)BCL-2相關(guān)。

研究表明，白血病細(xì)胞可能由于存在HLA抗原及協(xié)同刺激分子的表達(dá)缺陷，而不能激發(fā)有效的T細(xì)胞應(yīng)答[9]，而AL患者的白血病細(xì)胞常高表達(dá)MHC[10]，所以其表面缺乏協(xié)同刺激分子的表達(dá)可能才是AL產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸的主要原因。

關(guān)于CD40、CD40L共刺激分子在AL的表達(dá)水平，我們的前期研究表明急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)單個(gè)核細(xì)胞表面CD40、CD40L表達(dá)缺陷[3]。而急性髓性白血病(AML)各家報(bào)道不一，朱芳兵等[11]報(bào)道AML中相當(dāng)一部分存在CD40的陽性表達(dá)(37%/52%)，其中M 5的陽性率最高，高于其他AML亞型，并指出AML的臨床血液學(xué)特征與CD40表達(dá)存在相關(guān)性。而我們的結(jié)果顯示在初診白血病患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞上，CD40除了在ALL單個(gè)核細(xì)胞表面表達(dá)缺陷[3]，在除了M 3以外的AML表達(dá)也都是低于正常對(duì)照組。CD40和CD40L表達(dá)各家報(bào)道不一，除了與各家制定的陽性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)不同，采用的正常對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)不同，以及共刺激分子的在標(biāo)本采集時(shí)機(jī)不同以外[12]，不同類型或亞型白血病細(xì)胞上共刺激分子的表達(dá)本身亦存在一定異質(zhì)性可能也是一個(gè)主要原因。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，CD40在AL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面表達(dá)缺如，這導(dǎo)致CD40-CD40L共刺激信號(hào)中斷，致使T細(xì)胞無法識(shí)別TCR抗原，CTL就無法對(duì)白血病細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別及殺傷。此外其他共刺激分子如B7、粘附分子如ICAM-1的表達(dá)以及IL-12、INF-γ等效應(yīng)性細(xì)胞因子的分泌都會(huì)因CD40的表達(dá)缺乏而受到影響，從而使機(jī)體抗白血病免疫防御能力下降。CD40-CD40L因?yàn)榕c凋亡相關(guān)基因如survivine、c-myc、hTERT等有著密切的聯(lián)系，還可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[13]，CD40-CD40L信號(hào)途徑的中斷勢(shì)必由此影響白血病細(xì)胞的凋亡。

CD40-CD40L配基化作用的下游信號(hào)可能參與抗凋亡基因survivinmRNA的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)認(rèn)為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAFs)是介導(dǎo)CD40分子信號(hào)傳遞的中心分子，其中活化的NF-κB能夠有效誘導(dǎo)Survivin基因表達(dá)。CD40表達(dá)缺陷可能由此影響白血病細(xì)胞凋亡程序參與CD40陰性表達(dá)AL的發(fā)生發(fā)展。AML-M 3及CM L存在一定數(shù)量的CD40表達(dá)，可能還與它具有相對(duì)獨(dú)立的發(fā)病機(jī)制，使AML細(xì)胞逃避更為復(fù)雜的免疫監(jiān)視有關(guān)。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，未治療的初診AML患者(除M 3外)，CD40表達(dá)缺陷，當(dāng)化療達(dá)完全緩解及部分緩解后，CD40的表達(dá)升高，表明CD40的檢測(cè)可能作為評(píng)估AML(除M 3外)療效的一項(xiàng)指標(biāo)。

我們的結(jié)果顯示健康對(duì)照組和各型白血病組骨髓單個(gè)核細(xì)胞表面CD40L的表達(dá)均為陰性，這與師帥帥等[14]的研究結(jié)果也存在差異，他們的研究表明部分白血病不僅單獨(dú)表達(dá)CD40，也合并表達(dá)CD40L，CD40與 CD40L與高白細(xì)胞計(jì)數(shù)、低血小板數(shù)、脾大等臨床表現(xiàn)有相關(guān)性。存在這樣的差異可能與CD40L主要表達(dá)在激活的T細(xì)胞，且表達(dá)具有瞬時(shí)性[15]有關(guān)。

目前除了骨髓移植及化療外，腫瘤免疫治療是白血病治療的另一主要努力方向。為設(shè)計(jì)高效的白血病免疫治療方案，可上調(diào)HLA抗原及協(xié)同刺激分子在白血病細(xì)胞表面的表達(dá)，從而提高白血病細(xì)胞的抗原遞呈能力。我們的初步研究表明CD40表達(dá)缺陷與AL白血病細(xì)胞的免疫逃逸可能有關(guān)，期望能對(duì)CD40陰性表達(dá)AL的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Expression of CD40,CD40L on mononuclear cells surface of myeloid leukemia and it sclinical significance.

FENG Yong-huai,WU Liu-song,FANGNing,FENG Zi-fang,CHEN Qi.Department of Hematology,the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College,Zunyi563003,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo study the expression characteristics of costimulatory molecules CD40and CD40L in bonemarrow mononuclear cells in human acute and chronicm yeloid leukem ia before and after the chemotherapy,and to explore their significance in antileukem ia immunity.MethodsThe expression of costimulatory molecules CD40and CD40L in bonemarrow mononuclear cellswasmeasured in 37 patientsw ith acutemyeloid leukem ia(AML group)and 20 patientsw ith chronicmyeloid leukem ia(CML group)before and after chemotherapy by immunofluorescence and FACS. TheResultswere compared w ith eight casesof healthy bonemarrow(the controlgroup).Results①The levelof CD40in AML group except forM 3 before chemotherapy was significantly lower than those in the controlgroup(P＜0.05).②The levelof CD40increased in complete rem ission(CR)and partial rem ission(PR)patientsafter chemotherapy compared w ith that before chemotherapy(P＜0.05).The level in CR patientswas close to that in the control.No significant change was found in nonrem ission(NR)patients(P＞0.05).③The level of CD40in CML patientswas close to that in the control,No significant changewas found in CML patients(P＞0.05).④Moreover,the CD40L are deficient in BMMC of all cases,including AML,CML and healthy volunteers(P＞0.05).ConclusionCD40are important costimulatorymolecules during the pathogenesis and antileukem ia immunity of AML.The level of CD40may be related to differentiated degree and classification ofmyeloid leukema.Their abnormal levelmay partly be responsible for the pathogenesis of AML and be closely related w ith the clinical curative effects.Itmay be one of importantmeans to treathuman acute myeloid leukem ia immunogenetically by regulating theexpression of CD40inmononuclear cellsand by correcting the immunodeficiency of AML patients.

M yeloid leukem ia;M ononuclear cell surface;CD40;CD40L

R733.7

A

1003—6350（2014）04—0523—03

2013-07-11)

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(編號(hào)：黔科合丁字[2006]2071號(hào))

陳琦。E-mail:zyfychenqi@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0201