王 勇，張格娟，王 濤，王會生，劉 健

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西西安 710061)

內(nèi)生大麻素受體激動劑抑制異動癥大鼠紋狀體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放

王 勇，張格娟，王 濤，王會生，劉 健

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西西安 710061)

目的觀察內(nèi)生大麻素受體激動劑WIN 55，212-2對帕金森病左旋多巴相關(guān)異動癥模型大鼠紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響。方法采用腦內(nèi)微透析和高效液相色譜在線遞質(zhì)測量法觀察WIN 55，212-2腹腔內(nèi)注射對異動癥模型大鼠左旋多巴相關(guān)異動癥狀和紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響。結(jié)果與溶劑注射相比，WIN 55，212-2注射顯著抑制異動癥模型大鼠左旋多巴皮下注射后的異動樣癥狀(F1263=44.071，P＜0.001)，同時明顯減少紋狀體內(nèi)多巴胺的釋放(F1263=5.091，P＜0.05)。結(jié)論紋狀體內(nèi)生大麻素受體可能通過抑制性的調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來影響異動癥模型大鼠的異動樣癥狀。

帕金森??；異動癥；紋狀體；多巴胺；去甲腎上腺素；大鼠；大麻素受體激動劑

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病［1］。PD的基礎(chǔ)病理改變是腦內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)及去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)能神經(jīng)元變性缺失和紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量降低［2］。左旋多巴(L-3，4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成的前體物質(zhì)，在腦內(nèi)可以通過特定的酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為DA和NE等神經(jīng)遞質(zhì)［3］。L-DOPA是目前臨床治療PD的最常用藥物［4］。PD患者長期服用LDOPA后通常會出現(xiàn)L-DOPA相關(guān)的異動癥(LDOPA-induced dyskinesia，LID)。LID的出現(xiàn)會嚴(yán)重影響PD患者的生活質(zhì)量［5-6］。闡明LID的病理生理機制和有效控制LID樣癥狀是目前PD基礎(chǔ)和臨床研究的重要課題［4］。新近在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生大麻素受體激動劑可以明顯抑制LID動物模型的LID樣癥狀，但其具體機制尚未闡明［7］。本實驗通過給LID模型大鼠腹腔內(nèi)注射內(nèi)生大麻素受體激動劑WIN 55，212-2(WIN)，同時采用腦內(nèi)微透析和高效液相色譜在線遞質(zhì)測量法觀察WIN注射對LID大鼠紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響，探討內(nèi)生大麻素受體激動劑治療LID的神經(jīng)生物學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品20只健康雄性Sprague-Dawley大鼠(220～250 g)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫20～25℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水，預(yù)養(yǎng)1周。LDOPA(L-3，4-dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride)、芐絲肼(benserazide hydrochloride)、6-OHDA(6-Hydroxydopamine hydrobromide)、WIN (WIN 55，212-2 mesylate salt)購自Sigma公司(Sigma-Aldrich，MO，USA)。

1.2 大鼠PD模型制備大鼠在40 g/L水合氯醛(400 mg/kg，i.p.)麻醉下進行內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle，MFB)內(nèi)6-OHDA注射。將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上(SN-2N，Narishige)，嚴(yán)格顱平位。術(shù)前先給大鼠注射地昔帕明(25 mg/kg，i.p.)以保護NE能神經(jīng)元。依據(jù)Paxinos-Watson大鼠腦定位圖譜確定左側(cè)MFB三維坐標(biāo)位置是前囟后AP 4.0 mm；矢狀縫左L 1.2 mm；顱骨膜下D 7.7 mm［8］。6-OHDA溶于含0.2 g/L抗壞血酸的生理鹽水中，用前配制，4℃避光保存。微量注射使用尖端與玻璃微電極相連的10μL Hamilton微量注射器，在MFB內(nèi)注射6-OHDA，總量12μg/4μL，給藥速度1μL/min，注射完畢后將玻璃微電極留置5 min后緩慢退出。6-OHDA注射后第14天，對大鼠分別進行阿撲嗎啡(0.05 mg/kg，s.c.)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)試驗。接受阿撲嗎啡注射后，5 min內(nèi)對側(cè)旋轉(zhuǎn)大于20圈的大鼠被視為成功的PD模型。

1.3 L-DOPA注射和行為學(xué)檢測檢測成功的PD模型大鼠接受1次/d，共21 d的L-DOPA和芐絲肼注射。L-DOPA(6 mg/kg，s.c.)和芐絲肼(12 mg/kg，s.c.)于臨用前溶于生理鹽水［9］。在L-DOPA注射的第21天，通過異動癥評分(abnormal involuntary movements，AIMs)來選取成功的LID大鼠模型。AIMs評分在L-DOPA注射后180 min內(nèi)每10 min進行1次，共19次。包括軀干、上肢、口舌和對側(cè)旋轉(zhuǎn)等4項異動樣癥狀的累計評分。根據(jù)癥狀程度從輕到重每項癥狀的評分可為0～4分(無：0分；異動癥狀出現(xiàn)時間短于觀測時間的50%：1分；癥狀出現(xiàn)時間長于觀測時間的50%：2分；異動癥狀持續(xù)出現(xiàn)：3分；異動癥狀持續(xù)出現(xiàn)且不被外來感覺刺激打斷：4分)。每觀測時間點的最高評分為16分，總分為304分［10］。經(jīng)檢測，表現(xiàn)出明顯LID樣癥狀的大鼠被納入進一步實驗。

1.4 WIN 55，212-2的亞慢性注射經(jīng)檢測成功的LID模型大鼠被隨機分為WIN注射組(n=6)和對照組(VEH，n=6)。從第22天到第24天WIN組和VEH組大鼠在L-DOPA注射前20 min分別接受1次/d，連續(xù)3 d的WIN(1 mg/kg，i.p.)或空白溶劑(VEH，5%/5%/90%of Tween 80/PEG/saline)注射［7］。在第24天觀察WIN對異動癥模型大鼠AIMs評分和紋狀體內(nèi)DA和NE神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響。

1.5 腦內(nèi)微透析液采集和遞質(zhì)含量的測定在LDOPA注射的第21天，大鼠在40 g/L水合氯醛(400 mg/kg，i.p.)麻醉下進行微透析導(dǎo)管植入手術(shù)。微透析導(dǎo)管(CMA/12，CMA Microdialysis，Kista，Sweden)被植入左側(cè)紋狀體內(nèi)(AP+0.6 mm，L 3.5 mm，D 3.5 mm)并使用2個不銹鋼螺釘和玻璃離子體水門汀將導(dǎo)管固定于顱骨上［8，11］。術(shù)后將大鼠單籠飼養(yǎng)，在微透析液采集的前1 d將微透析探針(CMA 12 MD Elite Probe，4 mm membrane length，CMA Microdialysis，Kista，Sweden)置入套管內(nèi)［12］。在WIN注射的第3天進行微透析液采集。將大鼠置入清醒動物用微透析液采集桶(CMA 120，CMA Microdialysis，Kista，Sweden)內(nèi)。使用聚乙烯軟管連接微透析探針和微透析泵(CMA 402 Syringe Pump，Kista，Sweden)，并使用林格液(147 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L CaCl2和0.85 mmol/L MgCl2)充灌整個微透析系統(tǒng)［13］。微透析速度為1.5μL/min，每10 min收集1個透析樣品。首先收集3個透析樣品作為前對照，之后進行L-DOPA注射(6 mg/kg，加芐絲肼12 mg/kg，s.c.)。L-DOPA注射后每10 min收集1個透析樣品并記錄實時的AIMs評分，共進行180 min的透析樣品采集。微透析液收集完畢的大鼠在過量麻醉后，經(jīng)左心室灌注生理鹽水100 m L，隨后用40 g/L多聚甲醛150 m L灌注固定；取腦連續(xù)冠狀面冷凍切片，確定透析管的置入位置。并行黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫組織化學(xué)染色確定DA能神經(jīng)元的毀損程度［14］。將采集到的透析液注入HPLC(AlexysUhplc，Antec，Zoeterwoude，the Netherlands)系統(tǒng)中實時測定透析液中的DA和NE遞質(zhì)含量，并換算出腦內(nèi)DA和NE的實際含量。我們在實驗中還分別采集了DA和NE含量在L-DOPA注射后的峰值(ΔCmax)、峰值出現(xiàn)時間(Tmax)和峰值半衰期(t1/2)，這些代謝動力學(xué)參數(shù)反映了L-DOPA注射后紋狀體內(nèi)DA和NE代謝速度的變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析TH染色陽性神經(jīng)元計數(shù)、DA和NE代謝動力學(xué)參數(shù)的比較使用t檢驗。L-DOPA注射后不同組動物間AIMs分值和遞質(zhì)含量水平的比較使用雙因素重復(fù)測量方差分析(Two-way RMANOVA)的方法統(tǒng)計，post hoc檢驗使用Holm-Sidak檢驗。使用SigmaStat 3.5軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

SNc內(nèi)TH染色陽性神經(jīng)元計數(shù)顯示，MFB內(nèi)6-OHDA注射后，大鼠毀損側(cè)SNc內(nèi)TH染色陽性神經(jīng)元顯著減少至對側(cè)的(2±3)%(P＜0.001，t檢驗，圖1)。

圖1 單側(cè)SNc損毀大鼠SNc內(nèi)TH免疫組織化學(xué)染色顯微圖片F(xiàn)ig.1 Photomicrographs of TH immunocytochemical slices that showed the staining of the SNc in a 6-OHDA-lesioned rat

19只檢測成功的6-OHDA損毀大鼠在接受21 d L-DOPA注射后有12只大鼠表現(xiàn)出典型的LID樣癥狀，納入LID組做進一步實驗。另外7只6-OHDA損毀大鼠無典型的LID癥狀，為non-LID大鼠(圖2A～D)。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，LID和non-LID組大鼠AIMs評分在組間(F1398= 331.086，P＜0.001)、不同時間點(F20398=99.980，P＜0.001)及時間×組間交互作用(F20398=93.867，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學(xué)差異。使用Holm-Sidak法進一步的比較不同時間點組間差異，結(jié)果顯示LDOPA注射后有15個時間點LID組和non-LID組AIMs評分有統(tǒng)計學(xué)差異(圖2E)。

納入LID組的12只大鼠被隨機分為WIN注射組(n=6)和VEH注射組(n=6)，接受3 d的藥物注射。在第3天比較兩組AIMs評分和紋狀體內(nèi)DA與NE釋放水平的差異。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，WIN和VEH組大鼠AIMs評分在組間(F1263=44.071，P＜0.001)、不同時間點(F21263= 150.448，P＜0.001)及時間×組間交互作用(F21263=14.354，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學(xué)差異。使用Holm-Sidak法進一步比較不同時間點組間差異，結(jié)果顯示L-DOPA注射后有12個時間點WIN組和VEH組AIMs評分有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3A)。

圖2 L-DOPA注射后LID大鼠的異動樣行為Fig.2 Effects of L-DOPA administration on rat dyskinetic behavior

L-DOPA注射后WIN組和VEH組大鼠DA與NE釋放均明顯增加。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，WIN和VEH組大鼠紋狀體DA水平在組間(F1263=5.091，P＜0.05)、不同時間點(F21263= 31.029，P＜0.001)及時間×組間交互作用(F21263= 6.091，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學(xué)差異。使用Holm-Sidak法進一步比較不同時間點組間差異，結(jié)果顯示L-DOPA注射后有6個時間點WIN組和VEH組DA水平有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3B)。DA代謝動力學(xué)參數(shù)中ΔCmax和t1/2在WIN組和VEH組有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3D～F)。Two-way RM ANOVA統(tǒng)計顯示，WIN和VEH組大鼠紋狀體NE水平在組間無統(tǒng)計學(xué)差異(F1263=0.195，P＞0.05)，但不同時間點(F21263= 13.657；P＜0.001)及時間×組間交互作用(F21263= 2.560，P＜0.001)均存在統(tǒng)計學(xué)差異。使用Holm-Sidak法進一步比較不同時間點的組間差異，結(jié)果顯示L-DOPA注射后有2個時間點WIN組和VEH組的NE水平有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3C)。NE代謝動力學(xué)參數(shù)中Tmax和t1/2在WIN組和VEH組有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3D～F)。

圖3 WIN對LID大鼠AIMs評分和紋狀體內(nèi)DA與NE釋放的影響Fig.3 Effects of WIN on AIMs score and extracellular DA and NE release in LID rats

3 討 論

本實驗結(jié)果顯示，多數(shù)6-OHDA損毀的PD模型大鼠在接受21 d的L-DOPA慢性注射后會出現(xiàn)與LID患者類似的不自主運動癥狀，這與以往的文獻報道一致。LID的主要癥狀包括了軀干、上肢、口面舌的不自主運動，對于偏側(cè)的LID模型大鼠還會出現(xiàn)不自主的對側(cè)旋轉(zhuǎn)運動［10］。PD患者和PD模型動物出現(xiàn)LID的原因目前尚未完全闡明。目前的研究顯示，LID的出現(xiàn)與紋狀體內(nèi)的突觸可塑性改變密切相關(guān)。這種改變涉及到紋狀體內(nèi)突觸前膜和突觸后膜的一系列變化。PD狀態(tài)下，由于DA和NE等單胺能傳入纖維的損毀，使LID模型動物的紋狀體突觸前末梢對單胺類遞質(zhì)的存儲和清除能力下降。在接受L-DOPA注射后會出現(xiàn)紋狀體內(nèi)DA等遞質(zhì)水平的驟升和驟降過程，這一現(xiàn)象與LID的出現(xiàn)密切相關(guān)［9］。在紋狀體內(nèi)的突觸后膜上有DA能D1受體表達。有研究顯示，紋狀體內(nèi)單胺類遞質(zhì)的動態(tài)變化會對突觸后膜的D1等相關(guān)受體產(chǎn)生病理性的刺激。有研究報道，LID模型動物的紋狀體內(nèi)D1受體m RNA表達上調(diào)，D1受體調(diào)節(jié)的胞內(nèi)G蛋白信號通路也表現(xiàn)活性上調(diào)。外源性的給予D1類受體激動劑可以抑制LID樣癥狀。除了單胺能和谷氨酸能遞質(zhì)系統(tǒng)外，內(nèi)生大麻素遞質(zhì)系統(tǒng)可能在LID的出現(xiàn)過程中發(fā)揮重要作用［15］。紋狀體內(nèi)的突觸后細胞可以合成內(nèi)源性類大麻素遞質(zhì)N-花生四烯酸氨基乙醇(N-arachidonoylethanolamine，AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)。這類遞質(zhì)可以作用于紋狀體突觸前膜的內(nèi)生大麻素CB1受體，進而抑制突觸前遞質(zhì)的釋放。有研究顯示，CB1受體結(jié)合類遞質(zhì)上調(diào)的小鼠在同樣接受L-DOPA處理時LID癥狀較正常小鼠顯著減輕。LID大鼠接受CB受體激動劑后其LID樣癥狀也會出現(xiàn)顯著減輕［4］。這些結(jié)果都提示，內(nèi)生大麻素遞質(zhì)系統(tǒng)參與LID的產(chǎn)生過程，CB受體激動劑可能成為治療或控制LID癥狀的藥物。CB受體激動劑減輕LID癥狀的機制目前仍不清楚。在本研究中，我們通過建立LID大鼠模型，觀察其在接受CB受體激動劑WIN后紋狀體單胺類遞質(zhì)釋放的改變，并探討CB受體激動劑抑制LID癥狀的作用機制。實驗結(jié)果顯示，CB受體激動劑WIN可以顯著抑制L-DOPA注射后紋狀體內(nèi)DA和NE遞質(zhì)的釋放過程。而且，這一過程與AIMs評分的下降時相一致。CB受體激動劑對DA和NE釋放的抑制可能與其對單胺能突觸前末梢的抑制作用有關(guān)。表達于紋狀體突觸前的CB受體為抑制性受體，該受體興奮時可抑制突觸前膜的興奮過程，進而抑制突觸前遞質(zhì)的釋放［16］。由于LID的出現(xiàn)與L-DOPA注射后突觸前膜DA等遞質(zhì)的短時大量釋放有關(guān)，因而，CB受體激動劑WIN對LID樣癥狀的抑制作用可能與其對L-DOPA注射后紋狀體內(nèi)DA和NE等單胺類遞質(zhì)釋放的抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示CB受體激動劑類藥物可能通過抑制L-DOPA給予后紋狀體內(nèi)單胺類遞質(zhì)的峰釋放過程，進而抑制LID樣癥狀的出現(xiàn)。

參考文獻：

［1］GALVAN A，WICHMANN T.Pathophysiology of parkinsonism［J］.Clin Neurophysiol，2008，119(7)：1459-1474.

［2］BLANDINI F，NAPPI G，TASSORELLI C，et al.Functional changes of the basal ganglia circuitry in Parkinson's disease［J］. Prog Neurobiol，2000，62(1)：63-88.

［3］CARLSSON A，LINDQVIST M，MAGNUSSON T.3，4-Dihydroxyphenylalanine and 5-hydroxytryptophan as reserpine antagonists［J］. Nature，1957，180(4596)：1200.

［4］CALABRESI P，DI FILIPPO M，GHIGLIERI V，et al.Levodopa-induced dyskinesias in patients with Parkinson's disease：filling the bench-to-bedside gap［J］.Lancet Neurol，2010，9 (11)：1106-1117.

［5］FAHN S.The spectrum of levodopa-induced dyskinesias［J］.Ann Neurol，2000，47(4 Suppl 1)：S2-S9.

［6］BEZARD E，BROTCHIE JM，GROSS CE.Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesia：potential for new therapies［J］. Nat Rev Neurosci，2001，2(8)：577-588.

［7］MORGESE MG，CASSANO T，CUOMO V，et al.Anti-dyskinetic effects of cannabinoids in a rat model of Parkinson's disease：role of CB(1)and TRPV1 receptors［J］.Exp Neurol，2007，208(1)：110-119.

［8］PAXINOSG，WATSON C.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.Sydney：Academic Press，2005：1-367.

［9］LINDGREN HS，ANDERSSON DR，LAGERKVIST S，et al. L-DOPA-induced dopamine efflux in the striatum and the substantia nigra in a rat model of Parkinson's disease：temporal and quantitative relationship to the expression of dyskinesia［J］. J Neurochem，2010，112(6)：1465-1476.

［10］WINKLER C，KIRIK D，BJ?RKLUND A，et al.L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease：relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function［J］.Neurobiol Dis，2002，10(2)：165-186.

［11］DEUMENS R，BLOKLAND A，PRICKAERTS J.Modeling Parkinson's disease in rats：an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway［J］.Exp Neurol，2002，175(2)：303-317.

［12］BUCK K，F(xiàn)ERGER B.Intrastriatal inhibition of aromatic amino acid decarboxylase prevents l-DOPA-induced dyskinesia：a bilateral reverse in vivo microdialysis study in 6-hydroxydopamine lesioned rats［J］.Neurobiol Dis，2008，29(2)：210-220.

［13］BUCK K，F(xiàn)ERGER B.Comparison of intrastriatal administration of noradrenaline and l-DOPA on dyskinetic movements：a bilateral reverse in vivo microdialysis study in 6-hydroxydopamine-lesioned rats［J］.Neuroscience，2009，159(1)：16-20.

［14］WANG Y，ZHANG Q，LIU J，et al.Changes in firing rate and pattern of GABAergic neurons in subregions of the substantia nigra pars reticulata in rat models of Parkinson's disease［J］. Brain Res，2010，1324：54-63.

［15］WANG Y，ZHANG Q，WANG H，et al.Genome-wide microarray analysis identifies a potential role for striatal retrograde endocannabinoid signaling in the pathogenesis of experimental l-DOPA-induced dyskinesia［J］.Syanpse，2014，68(8)：332-343.

［16］GERDEMAN G，LOVINGER DM.CB1 cannabinoid receptor inhibits synaptic release of glutamate in rat dorsolateral striatum［J］.J Neurophysiol，2001，85(1)：468-471.

(編輯 韓維棟)

Cannabinoid receptor agonist WIN 55，212-2 inhibits striatal monoamine release in a rat model of L-DOPA-induced dyskinesia

WANG Yong，ZHANG Ge-juan，WANG Tao，WANG Hui-sheng，LIU Jian (Department of Physiology&Pathophysiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo explore the effects of cannabinoid receptor agonist WIN 55，212-2 on striatal monoamine release in a rat model of L-DOPA-induced dyskinesia(LID).MethodsEffects of WIN 55，212-2 on striatal monoamine release in LID rats were observed by intracerebral microdialysis and high-performance liquid chromatography.ResultsThe dyskinetic behavior related to L-DOPA was inhibited significantly by the injection of cannabinoid receptor agonist WIN 55，212-2(F1263=44.071，P＜0.001)，accompanied by significant decrease of striatal dopamine release(F1263=5.091，P＜0.05).ConclusionThe Results suggest that cannabinoid receptor may be involved in mediating the dyskinetic behavior related to L-DOPA through the regulation of striatal monoamine release.

Parkinson's disease；dyskinesia；striatum；dopamine；norepinephrine；rat；cannabinoid receptor agonist

R741

A

1671-8259(2014)05-0586-05

10.7652/jdyxb201405004

2014-03-22

2014-04-25

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81100837)；中國博士后科學(xué)基金(No.2013M532059) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81100837)and China Postdoctoral Science Foundation(No. 2013M532059)

劉健，教授.E-mail：liujian@mail.xjtu.edu.cn

王勇(1978-)，男(漢族)，生理學(xué)博士，主要從事帕金森病的病理生理學(xué)研究.E-mail：yongwang@mail.xjtu.edu.cn

時間：2014-07-22 18∶22 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1822.021.html