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        杏仁中央核內(nèi)注射μ阿片受體激動(dòng)劑DAMGO增加蔗糖溶液攝入引起的Fos表達(dá)

        2014-06-23 16:28:26閆劍群趙小林李金容
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

        孫 波,閆劍群,王 倩,趙小林,李金容,閆 薇,宋 琳

        (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,陜西西安 710061)

        杏仁中央核內(nèi)注射μ阿片受體激動(dòng)劑DAMGO增加蔗糖溶液攝入引起的Fos表達(dá)

        孫 波,閆劍群,王 倩,趙小林,李金容,閆 薇,宋 琳

        (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,陜西西安 710061)

        目的探討杏仁中央核內(nèi)μ阿片受體對大鼠蔗糖溶液攝入的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制。方法杏仁中央核注入μ阿片受體激動(dòng)劑DAMGO或生理鹽水(Saline),測量大鼠對蔗糖溶液及蒸餾水的攝入量;利用免疫組化方法觀察注入DAMGO或Saline后,蔗糖溶液攝入引起的Fos免疫陽性神經(jīng)元的分布和數(shù)量。結(jié)果與Saline組相比,DAMGO注射增加3 h的蔗糖溶液攝入量,并在伏隔核(核),弓狀核,外側(cè)下丘腦,吻端、中間及尾端孤束核核團(tuán)增加蔗糖攝入引起的Fos表達(dá)。結(jié)論杏仁中央核內(nèi)μ阿片受體的激活可能通過作用于伏隔核、弓狀核、外側(cè)下丘腦及孤束核參與大鼠蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié)。

        杏仁中央核;μ阿片受體;蔗糖溶液攝入;Fos

        杏仁中央核(CeA)是邊緣系統(tǒng)中與情感、動(dòng)機(jī)和攝食等有關(guān)的結(jié)構(gòu)。Ce A中的谷氨酸能神經(jīng)元參與甜味覺的傳遞[1],而GABA能神經(jīng)元參與鈉欲調(diào)節(jié)[2]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,阿片肽主要參與獎(jiǎng)賞相關(guān)行為的調(diào)節(jié)。研究表明,CeA內(nèi)存在大量μ阿片受體(μopioid receptor,MOR)[3]。我們之前的研究顯示,Ce A內(nèi)注入MOR激動(dòng)劑DAMGO可增加大鼠對蔗糖溶液的攝入[4],但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。BOT[5]研究發(fā)現(xiàn)在豚鼠腦室內(nèi)給予DAMGO可引起許多部位c-Fos表達(dá)的增加,包括杏仁核,下丘腦及伏隔核等。據(jù)此假設(shè)Ce A內(nèi)注入DAMGO增加大鼠蔗糖溶液的攝入可能通過以下機(jī)制實(shí)現(xiàn):DAMGO作用于Ce A中的MOR,通過由Ce A發(fā)出的纖維投射,影響其他與蔗糖溶液攝入相關(guān)的腦區(qū)或核團(tuán)的活動(dòng),從而調(diào)節(jié)蔗糖溶液的攝入。LEVINE[6]研究發(fā)現(xiàn),Ce A內(nèi)注入DAMGO可增加伏隔核殼部的c-Fos表達(dá),而對于其他腦區(qū)或核團(tuán)的c-Fos表達(dá)并沒有影響。本研究將Ce A內(nèi)DAMGO注射與蔗糖溶液攝入相結(jié)合,了解Ce A內(nèi)DAMGO注射對于蔗糖溶液攝入引起的相關(guān)核團(tuán)Fos表達(dá)的影響,從而進(jìn)一步研究Ce A內(nèi)DAMGO注射增加蔗糖溶液攝入的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量210~250 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物分籠飼養(yǎng),動(dòng)物房溫度維持在20~24℃,光暗周期為12 h∶12 h,無強(qiáng)烈聲光刺激。所有動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周,其間自由進(jìn)食正常大鼠飼料并自由飲用蒸餾水。30只大鼠隨機(jī)分為兩批,一批用于雙瓶選擇實(shí)驗(yàn)(n=15),另一批用于Fos表達(dá)實(shí)驗(yàn)(n=15)。

        1.2 單側(cè)CeA內(nèi)套管植入手術(shù)水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物,固定大鼠頭部于腦立體定位儀上,使前囟和后囟處于同一平面。根據(jù)大鼠腦圖譜確定CeA的位置:前囟后2.4 mm,中縫旁開4.1 mm,腦表面下7.0 mm。單側(cè)Ce A植入26G不銹鋼套管。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(20 000 U)防感染。術(shù)后大鼠恢復(fù)5 d,使體質(zhì)量升至術(shù)前水平。

        1.3 雙瓶選擇實(shí)驗(yàn)及套管位置鑒定訓(xùn)練開始前24 h,將水瓶從籠中移除。第2天早上8∶30,給予大鼠雙瓶供水,兩個(gè)刻度飲水瓶(250 m L)放置飼養(yǎng)籠前,間隔5 cm,瓶內(nèi)均為蒸餾水;3 h后,將水瓶移除。大鼠在早上8∶30~11∶30進(jìn)行雙瓶飲水,其余時(shí)間禁水。飲水期間將食物撤除。以上述條件適應(yīng)性訓(xùn)練5 d,并進(jìn)行核團(tuán)注射訓(xùn)練,使大鼠適應(yīng)注射過程。

        上述訓(xùn)練后,進(jìn)行雙瓶選擇試驗(yàn),流程如下:實(shí)驗(yàn)前禁水24 h;實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早上8∶15,給予大鼠單側(cè)Ce A注射0.5μL DAMGO(2 nmol,Sigma)或生理鹽水,注射60 s,停留60 s;注射后15 min,將兩個(gè)已知質(zhì)量的水瓶放置飼養(yǎng)籠前,一個(gè)為0.3 mol/L的蔗糖溶液,另一個(gè)為蒸餾水;3 h后,將水瓶移除并稱重,計(jì)算出蔗糖溶液及蒸餾水的攝入量。

        每只大鼠均接受兩次注射,一次為DAMGO,一次為生理鹽水;兩次注射的間隔時(shí)間為3 d。雙瓶選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,向CeA中注入0.5μL膀胺天藍(lán),所有動(dòng)物經(jīng)致死劑量戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(100 mg/kg),并相繼用100 mL生理鹽水及200 mL的100 mL/L甲醛溶液經(jīng)左心室灌流固定,剝離腦組織,置入100 mL/L甲醛溶液中。腦組織做冠狀冰凍切片(片厚40μm)。在切取的腦片中,選取含有CeA的切片,光鏡下參照大鼠腦圖譜對套管位置進(jìn)行定位。

        1.4 CeA內(nèi)注射DAMGO后蔗糖溶液攝入引起的Fos表達(dá)訓(xùn)練開始前24 h,將水瓶從籠中移除。第2天早上9∶30,將水瓶放回飼養(yǎng)籠前,瓶內(nèi)為蒸餾水;2 h后,將水瓶移除。大鼠在早上9∶30~11∶30飲水,其余時(shí)間禁水。飲水期間將食物撤除。以上述條件適應(yīng)性訓(xùn)練5 d,并進(jìn)行核團(tuán)注射訓(xùn)練,使大鼠適應(yīng)注射過程。

        上述訓(xùn)練后,15只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(n =7)和DAMGO組(n=8),進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前禁水24 h;實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早上9∶15,給予大鼠單側(cè)Ce A注射0.5μL DAMGO(2 nmol,Sigma)或生理鹽水,注射60 s,停留60 s;注射后15 min,將水瓶放置飼養(yǎng)籠前,瓶內(nèi)為0.3 mol/L的蔗糖溶液;2 h后,將水瓶移除,向Ce A中注入0.5μL膀胺天藍(lán),將大鼠用致死量的水合氯醛麻醉,開胸,先以0.01 mol/L PBS(p H 7.4)100 m L經(jīng)左心室至主動(dòng)脈進(jìn)行快速灌注,然后用含750 g/L飽和苦味酸和40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PB(p H 7.4)250 m L快速灌注固定,再以同樣的灌注液250 m L緩慢滴注,持續(xù)1.5~2 h。灌注完畢后取腦組織,后固定4 h,再移入250 g/L蔗糖溶液中,4℃過夜。腦組織完全沉底后,用冰凍切片機(jī)冠狀切取,片厚40μm,用0.01 mol/L PBS沖洗3次,每次10 min,用于Fos免疫組化標(biāo)記。

        1.5 套管位置鑒定及Fos免疫組化檢測切取的腦片中,選取含有CeA的切片,光鏡下參照大鼠腦圖譜對套管位置進(jìn)行定位,套管位置正確的大鼠繼續(xù)進(jìn)行Fos免疫組化實(shí)驗(yàn)。

        切片先后經(jīng)3 m L/L的雙氧水和3 m L/L Triton X-100孵育后,50 m L/L的山羊血清封閉1 h后,加rabbit anti-c-Fos一抗(Abcam,1∶800稀釋)的抗體稀釋液并應(yīng)用鏈霉親和素-過氧化物酶試劑盒(Zhongshan Bio-tech Co.)進(jìn)行二抗及辣根過氧化物酶-卵白素孵育;最后利用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)使免疫反應(yīng)產(chǎn)物顯色。將染色切片在光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。此外,另取一套腦片,進(jìn)行陰性對照(不加一抗)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行Fos免疫陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)時(shí),對于不同的核團(tuán),雙側(cè)均計(jì)數(shù)后取平均值。

        1.6 數(shù)據(jù)處理各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。雙瓶選擇實(shí)驗(yàn)中,每只大鼠均接受兩種不同處理,即DAMGO注射以及生理鹽水注射,屬于同源配對,采用配對t檢驗(yàn);Fos表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)大鼠被隨機(jī)分成兩組,即DAMGO組及生理鹽水組,采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05作為有顯著性差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

        2 結(jié) 果

        2.1 組織學(xué)定位參考大鼠腦圖譜(圖1),雙瓶選擇實(shí)驗(yàn)15只大鼠中有4只Ce A定位不準(zhǔn)確,另有1只大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)套管脫落,所以最終有10只大鼠的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析。每只大鼠間隔3 d先后接受DAMGO和生理鹽水,因此,雙瓶選擇實(shí)驗(yàn)DAMGO組及生理鹽水組最后均有10只大鼠的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析。Fos表達(dá)實(shí)驗(yàn)15只大鼠中有4只Ce A定位不準(zhǔn)確,所以最終有11只大鼠的數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析,其中生理鹽水組5只,DAMGO組6只。

        圖1 顯微照片顯示套管位置Fig.1 Photomicrograph showing representative cannula placement

        2.2 雙瓶選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生理鹽水組相比,Ce A內(nèi)注射DAMGO使大鼠在3 h內(nèi)攝入0.3 mol/L蔗糖溶液的量顯著增加(t=-3.886,P=0.004);兩組對蒸餾水的攝入量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.419,P=0.658,圖2)。

        圖2 CeA內(nèi)注射DAMGO對0.3 mol/L蔗糖溶液及蒸餾水?dāng)z入的影響Fig.2 Effects of intra-CeA injection of DAMGO on the intake of 0.3 mol/L sucrose solution and distilled water in rats

        2.3 CeA內(nèi)注射生理鹽水或DAMGO后蔗糖攝入引起的Fos表達(dá)情況與生理鹽水組相比,Ce A內(nèi)注射DAMGO后蔗糖攝入引起的Fos表達(dá)在以下核團(tuán)均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:伏隔核(核)(t= -4.751,P=0.001),弓狀核(t=-6.425,P= 0.000),外側(cè)下丘腦(t=-6.117,P=0.000),吻端孤束核(t=-3.128,P=0.012),中間孤束核(t= -5.010,P=0.001)及尾端孤束核(t=-3.817,P=0.004)(表1、圖3)。

        表1 CeA內(nèi)注射生理鹽水或DAMGO后蔗糖攝入引起的不同核團(tuán)的Fos免疫陽性神經(jīng)元數(shù)Tab.1 The number of sucrose intake induced Fos-immunoreactive neurons under the condition of saline or DAMGO administration in Ce A

        圖3 CeA內(nèi)注射生理鹽水或DAMGO后蔗糖攝入引起的不同核團(tuán)的Fos表達(dá)Fig.3 Microphotographs showing sucrose intake induced Fos-immunoreactive expression in different nuclei under the condition of saline or DAMGO administration in Ce A

        3 討 論

        c-Fos是一種典型的在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)的即刻早期基因。細(xì)胞外的多種刺激均能誘導(dǎo)其快速、短暫及特異性表達(dá)。因此,大量研究以c-Fos作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元激活的解剖標(biāo)志[7-8]。蔗糖溶液的攝入可引起許多腦區(qū)或核團(tuán)的c-Fos表達(dá),包括伏隔核、下丘腦、杏仁核、臂旁核及孤束核等[9-10]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),Ce A內(nèi)注入MOR激動(dòng)劑DAMGO可增加大鼠對蔗糖溶液的攝入,且在CeA內(nèi),蔗糖溶液攝入相關(guān)的神經(jīng)元表達(dá)MOR[4]。本研究為進(jìn)一步明確Ce A內(nèi)DAMGO注射通過激活哪些相關(guān)核團(tuán)來增加蔗糖溶液的攝入;因此將Ce A內(nèi)DAMGO注射與蔗糖溶液攝入相結(jié)合,探討Ce A內(nèi)DAMGO注射對于蔗糖溶液攝入引起的Fos表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,Ce A內(nèi)注入DAMGO后蔗糖攝入引起的Fos表達(dá)在伏隔核(核)、弓狀核、外側(cè)下丘腦、吻端孤束核、中間孤束核及尾端孤束核均增加,表明CeA內(nèi)MOR的激活可能通過作用于這些核團(tuán)參與大鼠蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié)。

        Ce A內(nèi)DAMGO注射增加伏隔核內(nèi)蔗糖攝入引起的Fos表達(dá),可能部分是由于這兩個(gè)核團(tuán)之間的相互神經(jīng)投射引起的[6,11]。此外,這些部位之間的多突觸傳導(dǎo)通路也可能解釋本研究的結(jié)果。許多研究表明,杏仁核,下丘腦,臂旁核及孤束核之間存在密切的解剖學(xué)投射關(guān)系[12-15],因此,這些結(jié)構(gòu)之間存在直接或間接的纖維聯(lián)系。盡管到目前為止,沒有研究表明Ce A與弓狀核之間存在直接的纖維聯(lián)系,但與Ce A有直接纖維聯(lián)系[16]的臂旁核及尾端孤束核向下丘腦有大量的纖維投射[17]。因此,臂旁核或尾端孤束核可能作為Ce A與弓狀核聯(lián)系的中轉(zhuǎn)站。同樣,目前為止尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道Ce A與外側(cè)下丘腦之間有直接纖維聯(lián)系,但CeA和外側(cè)下丘腦均與臂旁核之間存在纖維投射[18-19],故可通過臂旁核的中轉(zhuǎn),CeA與外側(cè)下丘腦之間可能存在間接的纖維聯(lián)系。

        尾端孤束核主要接受內(nèi)臟感覺神經(jīng)的投射[20],與下丘腦、杏仁核及臂旁核之間存在相互的神經(jīng)纖維投射。因此,尾端孤束核與CeA之間存在直接的纖維聯(lián)系。中間孤束核內(nèi)有瘦素受體的分布,且該受體可被外周給予的瘦素激活;外周給予瘦素可以改變大鼠對蔗糖溶液的攝入[21-22]。因此,中間孤束核可能參與蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié)。吻端孤束核是味覺信息傳遞的第一級(jí)中樞[23],與外側(cè)下丘腦及CeA均有直接的纖維聯(lián)系;此外,吻端孤束核及Ce A也可能通過臂旁核存在間接的纖維聯(lián)系。

        LEVINE[6]研究發(fā)現(xiàn),Ce A內(nèi)注入DAMGO僅可增加伏隔核殼部的c-Fos表達(dá),而對于其他腦區(qū)或核團(tuán)的c-Fos表達(dá)并沒有影響。本研究先在Ce A內(nèi)注入DAMGO,再觀察在此狀態(tài)下,蔗糖攝入在腦組織各核團(tuán)引起的Fos表達(dá)情況。在所觀察的核團(tuán)中,很多核團(tuán)的Fos表達(dá)并沒有增加,但不能說明這些核團(tuán)的神經(jīng)元活動(dòng)沒有發(fā)生變化。Fos可以作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元激活的解剖標(biāo)志;但如果某個(gè)核團(tuán)的神經(jīng)元被抑制,F(xiàn)os則無法將其反映出來。

        綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ce A內(nèi)MOR的激活可能通過作用于伏隔核、弓狀核、外側(cè)下丘腦及孤束核參與大鼠蔗糖溶液攝入的調(diào)節(jié),但對于通過何種纖維投射或何種神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用等具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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        (編輯 國 榮)

        Injection ofμopioid receptor agonist DAMGO into the central nucleus of amygdala increases sucrose solution intake induced Fos expression in rats

        SUN Bo,YAN Jian-qun,WANG Qian,ZHAO Xiao-lin,LI Jin-rong,YAN Wei,SONG Lin
        (Department of Physiology and Pathophysiology,Medical School of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,China)

        ObjectiveTo determine the effects ofμopioid receptor(MOR)in the central nucleus of amygdala(Ce A)on sucrose solution intake in rats and related mechanisms.MethodsSprague-Dawley rats

        intra-CeA injection of MOR agonist DAMGO or saline,and then underwent two-bottle choice test between sucrose solution and distilled water.After intra-Ce A injection of DAMGO or saline,F(xiàn)os expression induced by sucrose solution intake was labeled and identified in different brain nuclei with immunohistochemistry.ResultsCompared with saline injection,intra-CeA injection of DAMGO significantly increased sucrose solution intake in rats over a 3-h period and increased Fos expression induced by sucrose solution intake in nucleus accumbens(core),arcuate nucleus,lateral hypothalamus,rostral nucleus tractus solitarius,medial nucleus tractus solitarius and caudal nucleus tractus solitarius.ConclusionActivation of MOR in Ce A may stimulate NAcc,ARC,LH and NST to modulate sucrose solution intake in rats.

        central nucleus of amygdala;μopioid receptor;sucrose solution intake;Fos

        R338

        A

        1671-8259(2014)05-0581-05

        10.7652/jdyxb201405003

        2013-12-10

        2014-03-05

        國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31300966;31371107);中國博士后科學(xué)基金(No.2013M540761) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.31300966;31371107)and the National Science Foundation for Post-doctoral Scientists of China(No.2013M540761)

        閆劍群,教授.E-mail:jqyan810@gmail.com

        孫波(1985-),女(漢族),博士,講師.E-mail:sunbo1217@mail.xjtu.edu.cn

        時(shí)間:2014-07-22 16∶11 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1611.001.html

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