韓建峰，霍 康，白 艷，袁興運(yùn)，宋文峰，屈秋民

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061)

頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞后再通對(duì)大鼠慢性腦缺血損傷的保護(hù)作用

韓建峰，霍 康，白 艷，袁興運(yùn)，宋文峰，屈秋民

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061)

目的通過(guò)建立慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，證實(shí)慢性腦缺血恢復(fù)血流可改善動(dòng)物模型認(rèn)知功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。方法經(jīng)頸外動(dòng)脈線(xiàn)栓法雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞術(shù)制備慢性腦缺血模型，并通過(guò)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分驗(yàn)證動(dòng)物模型，恢復(fù)血流后用Morris水迷宮測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力，再將腦組織固定和染色，用HE染色和Nissl染色觀(guān)察神經(jīng)元數(shù)量變化情況，利用Fluoro-Jade C染色法特異性標(biāo)記腦片中正在發(fā)生變性的神經(jīng)元，觀(guān)察阻斷后及再通后變性的神經(jīng)元數(shù)目的變化，通過(guò)觀(guān)察雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織Bcl-2及Caspase 3的表達(dá)變化反映神經(jīng)元的變性和丟失。結(jié)果雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈血流阻斷能造成慢性腦缺血，引起神經(jīng)元變性和死亡，導(dǎo)致大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)及空間學(xué)習(xí)記憶功能損害。腦血流的恢復(fù)能促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2和Caspase 3的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)了慢性缺血對(duì)腦組織的損害，減緩了神經(jīng)元的變性和丟失，有利于大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和空間認(rèn)知功能恢復(fù)。結(jié)論慢性腦缺血恢復(fù)血流可改善動(dòng)物模型認(rèn)知功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

慢性腦缺血；認(rèn)知功能；神經(jīng)細(xì)胞凋亡；Bcl-2；Caspase 3

過(guò)去進(jìn)行的癥狀性腦血管狹窄的研究中，大多數(shù)關(guān)注的是終點(diǎn)事件。例如，卒中、血管性死亡、心梗等，過(guò)多關(guān)注的重點(diǎn)是心腦血管病的復(fù)發(fā)［1-3］。但是，我們知道癥狀性顱內(nèi)動(dòng)脈狹窄所導(dǎo)致的不僅僅是急性血管病事件(TIA、梗塞)，很多情況下會(huì)導(dǎo)致慢性腦供血障礙，臨床上可以出現(xiàn)癡呆、MCI、認(rèn)知功能下降，甚至精神行為異常，這些現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是由于顱內(nèi)外動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致大腦慢性缺氧、灌注下降造成的，常常會(huì)造成患者神經(jīng)功能的緩慢下降，使致殘率增加。慢性腦缺血發(fā)生、發(fā)展可使腦組織產(chǎn)生不同程度的病理?yè)p傷，從而導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能障礙。因此，本次實(shí)驗(yàn)研究利用大鼠慢性腦缺血模型，觀(guān)察了慢性腦缺血后大鼠腦結(jié)構(gòu)和功能的損傷，腦血流恢復(fù)對(duì)腦組織和神經(jīng)功能損傷的逆轉(zhuǎn)作用，為臨床治療此類(lèi)疾病提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體質(zhì)量280～320 g，雄性，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠購(gòu)回后飼養(yǎng)于溫度22～26℃、濕度40%～60%環(huán)境中一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組20只作為對(duì)照，每組10只分別于4周、8周處死，其余60只分4組，雙頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞后2周、4周、8周后再通組及不再通組各15只。

1.2 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）阻塞及再通模型制備的方法

1.2.1 經(jīng)頸外動(dòng)脈線(xiàn)栓法行頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞術(shù) 大鼠經(jīng)10 m L/L水合氯醛腹腔注射麻醉(40 mg/kg)后，仰臥位固定于大鼠手術(shù)臺(tái)上，剪毛，常規(guī)消毒頸部皮膚，取頸部正中切口切開(kāi)皮膚及皮下組織，分別分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。分離后，電凝阻斷ECA的分支并結(jié)扎遠(yuǎn)心端，隨后從結(jié)扎處的遠(yuǎn)側(cè)切斷ECA，拉向下方；分別用動(dòng)脈夾夾閉ICA和CCA，手術(shù)顯微鏡下，用顯微剪在ECA近動(dòng)脈分叉處剪一小口，將準(zhǔn)備好的栓線(xiàn)經(jīng)ECA插入ICA內(nèi)(栓線(xiàn)為直徑0.2 mm的黑色魚(yú)線(xiàn)，其頭端已燒制成光滑的均勻棒狀)，進(jìn)入長(zhǎng)度為距CCA分叉處約5 mm。隨后，在ECA處用醫(yī)用縫線(xiàn)結(jié)扎固定栓線(xiàn)以阻止出血并確保阻斷ICA血流。逐層縫合皮下組織及皮膚，燈照取暖保溫，保持呼吸道通暢，待麻醉蘇醒后送回動(dòng)物房，常規(guī)飼養(yǎng)。1.2.2 頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞后的再通 ICA阻塞后4周，選擇經(jīng)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分確定的有腦缺血癥狀的大鼠進(jìn)行ICA再通手術(shù)。動(dòng)物麻醉固定于手術(shù)臺(tái)，切開(kāi)頸部皮膚，分離ECA，尋找栓線(xiàn)尾端，用動(dòng)脈夾夾閉CCA和ICA，經(jīng)ECA拔出栓線(xiàn)，靠近CCA分叉處結(jié)扎ECA，確保無(wú)出血，逐層縫合傷口、保溫，麻醉蘇醒后，常規(guī)飼養(yǎng)8周。

1.3 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分（neurological deficit score，NDS）參考BECK等［4］的方法，對(duì)雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后大鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能缺陷進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)項(xiàng)目包括斜面反射、握持反射、觸須反射、跌落反射、角膜反射、耳廓反射、自發(fā)性運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)、前肢彎曲、扭身反射及噬咬反射，正常大鼠總得分為21分，感覺(jué)運(yùn)動(dòng)缺陷大鼠得分顯著降低。

1.4 Morris水迷宮Morris水迷宮用于測(cè)試頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能的變化。大鼠游泳的圓形水池直徑為120 cm，水深50 cm，水溫為(24±2)℃，水池被分為4個(gè)象限，在其中一個(gè)象限中央放置一隱藏于水面下2 cm的透明平臺(tái)，水中加入牛奶以避免動(dòng)物看見(jiàn)平臺(tái)。水池上方中央安放攝像頭，連結(jié)至電腦和記錄軟件，用以記錄和分析動(dòng)物的游泳時(shí)間和運(yùn)動(dòng)軌跡(附圖6A)。測(cè)試分為定位航線(xiàn)實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。定位航線(xiàn)實(shí)驗(yàn)共4 d，經(jīng)8個(gè)訓(xùn)練段，每個(gè)訓(xùn)練段游泳4次。每次訓(xùn)練隨機(jī)選取一個(gè)象限，將大鼠頭朝向池壁放入水中，觀(guān)察和記錄120 s內(nèi)大鼠尋找水下平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)軌跡和時(shí)間(即逃避潛伏期，escape latency)，用于測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)能力?？臻g探索實(shí)驗(yàn)于第5天進(jìn)行，撤去平臺(tái)，將大鼠于平臺(tái)對(duì)面象限放入水中，記錄大鼠在120 s中在平臺(tái)象限的停留時(shí)間及穿經(jīng)平臺(tái)次數(shù)，用于測(cè)試大鼠的空間記憶能力。

1.5 腦組織固定和染色

1.5.1 大鼠腦組織灌注固定 將接受頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞后4周、阻塞后再通8周和假手術(shù)組動(dòng)物進(jìn)行灌注固定。100 m L/L水合氯醛(40 mg/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉后，開(kāi)胸，暴露心臟，左心室插管，剪開(kāi)右心耳，用9 g/L氯化鈉溶液200 m L快速灌注沖洗出血液，至流出液體清亮；再用500 m L含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，p H 7.4)灌注固定1 h；斷頭取腦，修整成厚約1 cm的冠狀腦塊，放入40 g/L多聚甲醛中，4℃后固定過(guò)夜，然后移入300 g/L蔗糖溶液中，至其沉入容器底部。

1.5.2 冰凍切片 處理好的腦塊置于樣本座上，用OCT包埋，放入恒冷箱切片機(jī)內(nèi)快速冷凍，然后行冠狀切片，片厚20μm，錨定于鉻釩明膠包被的載玻片上，用于HE、Nissl和Fluoro-Jade C染色。

1.5.3 HE染色 冰凍切片復(fù)至室溫，蒸餾水洗去片上的OCT，浸入蘇木素染液內(nèi)，室溫30 min；流水洗去多余染液，用10 g/L鹽酸乙醇分色，浸入自來(lái)水中復(fù)藍(lán)；浸入伊紅染液內(nèi)1 min，流水洗去殘余染液；經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片、晾干，顯微鏡觀(guān)察和照相。

1.5.4 Nissl染色 主要用于顯示腦片上的神經(jīng)元。切片放入5 g/L甲苯胺藍(lán)(700 m L/L乙醇配制)中染色10 min，700 m L/L酒精分色，至切片為淡藍(lán)色；脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀(guān)察和照相。

1.6 Fluoro-Jade C染色Fluoro-Jade C是一類(lèi)新近發(fā)展的陰離子熒光配體染料，它可以與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)正發(fā)生變性的神經(jīng)元結(jié)合，特異性標(biāo)記腦內(nèi)的變性神經(jīng)胞體及其突起，具有染色時(shí)間短、不易衰減、高對(duì)照性等優(yōu)點(diǎn)。是一種快速、敏感及可靠的熒光染料，可方便的用于變性神經(jīng)元的檢測(cè)和定位［5-7］。圖像采集分析是在熒光顯微鏡下觀(guān)察Fluoro-Jade C陽(yáng)性細(xì)胞并照相。

1.7 Western blot蛋白檢測(cè)蛋白提取→BCA法蛋白濃度測(cè)定→蛋白電泳樣品制備→SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白的電轉(zhuǎn)移→免疫學(xué)染色→數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析：應(yīng)用BioRad凝膠成像系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，采用ImageJ計(jì)算每個(gè)條帶的積分吸光度值(IA)，用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(β-Actin)條帶的積分吸光度比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣本均數(shù)間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)或成組t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取0.05。

2 結(jié) 果

2.1 雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后神經(jīng)功能缺陷評(píng)分的變化為了觀(guān)察雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后大鼠的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能變化，評(píng)價(jià)模型是否成功，參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，我們?cè)谑中g(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行了神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。研究結(jié)果顯示，ICA阻塞后1周動(dòng)物的評(píng)分與假手術(shù)組未見(jiàn)顯著變化；ICA阻塞后2周，約50%的動(dòng)物評(píng)分顯著降低；ICA阻塞后4周，約70%的動(dòng)物的評(píng)分顯著低于假手術(shù)組。因此，我們選擇了阻塞后4周評(píng)分顯著降低的動(dòng)物進(jìn)行后續(xù)的再通實(shí)驗(yàn)。頸內(nèi)動(dòng)脈再通后，動(dòng)物的評(píng)分有所升高，在ICA再通后4周和8周顯著高于ICA阻塞4周組(圖1)。

2.2 利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞后對(duì)大鼠空間認(rèn)知能力的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是顯示腦損傷后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能變化的主要方法之一。利用該方法進(jìn)一步評(píng)價(jià)雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞后對(duì)大鼠空間認(rèn)知能力的影響及頸內(nèi)動(dòng)脈再通后的變化。定位航線(xiàn)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，ICA阻塞后4周動(dòng)物的逃避潛伏期顯著高于假手術(shù)組；ICA再通后4周，其逃避潛伏期在第4到第8個(gè)測(cè)試段中顯著下降，但仍明顯高于假手術(shù)組；ICA再通后8周的逃避潛伏期繼續(xù)下降，但與ICA再通后4周相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示ICA阻塞可損傷大鼠的空間學(xué)習(xí)功能，而ICA再通可促進(jìn)其空間學(xué)習(xí)功能恢復(fù)(圖2)。定位航線(xiàn)實(shí)驗(yàn)顯示，ICA阻塞4周組動(dòng)物在平臺(tái)象限的停留時(shí)間明顯少于假手術(shù)組，ICA再通后，動(dòng)物的平臺(tái)象限停留時(shí)間逐漸提高，在ICA再通4周和8周組顯著高于ICA阻塞4周組，但仍然低于假手術(shù)組，提示ICA阻塞可損傷大鼠的空間記憶能力，而ICA再通可促進(jìn)其空間記憶能力的恢復(fù)(圖3)。

圖1 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分Fig.1 Neurological deficit scores of rats after ICA occlusion and reperfusion

圖2 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期的變化Fig.2 Changes of escape latency in the Morris water maze test after ICA occlusion and reperfusion

圖3 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的平臺(tái)象限停留時(shí)間的變化Fig.3 Changes of platform quadrant stay time in the Morris water maze test after ICA occlusion and reperfusion

2.3 HE及Nissl染色觀(guān)察雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織的形態(tài)學(xué)變化為了觀(guān)察雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織的形態(tài)學(xué)變化，我們選取了頸內(nèi)動(dòng)脈供血區(qū)的額葉皮質(zhì)，進(jìn)行了HE和Nissl染色。HE染色結(jié)果顯示(圖4)，假手術(shù)組大鼠腦組織中的神經(jīng)元形態(tài)正常，表現(xiàn)為細(xì)胞核光滑，淡染后有明顯的核仁；ICA阻塞4周的腦組織切片上神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，有散在的形態(tài)異常神經(jīng)元，出現(xiàn)了較多的空泡，部分空泡中有固縮的核染色質(zhì)；另外，與假手術(shù)組相比，切片上出現(xiàn)了較多的核小且濃染的浸潤(rùn)炎性細(xì)胞。ICA再通后8周，切片上神經(jīng)元數(shù)量未見(jiàn)明顯增加；但炎性細(xì)胞較ICA阻塞4周組明顯減少；可觀(guān)察多個(gè)管腔較大的增生血管。到

圖4 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織的形態(tài)學(xué)變化Fig.4 Morphological changes of brain slices after ICA occlusion and reperfusion

Nissl染色的主要目的是顯示腦片的神經(jīng)元變化。結(jié)果顯示(圖5)，對(duì)照組(假手術(shù)組)動(dòng)物切片上可見(jiàn)神經(jīng)元形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)Nissl體明顯，細(xì)胞核大，輪廓平滑，染色質(zhì)疏松，核仁清晰。ICA阻塞4周，腦切片上出現(xiàn)了數(shù)個(gè)損傷神經(jīng)元，表現(xiàn)為核固縮濃染，胞體萎縮變形，且有神經(jīng)元丟失后遺留的空泡。ICA再通后8周，存活神經(jīng)元形態(tài)正常，有散在的固縮細(xì)胞核和空泡。

圖5 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織的Nissl染色Fig.5 Nissl staining of brain slices after ICA occlusion and reperfusion

2.4 利用Fluoro-Jade C染色法特異性標(biāo)記腦片中正在發(fā)生變性的神經(jīng)元在熒光顯微鏡下，F(xiàn)luoro-Jade C染色陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光，損傷神經(jīng)元的胞體和突起均清晰可見(jiàn)，但已經(jīng)死亡神經(jīng)元及其他細(xì)胞不能被標(biāo)記。本研究顯示，假手術(shù)組動(dòng)物的腦切片上未見(jiàn)標(biāo)記的染色陽(yáng)性神經(jīng)元；ICA阻塞4周后，切片上可見(jiàn)到Fluoro-Jade C陽(yáng)性神經(jīng)元，其數(shù)量為(11.5 ±2.2)個(gè)/視野；ICA再通8周后，腦片上的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低為(3.2±1.1)個(gè)/視野(圖6)。

圖6 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織的Fluoro-Jade C染色Fig.6 Fluoro-Jade C staining of brain slices after ICA occlusion and reperfusion

2.5 雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織Bcl-2及Caspase 3的表達(dá)變化Bcl-2和Caspase 3是細(xì)胞內(nèi)兩種重要的抗凋亡基因，其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或含量的變化與損傷后神經(jīng)元存活與凋亡有著密切的關(guān)系。本研究利用Western blot方法，顯示了頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦組織內(nèi)Bcl-2和Caspase 3在蛋白水平的變化。結(jié)果顯示，ICA阻塞后，Bcl-2表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組相比，P＜0.05，與頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞4周組相比，P＜0.05，ICA再通后，Bcl-2顯著上調(diào)(圖7)。同樣，其下游分子Caspase 3的含量與對(duì)照組相比，P＜0.05，與頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞4周組相比，P＜0.05。ICA再通后，Caspase 3顯著上調(diào)(圖8)。

圖7 Western blot顯示大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦內(nèi)Bcl-2表達(dá)的變化Fig.7 The expression of Bcl-2 protein detected by Western blot after ICA occlusion and reperfusion in rats

圖8 Western blot顯示大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞及再通后腦內(nèi)Caspase 3表達(dá)的變化Fig.8 The expression of Caspase 3 protein detected by Western blot after ICA occlusion and reperfusion in rats

3 討 論

慢性腦缺血的動(dòng)物模型常用的方法是雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎，兩血管法(2-vessels occlusion，2VO)慢性腦缺血模型最早是由TORTE等建立，該模型通過(guò)結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷了雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈的血流，使腦血流量降低52%～64%，造成大腦的慢性低灌注狀態(tài)［8-9］。本研究為觀(guān)察頸內(nèi)動(dòng)脈血流恢復(fù)后大鼠的神經(jīng)功能及腦組織病理變化，將上述方法改良為經(jīng)頸外動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)放置線(xiàn)栓的方法，阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈血流；再通過(guò)二次手術(shù)經(jīng)頸外動(dòng)脈取出栓線(xiàn)的方法恢復(fù)頸內(nèi)動(dòng)脈血流，與DUAN等［7］的方法相比，血流再通的成功率大大提高，解決了因長(zhǎng)期結(jié)扎頸總動(dòng)脈后引起血管閉塞而不能再通的問(wèn)題；與結(jié)扎頸總動(dòng)脈然后再吻合血管的方法相比，手術(shù)操作難度顯著降低。因此，本模型可作為研究慢性腦缺血后血流再通的理想工具。

既往研究表明［8-10］，阻斷大鼠雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈血流后，最初并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的腦結(jié)構(gòu)和功能損傷，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，在缺血后2周逐漸出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，在缺血后4～6周，在腦組織切片上就可以觀(guān)察到明顯的神經(jīng)元損傷。我們的研究結(jié)果表明，缺血4周大鼠的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分顯著降低，Morris水迷宮的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，腦組織切片上也出現(xiàn)了明顯的變性和壞死神經(jīng)元。在熒光顯微鏡下，F(xiàn)luoro-Jade C染色陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光，損傷神經(jīng)元的胞體和突起均清晰可見(jiàn)，但已經(jīng)死亡神經(jīng)元及其他細(xì)胞不能被標(biāo)記；ICA阻塞4周后，切片上可見(jiàn)到Fluoro-Jade C陽(yáng)性神經(jīng)元，ICA再通8周后，腦片上的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低，提示再通可明顯減少神經(jīng)元變性。這些與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致［11-15］，也證實(shí)慢性腦缺血隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)的異常和神經(jīng)元的變性改變。

在本實(shí)驗(yàn)中，作為一種治療手段，我們?cè)谧钄囝i內(nèi)動(dòng)脈血流4周后恢復(fù)了腦血流。腦血流的恢復(fù)可能會(huì)帶來(lái)兩方面的影響。一方面，有利于腦能量和物質(zhì)代謝功能的恢復(fù)，從而改善慢性腦缺血狀態(tài)，恢復(fù)腦功能；另一方面，也可能造成腦的再灌注損傷，加重腦損傷。因此，我們進(jìn)一步觀(guān)察了腦血流恢復(fù)后不同時(shí)間腦結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能的變化。結(jié)果表明，慢性腦缺血大鼠腦血流的有效恢復(fù)可顯著促進(jìn)大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能和空間認(rèn)知障礙的改善，提示慢性腦缺血后腦血流恢復(fù)能夠有效逆轉(zhuǎn)腦功能障礙，有利于神經(jīng)功能恢復(fù)。我們的研究也提示，由于神經(jīng)元不具備再生能力，腦血流的恢復(fù)不能逆轉(zhuǎn)腦組織結(jié)構(gòu)的損傷，血流恢復(fù)后神經(jīng)功能的改善更多地是由于減少了神經(jīng)元的損傷和丟失，而腦內(nèi)其他正常神經(jīng)元進(jìn)行了有效的功能代償。說(shuō)明恢復(fù)正常血流可明顯改善患者慢性腦缺血所造成的神經(jīng)元的損傷，減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡速度。

總之，雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈血流阻斷能造成慢性腦缺血，引起神經(jīng)元變性和死亡，導(dǎo)致大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)及空間學(xué)習(xí)記憶功能的損害。腦血流的恢復(fù)能促進(jìn)抗凋亡基因Bcl2和Caspase 3的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)了慢性缺血對(duì)腦組織的損害，減緩了神經(jīng)元的變性和丟失，有利于大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和空間認(rèn)知功能的恢復(fù)。

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(編輯 韓維棟)

Protective effects of internal carotid artery vascular recanalization on rats after chronic cerebral ischemia

HAN Jian-feng，HUO Kang，BAI Yan，YUAN Xing-yun，SONG Wen-feng，QU Qiu-min
(Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo establish the chronic cerebral ischemia animal model so as to prove that chronic cerebral vascular ischemia recanalization may improve cognitive function and decrease neuronal apoptosis in the animal model.MethodsThe rats underwent chronic cerebral ischemia by using external carotid artery embolic suture methods.All rats were evaluated for neurological deficit score.After blood flow restoration，spatial learning ability and spatial memory ability of the rats were evaluated by the Morris water maze test.The rat brain tissues were fixed and stained to observe pathological changes.The neuron numbers were compared between blocked and recanalization groups.HE staining and Nissl staining were used to observe the change in the number of neurons. Fluoro-Jade C staining was used to label the degenerating neurons on brain slices.The expressions of Bcl2 and Caspase 3 in rats pretreated with external carotid artery embolic sutureMethodswere observed for the neuronal degeneration and loss.ResultsBilateral carotid artery blocking could induce chronic cerebral ischemia which led to neuronal degeneration and death.Spatial learning ability and spatial memory ability in rats were damaged. Cerebral blood flow restoration could promote anti-apoptotic Bcl2 gene and Caspase 3 gene expression，thereby reversing the damage of chronic ischemia to brain tissue and slowing down the degeneration and loss of neurons. Carotid artery vascular recanalization in rats helped the recovery of movement and spatial cognitive function in rats.ConclusionChronic ischemic vascular recanalization may improve cognitive function and decrease neuronal apoptosis in the animal model.

chronic cerebral ischemia；cognitive function；neuronal apoptosis；Bcl-2；Caspase 3

R743.32

A

1671-8259(2014)05-0605-06

10.7652/jdyxb201405008

2014-02-27

2014-04-07

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.2011K12-05-12) Supported by the Science and Technology Project of Shaanxi Province(No.2011K12-05-12)

韓建峰(1972-)，男(漢族)，臨床醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師.研究方向：腦血管病、腦血管介入治療.E-mail：rabbit1110@163.com

時(shí)間：2014-07-22 18∶19 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1819.020.html