劉恩岐，范江霖

(1.西安交通大學心血管研究中心脂代謝和動脈粥樣硬化實驗室，陜西西安 710061；2.西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，陜西西安 710061；3.日本山梨大學醫(yī)學部分子病理學教研室，日本山梨 409-3898)

◇專家述評◇

動脈粥樣硬化的轉化醫(yī)學研究進展

劉恩岐1，2，范江霖3

(1.西安交通大學心血管研究中心脂代謝和動脈粥樣硬化實驗室，陜西西安 710061；2.西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，陜西西安 710061；3.日本山梨大學醫(yī)學部分子病理學教研室，日本山梨 409-3898)

專家介紹

劉恩岐，醫(yī)學博士，教授，病理學和病理生理學、藥理學博士生導師?，F(xiàn)任西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心主任，西安交通大學心血管研究中心PI。研究方向為實驗病理學、藥理學和實驗動物學。近年來，主持國家自然科學基金等科研項目10余項。利用動物模型研究人類動脈硬化相關疾病及脂質代謝取得重要進展，在國際期刊發(fā)表重要學術論文40余篇；現(xiàn)任Res J Biol Sci，World J Herpetol等期刊編委；國際動脈粥樣硬化學會中國分會理事、中國病理生理學會動脈粥樣硬化專業(yè)委員會委員、中國實驗動物學會常務理事、陜西省實驗動物學會會長、陜西省醫(yī)學會生殖內分泌分會副主委、陜西省醫(yī)學會病理學會常委。

動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)是威脅全人類健康、導致死亡率最高的疾病，ASCVD病理基礎是動脈粥樣硬化(AS)。本文回顧了ASCVD流行概況以及AS發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程，總結了ASCVD危險因素和新的生物標記。結合自己的研究經驗，作者認為C反應蛋白是ASCVD marker而不是maker?；蚯贸彝媚Ｐ椭谱鞒晒Γ瑢ρ芯咳祟怉SCVD提供了新的手段。本文討論了美國ACC/AHA最新頒布的《2013版膽固醇治療降低成人ASCVD風險指南》中他汀治療降低血脂方案對中國人的啟示，并提出當他汀單獨使用不能滿足抗ASCVD效果時，他汀與其他藥物聯(lián)合使用是一種有效防治ASCVD的策略。

動脈粥樣硬化；流行；幼兒；病理；家兔；危險因素；C反應蛋白；他汀

臨床上動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)是指一系列由動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起的疾病，包括冠脈綜合征(acute coronary syndromes)、心肌梗死(myocardial infarction，MI)、穩(wěn)定或不穩(wěn)定心絞痛(stable or unstable angina)、冠脈或其他動脈血運重建(revascularization)、卒中(stroke)、短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack)或動脈粥樣硬化性外周動脈疾?。?］。ASCVD是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)最主要類型。

1 動脈粥樣硬化是一種現(xiàn)代流行的古老疾病

AS是ASCVD共同的病理基礎，AS斑塊(plaques)堵塞動脈管腔，使受阻動脈破裂或缺血，引起腦卒中、MI等，造成ASCVD事件［2］。

ASCVD是威脅人類健康、導致死亡率最高的疾病。據世界衛(wèi)生組織(the World Health Organization，WHO)統(tǒng)計，2008年，全世界1 700萬人死于ASCVD，占整個疾病死亡率30%。ASCVD引起的死亡80%發(fā)生在低、中等收入國家。2030年，ASCVD死亡人數(shù)將增加到2 330萬人［3］。我國歸因ASCVD死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)大約39%［4］。ASCVD也是發(fā)達國家過早死亡最常見的原因。2010年，美國ASCVD相關疾病所致死亡率占整個疾病總死亡率31.9%［5］，比中國低。歐洲每年有435萬人死于ASCVD，其中英國占35%［6］。

ASCVD死亡率存在地理分布、性別差異。歐洲中部、東部最高，意大利、法國和日本最低。隨著年齡的增長，男性ASCVD死亡率比女性高。除了地理分布和性別因素外，ASCVD也受種族和社會階層影響。英國境內來源于南亞人群死亡率比平均值高，而來源于加勒比黑人死亡率比平均值低［6］。歸因于ASCVD死亡率在相對貧困社會階層或發(fā)展中國家更加顯著，并且呈上升趨勢。如，MORAN等［7］通過使用計算機模型預測，由于老齡化、吸煙、高血壓和其他一些客觀因素影響，2030年，中國人ASCVD及相關疾病死亡率將有可能暴漲至73%。相比于發(fā)展中國家，發(fā)達國家歸因于ASCVD死亡率相對較低，且發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。如2000～2010年間，美國ASCVD死亡率降低31.0%；與2008年相比，2010年ASCVD所致死亡率下降0.8%［5］。

目前，ASCVD是危害人類健康的第一殺手，讓我們誤以為這是一種現(xiàn)代病。其實，ASCVD是一種古老的疾病。

現(xiàn)有的證據表明早在5 000年前人類就患有AS。通過電子計算機X射線斷層掃描技術發(fā)現(xiàn)，1991年在意大利阿爾卑斯山發(fā)現(xiàn)的公元前5 300年前冰人(Tyrolean iceman)、3 600年前古埃及木乃伊、公元前700年中國古尸存在AS，在木乃伊主動脈、冠狀動脈、頸總動脈、髂動脈和股動脈等發(fā)現(xiàn)動脈壁鈣化(calcification)現(xiàn)象，在木乃伊中普遍存在的AS表型與現(xiàn)代人AS發(fā)生部位和表型特征相似［8-9］。從西安秦兵馬俑博物館中的將軍俑隆起的將軍肚和肥胖的體型也可以推斷，秦代部分人群也具備了患代謝綜合征(metabolic syndrome)和AS的基本條件，由此可見AS是一種現(xiàn)代流行的古老疾病。

2 動脈粥樣硬化起始于嬰幼兒、伴隨終生

AS并不是單純老年病，而是從嬰幼兒開始發(fā)生、發(fā)展，伴隨絕大多數(shù)人一生的疾病。

1908年，F(xiàn)REMONT-SMITH［10］對死于急性傳染病的兒童尸檢時發(fā)現(xiàn)了AS，并認為急性感染與動脈疾病存在某種聯(lián)系。到了上個世紀30年代，就有學者提出AS可能發(fā)生在嬰兒出生前到死亡每一個年齡階段［11］。ENOS等［12］對朝鮮戰(zhàn)爭中死亡的18～48歲美國士兵尸檢時，發(fā)現(xiàn)77.3%的士兵冠狀動脈能夠看見AS斑塊，引起了世人對年輕人AS的關注。HOLMAN等［13］全面分析了年輕人AS發(fā)病情況，通過觀察1～40歲的526份死亡患者尸檢結果，發(fā)現(xiàn)嬰兒剛出生不久動脈壁開始出現(xiàn)AS脂質條紋(fatty streak)，隨后AS病變緩慢發(fā)展，8歲以后AS病變進程明顯加快，20歲左右出現(xiàn)AS纖維斑塊病變(fibrous plaques)并持續(xù)到30歲，這時90%尸檢病例在主動脈壁可見不同程度的纖維斑塊。脂質條紋發(fā)展到纖維斑塊大約需要15年。該研究有意思的是還發(fā)現(xiàn)高加索人(Caucasian)容易患AS。日本學者TANAKA等［14］對1月齡～39歲的2 856日本人群觀察結果與HOLMAN等50年前發(fā)現(xiàn)有相似之處：1歲以前，29%兒童主動脈出現(xiàn)脂質條紋；1～9歲之間，3.1%和1.9%兒童在冠狀動脈和腦動脈出現(xiàn)脂質條紋；10歲以后，冠狀動脈和腦動脈AS損傷隨年齡增加；20歲左右，脂質條紋發(fā)展迅速；30歲以后，纖維斑塊迅速增加。年齡、血液膽固醇(cholesterol)水平、血壓與AS形成密切相關。另外一項研究也發(fā)現(xiàn)，8月齡，45%嬰兒動脈內膜(tunica intima)有泡沫細胞形成；10～14歲，61%兒童動脈內膜中出現(xiàn)大量泡沫細胞(foam cell)、脂質條紋；出現(xiàn)嚴重病變的(advanced lesions)年齡和發(fā)病率如下：10～14歲7%，15～19歲14%，20～24歲21%，25～29歲33%，30～34歲61%，30～39歲66%，男性比女性更嚴重［15］。

從以上幾個研究結果可以看出，人類AS開始于嬰幼兒時期，嬰兒出生第一年就可能出現(xiàn)AS損傷。然而AS發(fā)生和發(fā)展需要許多遺傳和環(huán)境有關的危險因素(risk factors)。因此，預防人類AS也應該提前至嬰幼兒期［16］。

3 動脈粥樣硬化動脈內膜下的慢性病變

動脈壁由里到外由內膜(intima)、中膜(tunica media)和外膜(adventitia)3層構成。內膜是血管壁內層表面，是由一層內皮細胞(endothelial cell)覆蓋整個血管內壁，內膜直接與血液接觸。與大多數(shù)動物不同的是，人動脈血管內膜中有平滑肌細胞(smooth muscle cells，SMCs)；血管中膜也就是中層由細胞外基質(extracellular matrix)和SMCs組成。動脈外膜外層有纖維母細胞、脂肪、神經末梢和營養(yǎng)血管。依據動脈口徑和管壁組織結構，動脈可分為大動脈(富含彈性纖維)、中動脈(如冠狀動脈)和小動脈(直徑小于2 mm)。發(fā)生AS動脈一般在肌性動脈(冠狀動脈、腦動脈、頸動脈、腎動脈等)和彈性動脈(主動脈)［17］。

嚴格意義講，病理學上動脈硬化(arteriosclerosis)指3種不同的動脈硬化疾病，包括AS(病灶中含有脂質和壞死細胞構成的“粥樣”成分)、門克伯格氏中膜鈣化性硬化(Monckeberg medial sclerosis)(老年性中膜肌性動脈鈣化)和微(小)動脈硬化(高血壓引起的微、小動脈透明樣變和增生)［17］。一般而言，臨床上所說的動脈硬化就是指AS。

動脈粥樣斑塊(atheromatous plaques)的形成是起源于內膜下，持續(xù)發(fā)展的慢性炎癥反應過程。

1829年，法國病理學家JEAN LOBSTEIN第一次提出了AS概念。19世紀50年代，德國病理學家RUDOLF VIRCHOW認為AS是由于細胞在大動脈集聚引起的細胞病變過程，強調炎癥，而奧地利CARL VON ROKITANSKY則認為血管損傷和毒素是AS元兇。1910年，德國化學家ADOLF WINDAUS發(fā)現(xiàn)AS斑塊存在膽固醇，第一次將膽固醇與AS聯(lián)系起來。3年后，俄國的ANITSCHKOW和CHALTOW用高膽固醇飼料(high cholesterol diet，HCD)在家兔體內成功誘導出AS病變，將膽固醇與AS聯(lián)系起來是20世紀最偉大的發(fā)現(xiàn)之一。到了20世紀70年代，形成損傷應答學說(response-to-injury)，認為機械損傷、毒性、氧自由基等造成血管內皮細胞損傷，進而引起血管內膜改變、形成AS?，F(xiàn)在，越來越多的研究證明，慢性炎癥和免疫在AS發(fā)生和發(fā)展中起重要作用［2，6，18］。

基于動物實驗和人體研究，現(xiàn)在可以基本勾畫出AS發(fā)生和發(fā)展的過程。AS最初是從位于動脈壁的單層內皮細胞變化開始。在正常情況下，動脈內皮細胞抵抗血液中白細胞在動脈壁粘附，然而，受到血脂異常、高血壓或促炎癥介質刺激后，內皮細胞能夠表達一些粘附分子(adhesion molecules)，促使白細胞粘附在動脈壁。與此同時，血管內皮通透性和內膜下細胞外基質發(fā)生變化，促進含膽固醇的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)穿透血管壁進入內膜。內膜中LDL氧化修飾后，通過內吞作用(endocytosis)進入單核細胞源性巨噬細胞，導致巨噬細胞內膽固醇的積累。趨化介質(chemoattractant factor)則直接促使粘附在動脈壁的白細胞遷移到血管內膜，在局部動脈引起AS病變。盡管所有動脈均受到AS危險因素刺激，但可能由于不同部位動脈血流動力學不同，AS病變只分布在整個動脈特定部位。存在正常層流剪切力(laminar shear stress)位置的動脈不發(fā)生AS，因為正常層流剪切力能夠誘導內皮表達具有AS保護作用相關基因，因而這些部位不易誘發(fā)AS。動脈AS病變中最多的白細胞是單核細胞，單核細胞分化成巨噬細胞。吞噬了脂蛋白顆粒的巨噬細胞就變成了顯微鏡下可見的泡沫細胞。在AS病變中至少有M1和M2兩種巨噬細胞表型已經被確定，M1巨噬細胞具有促炎特性，分泌白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子等促炎癥因子。而M2型巨噬細胞被認為是“好”的巨噬細胞，具有抗炎作用。除了巨噬細胞外，AS斑塊還有一些其他非吞噬性炎癥細胞，包括樹突狀細胞(dendritic cells)，可能起抗原遞呈作用；T淋巴細胞和肥大細胞(mast cells)也存在于AS病變中，但其數(shù)量遠遠低于吞噬性巨細胞(phagocytes)。在AS病變中雖然T細胞數(shù)量極少，但它有可能在AS斑塊形成和穩(wěn)定性方面起關鍵作用［19-20］。

在AS形成過程中，募集SMCs從中膜進入內膜、受血小板源性生長因子刺激增殖，進入內膜的SMCs分泌細胞外基質分子，包括間質膠原(interstitial collagen)、彈性纖維，形成纖維帽(fibrous cap)包裹AS斑塊中巨噬細胞源性泡沫細胞(或已死細胞)和脂質。由于胞葬作用(efferocytosis)的缺失，加速了細胞碎片和細胞外脂質的沉積，在AS斑塊中形成富含脂質的壞死核(necrotic core)［20］。

AS直接后果是流動限制性狹窄，導致組織缺血或者是形成血栓中斷血流供應，出現(xiàn)臨床癥狀(如，心臟病發(fā)作或中風)。斑塊破裂可能通過再生或結疤治愈，但會增加斑塊大小。但奇怪的是，臨床上發(fā)現(xiàn)血栓發(fā)生部位并不總是AS斑塊最大、血管最狹窄的地方，相反，血栓經常發(fā)生在自身破裂斑塊，這是一類易損斑塊(vulnerable plaque)，通常有薄的、缺乏膠原蛋白的纖維帽，斑塊內缺乏SMCs、但巨噬細胞豐富。炎癥細胞既能產生膠原溶解酶(collagenolytic enzymes)，降解膠原加速斑塊破裂，也能產生炎癥介質，引起SMCs死亡、膠原減少［20］。我們通過轉基因(transgenic，Tg)家兔模型研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞過表達(overexpression)基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)12能夠促進AS發(fā)生和發(fā)展［21］。AS斑塊中巨噬細胞也產生促凝組織因子(pro-coagulant tissue factor)，誘發(fā)血栓形成。另外，AS斑塊中微血管形成可能有效刺激、增加斑塊不穩(wěn)定性［20］。

按照AS病理形態(tài)學，美國心臟學會(American Heart Association，AHA)將AS為Ⅰ～Ⅵ型。Ⅰ型，泡沫細胞最初聚集；Ⅱ型，多層泡沫細胞，脂紋形成；Ⅲ型，AS斑塊前期病變，細胞外脂質形成；Ⅳ型，AS斑塊形成伴脂質聚集；Ⅴ型，纖維斑塊；Ⅵ型，復合病變，可能有表面破損、出血、血栓、鈣化斑塊等。其中Ⅰ和Ⅱ型為早期病灶，一般發(fā)生在嬰兒和兒童。Ⅲ型為中間型病灶，青春期后發(fā)展迅速。晚期病灶分為3個主要組織學類型Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，這些病灶從30歲以后及中老年分別占優(yōu)勢［22-23］。

通過觀察AS發(fā)生和發(fā)展過程，可以看出AS形成是血管內膜下滲透進來的炎癥細胞和動脈固有細胞(如SMCs和內皮細胞)相互作用的過程，共同影響AS形成和并發(fā)癥。經過幾十年的努力，雖然我們在研究AS發(fā)生和發(fā)展過程方面積累了較為豐富的經驗，但AS涉及復雜的病理過程，受多種危險因素調節(jié)，多種細胞和細胞因子參與其中，關于AS病理過程仍有許多未知，需要我們不斷探索、繼續(xù)深入研究［24］。

4 動脈粥樣硬化歸因于眾多危險因素

1948年，美國在波士頓附近Framingham小鎮(zhèn)啟動了Framingham心臟研究(Framingham Heart Study)計劃，目標是識別ASCVD危險因素?？蒲腥藛T首次招募了30～62歲Framingham居民5 209人，參與者每2年接受一次詳細醫(yī)學檢測。1971年，再次招募了5 124名第1代參與者子女及其配偶，成為了第2代檢測參與者；2002年，又招募了4 095名第1代參與者孫及其配偶，成為了第3代參與者。通過60多年持續(xù)監(jiān)測參與者健康狀況和生活習慣，F(xiàn)ramingham心臟研究不僅僅里程碑式地創(chuàng)造性地提出ASCVD危險因素概念，而且還讓人們相信，通過生活方式改變可以預防或減輕ASCVD危害(http：// www.framinghamheartstudy.org/)。

危險因素是一個流行病學概念，定義為當存在或暴露于某種因素時，特定疾病發(fā)生危險性增加40%以上，這種因素即為危險因素［6］。對ASCVD產生因果影響的因素稱為ASCVD危險因素。

表1所示AS危險因素包括遺傳和環(huán)境兩大類，涵蓋了遺傳、生活方式、生物化學和生理學特征。AS一些危險因素是可以改善的，而另一些則不能(如，性別和年齡)。致AS的LDL升高是AS主要危險因素，動物實驗和臨床觀察已經證實遺傳影響血液脂蛋白水平、肥胖和其他一些危險因素［25］。在很多人群中統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，AS遺傳力(heritability)大于50%。遺傳與環(huán)境相互作用影響AS。WHO估計，在發(fā)達國家超過60%冠心病患者和40%缺血性腦卒中患者發(fā)病原因是血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)超過了正常水平［6］。

吸煙可以增加ASCVD風險。英國50年研究發(fā)現(xiàn)，與不吸煙的人群相比，吸煙人群冠心病死亡率高達60%(嚴重吸煙高達80%)，其中吸煙人群中50%將遭受到致命MI［26］?，F(xiàn)在人們已經普遍認識到，不良的飲食會增加ASCVD風險。WHO估計在發(fā)達國家僅有不到30%冠心病患者和20%吸煙者蔬菜和水果消費水平低于600 g/d［6］。

經常運動預防ASCVD。在發(fā)達國家預計超過20%冠心病患者和10%腦卒中患者缺乏運動。適度酒精攝入(1～2次/d)會減少ASCVD風險，但如果酒精攝入過多、酗酒，ASCVD風險增大。WHO估計，發(fā)達國家男性中2%冠心病和超過5%腦卒中與飲酒有關。超重和肥胖也增加ASCVD風險。發(fā)達國家中大約1/3冠心病和缺血性腦卒中患者體重指數(shù)(body weight index，kg/m2)大于21［6］。ASCVD也與血管收縮壓和血管舒張壓有直接關系。INTERHEART研究表明，在西歐22%心臟病與高血壓病史有關。糖尿病大幅增加患冠心病風險?；加?型糖尿病男性AS-CVD風險增加2～4倍，女性風險更高(3～5倍)。糖尿病不僅增加了ASCVD風險，而且還放大了ASCVD危險因素(高膽固醇、血壓、吸煙及肥胖)［26］。

表1 AS遺傳和環(huán)境相關的危險因素Tab.1 Genetic and environmental risk factors for atherosclerosis

表1給出了AS傳統(tǒng)危險因素，綜合主要危險因素(如年齡、性別、體質量、高血壓、血脂、糖尿病)，可以綜合評分、預測ASCVD事件。產生重大影響是Framingham危險評分(Framingham Risk Score，F(xiàn)RS)，F(xiàn)RS用于預測冠心病患者死亡率、非致死性心肌梗死發(fā)生率及CVD事件；其次是Joint British Societies評分，用于評價冠心病死亡率和非致死性心肌梗死等［27］。遺憾的是這兩個ASCVD危險評分是基于西方人群觀察結果。2013年，美國心臟病學會(American College of Cardiology，ACC)及AHA在共同頒布了《2013版膽固醇治療降低成人ASCVD風險指南》(《ACC/AHA 2013指南》)，使用匯集隊列方程(Pooled Cohort Equations)評估10年ASCVD事件風險(首次發(fā)生冠心病或卒中)?！禔CC/AHA 2013指南》采用危險因素包括年齡、性別、種族、TC、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein，HDL-C)、LDL膽固醇(LDL-C)、收縮壓、降壓藥、糖尿病狀況和吸煙情況。評估危險因素與Framingham危險評分相比增加了種族和糖尿?。?］。對于我國患者來說，以西方人群為觀察對象的ASCVD評分模型是否能夠應用于臨床仍需要進一步研究。

ASCVD除了上面提到的經典危險因素外，不斷有新的危險因素被發(fā)現(xiàn)。ASCVD危險因素之間是相互關聯(lián)的，多重危險因素相加會加重ASCVD。

5 CRP是動脈粥樣硬化的marker而不是maker

ASCVD生物標志(biomarker)是人類生物體內發(fā)生的與AS發(fā)病機制有關聯(lián)的關鍵事件指示物，是

ASCVD“替代物”，可用于ASCVD診斷、發(fā)病預測、確定臨床治療方案和治療效果評估。生物標志可以是生物活性分子，如前文提到一些危險因素(LDL-C/ HDL-C、同型半胱氨酸、凝血因子)以及甘油三酯(triglycerides，TG)等是ASCVD常見生物標志。臨床上使用的可定量的一些成像技術也可以用作ASCVD生物標志。如定量冠脈造影、頸動脈內中膜厚度和血管內超聲既可以定性又可以定量反映ASCVD的進展。

經過幾十年的不斷探索，我們在ASCVD預防、診斷、治療取得了長足進步，但ASCVD事件仍居高不下、沒有得到有效遏制。臨床上需要新的生物標志，用于提高ASCVD診斷、治療效果評估。

很多血漿蛋白與ASVCD相關，但只有極少蛋白經過臨床驗證可作為ASCVD生物標志。美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)批準了肌鈣蛋白I(troponins，TnI)和T(Tn T)、肌球蛋白(myoglobin)、載脂蛋白A(apolipoprotein A，apoA)、B-型尿鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、肌酐激酶MB(creatinine kinase-MB)等6個血漿蛋白用于作為生物標志用于ASCVD常規(guī)篩選［28］。心肌組織損傷后分泌TnI和Tn T，對于MI診斷有效；BNP由心肌細胞分泌，是充血性心力衰竭(congestive heart failure)診斷和預后主要觀察指標?，F(xiàn)在，使用常規(guī)方法可以臨床檢測這些蛋白。

但是，一些重要生物標志究竟是致ASVCD原因(cause)還是伴隨標志，需要大量深入研究，如目前引人注目的CRP。

CRP由肝臟分泌，機體發(fā)生炎癥、感染與組織損傷急性期時，血漿CRP急劇升高，作為一個經典血漿蛋白標記而被廣泛用于疾病監(jiān)測和診斷。臨床和實驗研究數(shù)據表明，血漿CRP升高可能是ASCVD一個危險因素和生物標記［29］。有人認為CRP升高可能有直接導致ASCVD作用。然而，基因修飾(gene modification，GM)小鼠模型研究反而帶來更大的爭論，不能回答CRP與ASCVD關系［30］。JUPITER (Justification for the Use of Statins in Primary Prevention：an Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin)試驗表明，降脂藥物瑞舒伐他汀(rosuvastatin)可以使血脂正常(LDL-C＜130 mg/d L)但CRP水平升高(≥2.0 mg/L)人群主要ASCVD心血管事件顯著降低［31］。JUPITER研究中，瑞舒伐他汀在降低CRP(3.3→1.8 mg/L)同時也顯著降低LDL-C(109→55 mg/d L)［31］，不能將ASCVD心血管事件降低僅僅歸功于CRP降低。

CRP能不能成為預防或治療ASCVD靶點(target)？我們實驗室利用家兔模型對此開展了一系列研究。

給普通家兔飼喂HCD誘導AS是研究AS最常用的方法之一，我們發(fā)現(xiàn)隨著家兔AS損傷程度的增加，家兔血漿CRP也逐漸升高。家兔血漿CRP水平、AS斑塊中CRP表達量與AS組織損傷程度存在明顯相關關系(r=0.632，P=0.000 3；r=0.617，P=0.001 3)［32］。利用栓塞法誘導家兔腦梗塞，家兔血漿CRP水平隨著梗塞時間的延長也不斷增加，家兔血漿CRP水平與腦梗塞面積正相關(r=0.98，P＜0.01)［33］。除了普通家兔模型外，我們還利用渡邊遺傳性高脂血癥(Watanabe heritable hyperlipidmic，WH HL)家兔，研究了AS與CRP關系，同樣發(fā)現(xiàn)家兔血漿CRP水平與家兔主動脈弓AS損傷面積、血漿TC水平密切相關(n=115，r=0.573 3，P＜0.000 01；n=132，r=0.391 7，P＜0.000 01)。還證明了家兔血漿和AS斑塊中CRP來自肝臟［34］。以上3個實驗初步研究結果表明：家兔血漿CRP水平與家兔血漿TC、家兔AS損傷大小/腦梗塞面積關聯(lián)，CRP可以作為家兔AS生物標記。在研究CRP在普通家兔、AS模型家兔、WH HL家兔表達之后，我們制作了過表達人類CRP的Tg家兔，增加家兔內源性CRP表達。我們發(fā)現(xiàn)Tg家兔血漿中人CRP水平高達(57.8±20.6)mg/L。飼喂HCD 16周后，Tg家兔和同窩非Tg家兔血脂水平、AS斑塊大小、斑塊組成等沒有差異。提示過表達人類CRP不影響家兔主動脈和冠狀動脈AS［35］。另一項研究表明，增加內源性人類CRP可能具有促進球囊損傷(balloon injury)后動脈血栓形成［36］。隨后，我們設法減少WHHL家兔內源性CRP表達，以便研究低CRP水平如何影響AS。我們給WH HL家兔注射了CRP反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)，CRP-ASO治療16周后，WH HL家兔血漿CRP水平明顯降低(雄兔↓61%、雌兔↓56%)，與非治療組相比，CRPASO治療組家兔主動脈和冠狀AS病變均無明顯變化，表明抑制家兔內源性CRP不影響WHHL家兔AS［37］。

通過我們的一組家兔實驗，可以發(fā)現(xiàn)以下事實：CRP與AS發(fā)生和發(fā)展密切相關；升高或抑制內源性CRP，不影響AS發(fā)展過程，提示CRP不是致AS危險因素。結論：CRP可作為AS生物標記，但以CRP作為治療AS靶點是不合適的。最近，通過對15個國家、47流行病學調查研究分析顯示，CRP基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms)影響人血漿CRP水平，但這種遺傳變異造成內源性CRP變化與人冠心病沒有關聯(lián)［38］，支持了我們來自家兔的研究結果。

6 動脈粥樣硬化的動物模型

絕大多數(shù)應用于人類ASCVD臨床方案，最初發(fā)展和測試都是圍繞動物實驗研究來開展的。動物實驗研究提供了一個標準遺傳和環(huán)境控制條件以及標準基因水平操作，這很難適用人體研究；如果初期動物實驗顯示沒有臨床作用，該治療方案可能不必進行人類臨床試驗；ASCVD藥物必須經過動物實驗觀察其毒性，顯示安全性后才考慮臨床應用；動物實驗提供一個獨特視野研究ASCVD病理生理過程和發(fā)病原因，通過動物實驗也可以發(fā)現(xiàn)直接治療的新靶點［］。

有人分析了1980～2000年間，發(fā)表在Nature等7個頂級期刊、平均被引次數(shù)889次、隨后極有可能進行人體試驗的76個動物實驗研究項目(論文)，發(fā)現(xiàn)只有28個(37%)隨后被應用轉化到人類臨床隨機試驗(human randomized trials)中，14個(18%)臨床隨機試驗與動物實驗結果矛盾，34個(45%)動物實驗研究未進行臨床轉化，不了了之。最終，只有8個相關研究被應用于人類疾病治療［40］?？梢钥闯?，即使發(fā)表在頂級期刊、產生廣泛影響的動物實驗研究項目，絕大多數(shù)并不能轉化到人類臨床實踐中去！動物實驗和人類臨床試驗結果不一致，可能原因之一是動物模型將人類疾病一般化了，這些動物模型不能充分模擬人類疾病病理生理特征［41］。

就ASCVD模型而言，20世紀初以來，家兔、小鼠、大鼠、鴿子、豬和猴子等被用來研究AS。我們檢索了Pub Med數(shù)據庫2012年收錄、發(fā)表在Circula-tion、Circulation Research、Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology、Cardiovascular Research和Atherosclerosis等AS相關5個核心期刊論文，共有184篇論文使用動物模型研究AS。其中，162篇使用GM小鼠，使用普通小鼠、家兔、大鼠、非人靈長類和地鼠論文數(shù)分別只有9、6、5、1、1篇，可見GM小鼠模型是目前研究人類AS的核心模型。

雖然小鼠是AS研究占主導地位的動物模型，但普通小鼠HDL占優(yōu)勢、LDL水平低，對飲食中膽固醇不反應，很難誘導AS。近交系(inbred strain)小鼠對飼料誘導AS有一定敏感性。用含膽固醇1.25%、膽酸0.5%和脂肪15%飼料飼喂常用10種近交系小鼠，發(fā)現(xiàn)對AS敏感程度從低到高排序如下：BALB/ cJ＜C3H/J＜A/J＜SWR/J＜NZB/J＜129/J＜AKR/J＜DBA/2J＜C57L/J＜C57BL/6［42］。單一膽固醇和單一膽酸飼料不能誘導小鼠血脂升高及AS損傷?？墒?，含12.5 g/kg膽固醇、5 g/kg膽酸飼料能誘導C57BL/6小鼠出現(xiàn)AS病變，其早期斑塊在形態(tài)學上與人類斑塊相似，但病情進一步發(fā)展之后，其病變部位仍然局限于主動脈弓部，且斑塊不連續(xù)、特點不典型［43］。apoE和LDL受體(receptor)(LDL-r)基因敲除(knock out，KO)小鼠模型出現(xiàn)顛覆了小鼠模型在AS領域應用理念。apoE是清除乳糜微粒(chylomicron)和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)受體的配體，而LDL-r是一種細胞膜表面糖蛋白。apoE或LDL-r基因敲除，會引起血漿中VLDL或LDL積累，進而導致AS病變。apoE-/-和LDL-r-/-小鼠飼喂普通飼料也出現(xiàn)膽固醇血癥(hypercholesterolemia)和AS［44］?，F(xiàn)在，幾乎所有研究基因與AS動物實驗方案，都要在apoE-/-或LDL-r-/-背景下展開。

動物實驗研究在ASCVD研究中不可或缺，但研究ASCVD需要從不同側面和不同層次去探索；同樣，研究ASCVD，不可能僅用小鼠模型完全解決。

家兔屬于兔形目(Lagomorphs)動物，和嚙齒類實驗動物相比，在系統(tǒng)發(fā)育上更接近人類。家兔的妊娠周期短、性成熟早、體形較大、容易實驗操作，不存在嚴重的可以傳染給人的疾病，也是常用實驗動物。家兔脂蛋白特征與人相似(LDL占優(yōu)勢)，脂蛋白代謝方面更適合于人類AS研究［45］。

普通家兔不形成AS，飼喂含3 g/kg膽固醇飼料16周，可以誘導出典型AS病變。WH HL家兔是由LDL-r自發(fā)突變選育的家兔品系，普通飼料就可出現(xiàn)高膽固醇血癥和AS，其臨床特征和病理變化與人家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia)相似，是研究AS最常用動物模型［46］。要了解HCD誘導家兔AS相關技術和方法，可參考我們實驗室發(fā)表的有關論文［47-49］。

GM動物主要包括轉基因(Tg)、基因敲除(KO)、基因敲入(knock in)和基因敲低(knock down)4種類型。ASCVD研究應用最多的是Tg和KO模型。

制作Tg家兔方法主要采用的是將構建好的外源基因直接注射到受精卵的雄原核中，與采用此法制作Tg小鼠過程相似［45］。我們從1994年開始制作Tg家兔，到目前為止已經成功制作了表達肝脂酶(hepatic lipase)［50］、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)［51］、apo(a)［52］、apoB-100［53］、apoE3［54］、MMP-12［21］、VEGF［55］、CRP［35］、apo A-II［56］、apoC-Ⅲ等［57］Tg家兔模型。此外，通過雜交LPL和apo(a)等基因已經被導入到WHHL兔體內，用于研究AS和脂質代謝［45］。

毫無疑問，KO小鼠模型是AS研究的核心模型。傳統(tǒng)制作KO方法是利用DNA同源重組(homologous recombination)原理，對胚胎干細胞(embryo stem cell，ES)實施定向打靶突變、制備KO小鼠。由于缺乏成熟ES細胞，利用ES細胞打靶技術制作KO模型在小鼠以外其他物種中沒有成功，限制了家兔等其他實驗動物使用。

隨著生物技術不斷進步、KO新技術不斷出現(xiàn)并已經成功用于KO動物模型制作。鋅指核酸酶(zincfinger nucleases，ZFN)和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶(transcription-activator like effector nucleases，TALEN)可以對DNA雙鏈分子進行切割，形成DNA雙鏈斷裂切口(DNA double-strand break)，然后激活細胞內非同源末端連接(nonhomologous end joining)，造成移碼突變，從而達到KO目的。常間回文重復序列叢集關聯(lián)蛋白系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9，CRISPR/Cas9)中的cr RNA (CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracr RNA (trans-activating RNA)結合形成tracr RNA/cr RNA雙鏈RNA，指導Cas9蛋白在cr RNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA進行修飾的目的［58］。

利用這3種新技術，我們可以不再依靠ES細胞就可以輕而易舉的對任何物種進行基因打靶而獲得KO模型。目前，我們和其他課題組已經獲得Ig M［59］、apoCIII［60］、RAG 1和RAG 2［61］、以及CD36、LDL-r、Ry R2和apoE［62］KO家兔模型，并將KO家兔模型應用于研究人類AS推向新領域。

7 動脈粥樣硬化的預防和治療

ASCVD是由許多危險因素相互影響、共同作用而形成的伴隨終生的復雜疾病。目前，對其發(fā)病過程仍有許多未知，遺傳、環(huán)境和生活方式影響AS發(fā)生和發(fā)展［6］。在臨床上直接針對AS疾病本身尋找預防措施、實施治療難以操作。Framingham研究創(chuàng)造性提出了危險因素的概念，控制危險因素是目前公認的降低ASCVD風險的有效手段。

臨床常規(guī)檢驗提供的血脂參數(shù)包括TC、HDLC、LDL-C、VLDL-C、TG等。膽固醇是AS斑塊的主要成分，沒有膽固醇就沒有AS斑塊以及由此所誘發(fā)的ASCVD。LDL-C和非HDL-C(non-HDL-C)是致AS膽固醇主要形式。因此，積極控制LDL-C或non-HDL-C水平是降低ASCVD風險的關鍵。

鑒于LDL在ASCVD發(fā)生的病理生理機制中的核心作用，并且大量隨機化臨床研究也證實降低LDL-C可顯著減少ASCVD事件風險，因此在降脂治療中，應將LDL-C作為主要干預靶點［1］。

如何通過干預LDL-C減少ASCVD事件，2013年產生深遠影響的《ACC/AHA 2013指南》給出了詳盡解答。經過系統(tǒng)性綜述、隨機對照試驗(randomized controlled trial，RCT)及其Meta分析，在治療獲益ASCVD患者中，ASCVD事件減少是通過使用最大耐受劑量他汀(statin)強化治療而實現(xiàn)的［63］。沒有RCT提示LDL-C或非HDL-C應達到某種特定目標值而帶來ASCVD事件降低，并且無法評估達到一個更低目標值能夠帶來多少額外ASCVD風險降低，因而，《ACC/AHA 2013指南》不再設定LDLC或非HDL-C目標值［1］。

雖然循證醫(yī)學證據已經表明，將LDL-C目標值降為＜70 mg/d L和(或)LDL-C自基線降幅＞50%，可有效穩(wěn)定和逆轉AS斑塊［1］，但不設定LDL-C或非HDL-C目標值益處也是顯而易見：①避免LDL-C達標的ASCVD患者他汀治療不充分。對中國人群而言，LDL-C基線水平總體偏低，目標值的存在可能導致更多患者得不到充分他汀治療；②設定目標值可能導致未經RCT證實的非他汀藥物過度使用或多種藥物聯(lián)合治療，增加潛在不良事件的發(fā)生風險。

《ACC/AHA 2013指南》推薦了4類他汀治療獲益人群：①存在臨床證據的ASCVD患者；②原發(fā)性LDL-C≥190 mg/d L患者；③無ASCVD臨床證據，年齡為40～75歲，且LDL-C為70～189 mg/d L糖尿病患者；④無ASCVD臨床證據或糖尿病，年齡為40～75歲，LDL-C為70～189 mg/d L，且10年ASCVD風險≥7.5%患者。對于各類患者人群，推薦采用不同強度他汀(阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀)治療方案，以實現(xiàn)最大臨床獲益［1］。中國總體人群ASCVD風險和LDL-C水平低于白人與黑人［64］，即使治療目標相同，他汀適用劑量也應區(qū)別于歐美推薦的劑量。

各種《指南》都將他汀類藥物干預作為預防和治療ASCVD的最主要措施，他汀是羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(HMG-Co A reductase inhibitor)，能夠抑制內源性膽固醇合成酶、降低LDL-C。他汀還可以通過抗炎等多種效應(pleiotropic functions)抗ASCVD。然而，仍有許多患者使用他汀后不能有效防治ASCVD，另外，臨床上也發(fā)現(xiàn)他汀劑量增加1倍，LDL-C降幅只增加5～7%(“他汀6規(guī)則”)［65-66］，增加劑量意味著增加藥物副作用。因此，當他汀不能滿足治療ASCVD效果時，他汀與其他藥物聯(lián)合使用是一種有效防治策略。

普羅布考(probucol)是臨床上使用多年的多酚類抗氧化劑，抗AS，西洛他唑(cilostazol)是3型磷酸二酯酶(type 3 phosphodiesterase)抑制劑，抗血小板凝集。他汀和普羅布考、西洛他唑作用靶點不同，這3種藥低劑量聯(lián)合使用有可能比他汀大劑量單獨使用更有效。為此，在日本大冢制藥株式會社支持下，我們開展了相關動物實驗研究。初步研究發(fā)現(xiàn)，普羅布考和西洛他唑聯(lián)合使用能夠協(xié)同(synergy)增加抗HCD誘導家兔AS的效果［67］。最近，我們比較了阿托伐他汀單獨使用與阿托伐他汀+普羅布考+西洛他唑3藥聯(lián)合使用抗AS效果。給日本大耳白家兔飼喂HCD誘導AS形成，同時每只家兔每天給阿托伐他汀0.005 g；2藥聯(lián)合：普羅布考0.3 g+西洛他唑抗0.3 g；3藥聯(lián)合：阿托伐他汀0.005 g+普羅布考0.3 g+西洛他唑抗0.3 g。藥物治療16周后，我們發(fā)現(xiàn)3組藥物治療都能降低家兔血漿TC水平以及主動脈AS損傷：3藥聯(lián)合AS斑塊面積↓67%、2藥聯(lián)合↓43%、他汀單獨使用↓42%，顯示藥物聯(lián)合能夠額外增加他汀抗AS的效果(圖1)。

圖1 3藥聯(lián)合抗家兔動脈粥樣硬化效果觀察Fig.1 Representative aortic atherosclerotic lesions stained with Sudan IV(A)in rabbits after statin alone treatment (statins)，probucol+cilostazol(PC)and probucol+cilostazol+statin combined treatment(APC)for 16 weeks

8 結語

歸因于AS的ASCVD是影響全人類健康的重大疾病，預防和治療ASCVD給人們帶來沉重經濟負擔。據AHA統(tǒng)計，美國人治療ASCVD費用占全國衛(wèi)生經費支出17%，并可能持續(xù)增長。到2030年，美國ASCVD相關直接醫(yī)療費用將從2010年的2 730億美元增加至8 180億美元［6］。發(fā)達國家基于人群危險因素改善明顯降低了ASCVD死亡率［6］，我國ASCVD發(fā)病率卻在急劇增長，國家和民眾負擔日益加重［7］。我國人群ASCVD知曉率、治療率以及他汀類使用率、控制率均顯著低于發(fā)達國家，ASCVD預防與中國循證醫(yī)學證據相差甚遠［64，68］。

AS病程周期長、發(fā)展過程復雜。我們對AS病因知之有限，將來小鼠以外組織特異性KO動物模型有可能培育成功，將更加有助于我們探索AS的病理生理過程。AS發(fā)生在嬰幼兒時期，提醒我們ASCVD防線應前移至生命早期。在保障兒童身體健康發(fā)育基礎上，提倡良好生活方式，干預環(huán)境相關AS危險因素；依照基于西方人群制定的ASCVD防治策略，尋找適合中國人群的ASCVD干預措施；實施大人群RCT研究、積累循證醫(yī)學證據；基于中國人遺傳變異和生物標志，推行ASCVD個體化防治；大力推進他汀調脂治療，阻止LDL-C致AS的過程，有可能遏止未來20年中國人群的ASCVD的迅速增長。

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(編輯 韓維棟)

Recent advances in translational research of atherosclerosis

LIU En-qi1，2，F(xiàn)AN Jiang-lin3
(1.Laboratory for Lipid Metabolism and Atherosclerosis，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；2.Laboratory Animal Center，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3.Department of Molecular Pathology，Interdisciplinary Graduate School of Medicine and Engineering，University of Yamanashi，Yamanashi 409-3898，Japan)

Atherosclerotic cardiovascular disease(ASCVD)caused by atherosclerosis is the most frequent cause of mortality in the world.It has been shown that atherosclerosis in the human can be traced back to the ancient time.The process of atherosclerosis starts as early as infancy，and the disease progresses throughout the whole life. In this paper，we first review the epidemiology of ASCVD，and then summarize the pathologic process and risk factors for atherosclerosis as well as some novel biomarkers of ASCVD.Our previous study revealed that C-creative protein，a new biomarker of ASCVD，does not play a role as a maker in atherosclerosis.Knock-out rabbit models can be created by recent novel biotechnologies and will become an ideal and powerful animal model of atherosclerosis.It is well known that statins are potent lipid-lowering drugs by inhibiting the enzyme HMG-Co Areductase，and have been proved effective in preventing and treating ASCVD.The therapy of statins for Chinese patients with ASCVD is recommended based on 2013 ACC/AHA Guideline on the Treatment of Blood Cholesterol to Reduce Atherosclerotic Cardiovascular Risk in Adults.If patients with ASCVD cannot be effectively treated with statins alone，there is a need to have alternative therapies in combination with other drugs.

atherosclerosis；epidemiology；infancy；pathology；rabbit；risk factor；C-creative protein；statins

R543.5

A

1671-8259(2014)05-0565-11

10.7652/jdyxb201405001

2014-06-26

2014-07-05

國家自然科學基金資助項目(No.81070250，81270348)；國家科技支撐計劃項目(No.2012BAI39B02)；陜西省科技創(chuàng)新工程重大科技專項(No.2012FWPT-03) Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81070250，81270348)，the National Science and Technology Support Program(No.2012BAI39B02)，and the Major Scientific and Technological Projects of Shaanxi Province(No.2012FWPT-03)

劉恩岐(1965-)，男(漢族)，教授，博士生導師.研究方向：動脈粥樣硬化.E-mail：liuenqi@mail.xjtu.edu.cn；范江霖(1958-)，男(回族)，教授，博士生導師.研究方向：心血管分子病理學.E-mail：jianglin@yamanashi.ac.jp

時間：2014-07-22 18∶10 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1810.016.html