杜玉清，張磊，孫學棟，顧文權，王彬

(上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院腫瘤介入科，上海 200125)

·論著·

HepaSphere微球聯(lián)合Avasting栓塞治療VX2兔肝癌的實驗研究

杜玉清，張磊，孫學棟，顧文權，王彬

(上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院腫瘤介入科，上海 200125)

目的探討HepaSphere微球聯(lián)合Avasting肝動脈栓塞治療兔移植性肝癌的療效。方法建立40只兔VX2肝癌模型，隨機分為四組，每組10只，A組：肝動脈灌注生理鹽水；B組：肝動脈灌注Avasting；C組：肝動脈HepaSphere栓塞；D組：肝動脈HepaSphere+Avasting栓塞。兩周后復查CT確定種植成功并計算瘤體大小，免疫組化方法檢測肝腫瘤血管內皮生長因子(VEGF)的表達和腫瘤微血管密度(MVD)。所得數(shù)據(jù)使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行處理，各組間比較采用q檢驗、χ2檢驗。結果腫瘤生長抑制D組明顯優(yōu)于其他組(P＜0.05)；VEGF的表達及MVD計數(shù)D組顯著低于其他組(P＜0.05)。結論HepaSphere微球聯(lián)合Aasting行兔肝動脈栓塞能抑制移植型肝癌的生長及肝內轉移，并對腫瘤組織的微血管和VEGF的表達具有顯著的抑制作用。

微球；Avasting；栓塞治療

經導管肝動脈化療栓塞術(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)目前已成為公認的治療不可切除性中晚期肝癌的首選療法，針對肝癌的富血管性及主要通過肝動脈獲取血供的特點，采用藥物與碘油乳化制成栓塞劑，阻塞腫瘤血供從而誘導腫瘤死亡，取得了明顯的治療效果，但其遠期療效仍不能令人滿意，肝癌TACE術后復發(fā)和轉移是療效欠佳的主要原因。肝癌TACE術后復發(fā)轉移的原因之一是栓塞劑不理想，不能達到真正的末梢及相對永久的栓塞；腫瘤血管形成為另一個主要原因[1-2]。如何做到腫瘤血管完全栓塞及抑制腫瘤新生血管是腫瘤研究的重點和發(fā)展方向[3]。本研究采用Aasting聯(lián)合HepaSphere微球行兔移植性肝癌肝動脈栓塞治療，探討HepaSphere微球的栓塞療效及局部藥物抑制腫瘤血管再生的作用，為進一步臨床應用研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選用新西蘭大白兔40只，雌雄不限，兔齡約3個月，體重2 kg，由復旦大學動物實驗室提供。VX2腫瘤瘤株：由普陀區(qū)中心人民醫(yī)院惠贈。Hepa-Sphere微球：丙烯酸鈉與乙烯醇的共聚物，由日本大阪KGT?？漆t(yī)院Hori教授惠贈。檢查設備：GE平板DSA(Innova3100)，東芝Aquilion one 320排螺旋CT掃描機、Philip Briliance16排螺旋CT掃描機。

1.2 VX2肝癌模型制作和實驗方法

1.2.1 VX2肝癌模型的建立兔術前禁食水12 h，以速眠新II(0.2m l/kg)肌注麻醉，完整取出荷瘤種兔腿外側瘤塊，泡于盛有生理鹽水的玻璃皿中，用眼科剪剪成約1mm3瘤塊備用；將健康實驗兔麻醉后，仰臥固定，兔腹脫毛消毒。選取肝左葉實質較厚處為接種部位，CT導向下將18G血管穿刺針刺入兔肝內，調整針尖部位，用13G骨穿針之平頭探子將穿刺針內容物推送入肝，反復推送2～3次。推送完畢退出穿刺針及平頭探子，局部壓迫1～2m in。

1.2.2 TAE治療VX2肝癌模型制作術后第14天，CT檢查確定瘤株種植成功后將實驗兔隨機分成四組(A、B、C、D組)，每組10只。實驗兔麻醉固定后，腹股溝區(qū)備皮、消毒、鋪巾，靠近腹股溝區(qū)沿股動脈縱行切開皮膚，暴露股動脈鞘，小心剪開股動脈鞘，分離出1～2 cm長的股動脈，近遠端分別用4#絲線穿過備用。提起近端絲線，保持適當張力以暫時阻斷血流，用眼科剪在股動脈前壁剪一小“V”形口，將短導絲插入，成功后將自制導管鞘順導絲插入股動脈并向近端送入約4 cm，結扎近端備用絲線以固定導管鞘。經鞘管引入3F微導管，尋找到腹腔動脈后行造影，確認肝固有動脈，超選擇性插管至肝左或肝右動脈進行造影，證實腫瘤染色后按照分組要求注入藥物。A組：生理鹽水；B組：5mg Avasting；C組：HepaSphere微球；D組：HepaSphere微球+5mg Avasting。術畢將導管撤至腹主動脈時推注青霉素80萬U，拔除導管及鞘管，并同時結扎股動脈近遠端，逐層縫合切口。

1.2.3 影像學評價CT平掃+增強掃描：VX2肝癌模型制作術后14 d、TACE術后14 d分別行CT平掃加增強，參數(shù)設置：100 kV、120mAs、層厚5mm、間距5mm、對比劑總量4～5m l、流速為1 m l/s。確定肝內腫瘤生長，測量腫瘤體積變化[V=ab2/2](a為腫瘤最大徑，b為腫瘤最小徑)，觀察腫瘤數(shù)量及腫瘤壞死情況。腫瘤壞死程度，按以下標準分為3度：腫瘤壞死＜50%為輕度壞死，壞死50%～90%為中度壞死，壞死＞90%為重度壞死。

1.2.4 病理及免疫組化檢查各組于治療后14 d CT掃描后處死所有VX2肝癌兔；摘取肝臟，先進行大體觀察，然后切取癌灶及其周圍肝組織，用4%甲醛將解剖標本浸泡、固定，常規(guī)石蠟包埋。盡量取與灌注掃描層面相同的切面切片，然后由病理科專職技術員作HE染色及MVD、VEGF免疫組化染色。由專職從事免疫組化檢查的病理學專家觀察MVD及VEGF表達情況，免疫組化檢查試劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。MVD及VEGF表達測定在400倍光學顯微鏡下取3個“感興趣區(qū)”(陽性細胞分布最密集的區(qū)域)，取其平均數(shù)為該病例的VEGF陽性染色細胞數(shù)。MVD記數(shù)參照Weidnert的評判標準，選擇3個高倍視野血管密度“感興趣區(qū)”區(qū)域，任何黃染的細胞或細胞簇即使未顯示管狀結構，只要和鄰近的微血管、腫瘤細胞或其他結締組織分開均計為1個血管，計算3個“感興趣區(qū)”計數(shù)均值。

1.3 統(tǒng)計學方法所有計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x-±s)表示，采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學處理。組間比較采用q檢驗，術前及術后比較采用χ2檢驗，VEGF的表達比較采用非參數(shù)檢驗，肝腫瘤MVD計數(shù)的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TAE治療8只實驗兔因TACE或肝動脈造影后7 d之內死亡而被剔除，其中A組1只，B組2只，C組3只，D組2只。死亡可能與手術創(chuàng)傷和異位栓塞有關。各組完成所有指標觀察的實驗兔只數(shù)：A=9，B=8，C=7，D=8。TAE術后14 d復查造影：A組和B組治療前后腫瘤供血無明顯變化；C、D組原栓塞的腫瘤供血動脈未見再通，C組腫瘤邊緣見明顯腫瘤新生血管，D組腫瘤邊緣未見或少見腫瘤新生血管。

2.2 腫瘤體積改變D組治療后腫瘤體積增大明顯小于A、B、C組，腫瘤體積變化差異有統(tǒng)計學意義(A、D組：q=62.24，P＜0.01；B、D組：q=57.79，P＜0.01；C、D組：q=28.38，P＜0.01)，見表1。

表1 治療前后腫瘤體積變化(±s)

表1 治療前后腫瘤體積變化(±s)

組別組數(shù)(只)治療14 d腫瘤體積增大變化(cm3) A組B組C組D組9878 3.19±0.2 3.05±0.18 0.57±0.02 0.04±0.01

2.3 治療前后腫瘤CT強化特點各組均可見腫瘤中心區(qū)低密度無強化壞死區(qū)，C、D組壞死程度差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.348 2，P=0.067)；D組壞死程度重于A、B組(χ2=4.287 5，P=0.038 4；χ2=12.444，P=0.000 4)；腫瘤及邊緣強化：A、B組腫瘤邊緣以中度強化為主，C組腫瘤邊緣輕度強化，D組輕度或未見強化，D組腫瘤強化弱于A、B、C組(A、D組：χ2=17.000，P=0.000；B、D組：χ2=16.000，P=0.000 1；C、D組：χ2=4.285 7，P=0.038 4)，見表2。

表2 治療前后腫瘤壞死及CT強化程度（只）

2.4 組織學與免疫組化

2.4.1 組織學檢查VX2腫瘤細胞形態(tài)不規(guī)則，呈巢狀分布，多為圓形、梭形，胞質較少，核大而深染，間質較少，瘤細胞異型明顯，病理性核分裂象多見；治療后D組觀察腫瘤組織內為結構混亂的異型細胞團，巢狀分布的瘤細胞團內可見大片狀或多個小片狀壞死區(qū)，大部分瘤細胞核固縮及核碎裂；C組可見壞死灶周圍有較多炎癥細胞浸潤，間質內有充血、擴張的毛細血管。

2.4.2 免疫組化檢查D組中腫瘤微血管稀少，VEGF陽性細胞散在或未見分布；C組腫瘤組織及鄰近間質內微血管多而密集，VEGF陽性細胞彌漫分布于癌巢中；B組與A組腫瘤微血管密度及VEGF陽性細胞數(shù)居中；D組VEGF表達均較其他組明顯減低(A、D組：H=12.210 6，P＜0.05；B、D組：H=12.564 6，P＜0.05；C、D組：H=13.005 6，P＜0.05)；MVD計數(shù)各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 各組兔肝腫瘤組織中VEGF表達和MVD計數(shù)情況(只)

3 討論

3.1 本研究所使用栓塞劑的特點HepaSphere微球是一種高吸水性聚合物-丙烯酸鈉與乙稀醇的共聚物(Acrylic acid sodium salt-polyvinyl alcohol copolyer)，呈完全性球體形狀、無色透明硬質顆粒，具有幾個特點：①在血管內膨脹；②顆粒呈球體；③富有顯影性，可作為永久性栓塞材料[4-5]。HepaSphere微球能吸收造影劑并隨造影劑在動脈內流動，栓塞過程中可監(jiān)視栓塞材料的流動狀態(tài)而防止其返流。Hepa-Sphere微球吸收離子性造影劑后顆粒直徑由2倍增至2.5倍。把這些顆粒再移入血清1m in后增大至3.5倍。吸收了離子性造影劑的顆粒則變得柔軟而富有變形性，平均直徑在0.7mm的顆粒能暢通無阻地通過內徑0.53mm的微導管[6]。

3.2 HepaSphere微球行肝動脈栓塞治療兔移植性肝癌的療效觀察本研究中C與D組均使用Hepa-Sphere微球，不同點為D組吸附Avasting。DSA透視下可見該栓塞劑注入肝動脈后順血流快速到腫瘤達末梢小動脈內，微球吸收血清后，進一步增大，不留縫隙地充填血管內腔，完全使末梢小動脈及其分支完全性閉塞，栓塞劑在瘤內沉積。復查造影見腫瘤血管及分支完全性閉塞，腫瘤染色消失。栓塞后2周復查DSA：兩組均未見栓塞后腫瘤血管再通，但C組見再腫瘤周圍有細小腫瘤新生血管。CT及病理顯示：D組腫瘤增長最慢，瘤內壞死最明顯；C組腫瘤生長略快于D組，壞死范圍稍小，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義；A組腫瘤生長最快，腫瘤中心壞死最少，B組腫瘤生長速度與腫瘤壞死與A組相似。但A、B組與D組比較無論腫瘤生長還是腫瘤壞死率差異均有統(tǒng)計學意義。因此我們認為HepaSphere微球能選擇性到達腫瘤供血動脈并將在腫瘤供血細小動脈及分支內快速增大，達到徹底腫瘤阻斷腫瘤供血的作用，具有明顯的抑制腫瘤生長的作用，其療效較為可靠。

3.3 抗腫瘤新生血管作用HepaSphere微球吸附藥物可作為一種藥物載體，在局部充分發(fā)揮藥物療效。Avastin是一種重組人源化抗VEGF的單克隆抗體，通過與循環(huán)中VEGF的競爭性結合，阻止VEGF與相應受體結合，進而阻止腫瘤新生血管的發(fā)生，且Avasting可使腫瘤及其周圍組織的血管分布正?；虼丝赏ㄟ^降低腫瘤組織間質壓而有利于化療藥物的傳遞。Avasting單藥治療晚期肝細胞癌的療效已初獲證實，目前應用于臨床抗腫瘤治療，其抗腫瘤新生血管作用具有濃度與時間依賴性等特征[7]，因此臨床上主要采用持續(xù)靜脈滴注配合全身靜脈化療，也有與碘油混合行肝動脈化療栓塞治療肝癌的報道[8]。

本研究結果顯示，HepaSphere微球聯(lián)合Avasting栓塞治療VX2肝癌，有明顯移植腫瘤新生血管的作用。在治療2周后復查DSA、CT及組織病理，D組無論是影像學表現(xiàn)還是VEGF表達水平和MVD值均低于A、B、C組(P＜0.05)。

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Effect of transarterial embolization with Avasting combined with HepaSphere in the treatment of rabbit with VX2 hepati ccarcinoma.

DU Yu-qing,ZHANG Lei,SUN Xue-dong,GU Wen-quan,WANG Bin.Department of Interventional Oncology,ShanghaiPunan Gynecology Hospital,Shanghai 200125,CHINA

ObjectiveTo study the therapeutic effect of transarterial embolization w ith Avasting and hepa-Sphere for rabbitswith VX2 liver carcinoma.MethodsForty rabbits implanted with liver VX2 tumorswere randomly divided into four groups,w ith 10 rabbits in each group.All rabbitswere demonstrated with liver neoplasmas by MSCT and treated w ith transhepatic arterial embolization under the open laparotomy.Group A was given 3m l saline; Group B was infused with 5mg Avasting injection;Group C was embolized w ith hepaSphere;Group D was administrated w ith 5mg Avasting and hepaSphere.Mutislice spiral CT scan w as performed to measure tumor volume and the expression of MVD and VEGF were determinedwith immunohistochem istry on the 14thday after treatment.A llparameter thus gained were com pared among the four groups.ResultsGroup D show ed the grow th of tumor significantly better other three groups(P＜0.05).The expression of MVD and VEGF in group D was significantly lower than that in othergroups(P＜0.05).ConclusionTransarterial embolizationw ith Avasting combined hepaSphere can effectively inhibitthegrow th ofhepatic tumorand reduce theexpression levelof VEGFand the formation of the tumorvessels.

Microspheres;Avasting;Transarterialembolization

R-332

A

1003—6350（2014）04—0469—03

2013-11-23)

上海市衛(wèi)生局資助課題（編號：20114176）；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學科群項目(編號：PWZxkq2011-02)

杜玉清。E-mail：du_yqsh@sina.cn

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0183