張 亮，隋成旭，宋 磊

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧大連116027）

肝癌組織中p-gp170、GST-π、TopoⅡ蛋白的表達(dá)

張 亮，隋成旭，宋 磊

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧大連116027）

目的探討p-gp170、GST-π和TopoⅡ在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法采取免疫組化法檢測35例肝癌組織、20例癌旁組織和10例肝硬化組織中p-gp170、GST-π和TopoⅡ蛋白的表達(dá)，并對其與組織病理參數(shù)及生存率的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果肝癌組織中的p-gp170、GST-π的陽性表達(dá)率均顯著高于癌旁組織及肝硬化組織（P＜0.05）。肝癌組織中TopoⅡ蛋白的表達(dá)與癌栓關(guān)系密切（P＜0.05）。肝癌組織中p-gp170+GST-π的陽性表達(dá)率高于p-gp170+GST-π+TopoⅡ、p-gp170+TopoⅡ、GST-π+TopoⅡ的陽性表達(dá)率（P＜0.05）。TopoⅡ陽性表達(dá)者的2 a生存率低于陰性表達(dá)者（P＜0.05）。結(jié)論p-gp170、GST-π在肝癌組織中的高表達(dá)，可作為肝癌組織惡變的標(biāo)志物；TopoⅡ與肝癌的浸潤轉(zhuǎn)移及生存關(guān)系密切。

肝癌；p-gp170；GST-π；TopoⅡ

原發(fā)性肝癌是一種發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤，肝癌死亡率在全球死亡率中位居第3位［1］。化療為肝癌綜合治療的重要組成部分。目前多采用聯(lián)合方案，憑臨床醫(yī)師的主觀判斷用藥，療效不理想。腫瘤細(xì)胞的耐藥性是最主要的原因［2-3］。在糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制中，腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制是最常見的原因之一。糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥的表達(dá)水平在腫瘤細(xì)胞中是有所不同的，所以在耐藥性方面具備差異［4-6］。多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）在腫瘤細(xì)胞耐藥中占據(jù)著主導(dǎo)地位，在對一種抗腫瘤藥物耐藥的同時對其他機(jī)制不同、結(jié)構(gòu)不同的抗腫瘤藥物同時也產(chǎn)生了耐藥性。MDR可分為天然性耐藥與獲得性耐藥2種類型，天然性耐藥是指在首次使用化療藥物的同時即出現(xiàn)了耐藥性，而獲得性耐藥是指在化療治療的過程當(dāng)中出現(xiàn)的耐藥表達(dá)。人類主要的這2種基因表達(dá)均和 MDR有關(guān)［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn) p-gp170、GST-π、TopoⅡ等是惡性腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用免疫組化法檢測p-gp170、GST-π、TopoⅡ在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)，并以癌旁組織和肝硬化組織作為對照，以探討3種因子在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集我院2008年至2011年35例術(shù)前未行化療的肝癌患者手術(shù)切除的新鮮癌組織、20例相應(yīng)癌旁組織及10例肝炎后肝硬化活體肝組織標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。35例肝癌中，肝細(xì)胞癌34例，膽管細(xì)胞癌1例；病理分級：高分化8例，中分化22例，低分化5例；男27例，女8例；年齡26～71歲，中位年齡48.5歲；治療方案：31例行肝癌切除術(shù)，1例行術(shù)中射頻消融治療，3例行術(shù)中射頻消融+經(jīng)皮酒精局部注射治療；Fdmondson分級：Ⅰ級5例，Ⅱ級13例，Ⅲ級13例，Ⅳ級4例。除1例圍手術(shù)期死亡外，余34例術(shù)后獲得隨訪，隨訪率100%，隨訪時間6～30個月。

1.2 p-gp170、GST-π、TopoⅡ的免疫組化檢測方法

采用免疫組化Flivison二步法及DAB顯色進(jìn)行免疫組化染色，其中PV 6001試劑盒和鼠單克隆抗體pgp170、鼠單克隆抗體GST-π、鼠單克隆抗體TopoⅡ均購自福州邁新生物科技有限公司。免疫組化操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 陽性結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，細(xì)胞膜或同時在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜可見pgp170染色，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核可見GST-π染色，細(xì)胞核內(nèi)可見TopoⅡ染色。采用雙盲法隨機(jī)觀察5個不同的高倍鏡視野，各計(jì)數(shù)700個細(xì)胞。其染色細(xì)胞＞10%為陽性，否則為陰性；p-gp170及GST-π判定標(biāo)準(zhǔn)：（+）＜25%細(xì)胞出現(xiàn)陽性著色，（++）25% ～＜75%細(xì)胞出現(xiàn)陽性著色，（+++）≥75%細(xì)胞出現(xiàn)陽性著色。TopoⅡ判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為Ⅰ級，陽性細(xì)胞數(shù)位于25%～＜50%之間為Ⅱ級，陽性細(xì)胞數(shù)位于50%～＜75%之間為Ⅲ級，陽性細(xì)胞數(shù)≥75%為Ⅳ級。三者染色均同時設(shè)PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 隨訪方法統(tǒng)計(jì)中生存時間以手術(shù)日起至末次隨訪時間為標(biāo)準(zhǔn)，采用電話和門診隨訪，隨訪時間最長30個月，最短6個月，中位隨訪時間12.9個月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 p-gp170、GST-π、TopoⅡ在不同肝組織中的表達(dá)gp170、GST-π、TopoⅡ在肝癌組織中的陽性表達(dá)率分別為85.7%（30/35）、71.4%（25/35）、31.4%（11/35），在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為 40.0%（8/20）、35.0%（7/20）、35.0%（7/20），在肝硬化組織中的陽性表達(dá)率為20.0%（2/10）、10.0%（1/10）、30.0%（3/10）。其中p-gp170、GST-π在肝癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織及肝硬化組織（P＜0.05）；而TopoⅡ在肝癌、癌旁組織、肝硬化組織中的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。三者陽性表達(dá)情況見圖1，多項(xiàng)陽性情況見表1。

2.2 肝癌組織中p-gp170、GST-π、TopoⅡ表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表2。

2.3 肝癌組織中p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表達(dá)與年齡的關(guān)系見表3。

2.4 p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

在獲得隨訪的34例肝癌患者中，生存期≥2 a者的p-gp170、GST-π、TopoⅡ陽性表達(dá)率分別為66.7%（12/18）、61.1%（11/18）、16.7%（3/18），生存期＜2 a者分別為87.5%（14/16）、75.0%（12/16）、43.8%（7/16）。p-gp170、GST-π陽性表達(dá)率在生存期≥2 a者與生存期＜2 a者中比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；TopoⅡ陽性表達(dá)率兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 肝癌組織中p-gp170（A）、GST-π（B）、TopoⅡ（C）的表達(dá)情況（Flivison，×100）

表1 肝癌組織中p-gp170、GST-π、TopoⅡ表達(dá)的關(guān)系

3 討論

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥是不同耐藥機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果，耐藥相關(guān)蛋白p-gp170、GST-π、TopoⅡ表達(dá)可能在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生中具有重要作用［7］。p-gp170屬于ABC簇轉(zhuǎn)運(yùn)因子，是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的膜糖蛋白，其相關(guān)耐藥機(jī)制是腫瘤內(nèi)的化療藥物泵入腫瘤細(xì)胞外，從而細(xì)胞內(nèi)的化療藥物減少，導(dǎo)致耐藥［8］。本組肝癌患者p-gp170陽性表達(dá)率高，表明大部分肝癌細(xì)胞在化療前具有p-gp170表達(dá)，是肝癌患者原發(fā)耐藥的主要因素之一。p-gp170是一種鈣離子及氯離子通道蛋白，其MDR細(xì)胞線粒體跨膜電位降低，與p-gp170表達(dá)過度有關(guān)［9-10］；可保護(hù)耐藥細(xì)胞，避免其凋亡［11］。p-gp170陽性表達(dá)率高即預(yù)示著腫瘤預(yù)后差或化療失敗的可能性。在體外給藥時，p-gp170可減少腦中的藥物濃度及中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)［12］。因此，對p-gp170抑制劑的研究是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的重要的組成部分。

表2 肝癌組織中p-gp170、GST-π、TopoⅡ表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表3 肝癌組織中p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表達(dá)與年齡的關(guān)系

GST-π在許多人體惡性腫瘤中有高度表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志酶。GST-π水平可以反映某些腫瘤對化療藥的耐藥性，能使腫瘤細(xì)胞對某些化療藥物的抗性升高，并且還可抑制烷化劑等化療藥物引起的癌細(xì)胞DNA交聯(lián)，從而造成癌細(xì)胞耐藥，導(dǎo)致化療失?。?3］。本組資料中GST-π陽性表達(dá)率高達(dá)71.4%，提示GST-π的表達(dá)也是肝癌細(xì)胞原發(fā)耐藥的重要因素。

TopoⅡ是一種核酶，能促進(jìn)瘤細(xì)胞內(nèi)DNA的合成，使增殖能力提高，與腫瘤惡性程度有關(guān)。它是多種抗癌藥物作用的靶酶，表達(dá)水平下降則腫瘤對抗癌藥物敏感性下降，腫瘤細(xì)胞耐藥性增高［14］。本組中TopoⅡ表達(dá)的陽性率為31.4%，說明TopoⅡ表達(dá)也是肝癌的原發(fā)耐藥的因素之一。在有門脈癌栓者的陽性表達(dá)率高于無門脈癌栓者，這可能與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移傾向有關(guān)，伴門脈癌栓者具較強(qiáng)的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力，所需的TopoⅡ也多，因此陽性表達(dá)率高。TopoⅡ陽性表達(dá)率2 a內(nèi)死亡者高于2 a內(nèi)生存者，說明高表達(dá)者預(yù)后較差，這可能是腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲能力較高所致。

在研究p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表達(dá)情況時發(fā)現(xiàn)，三者在肝癌細(xì)胞中均有一定的陽性表達(dá)率，提示三者在原發(fā)性肝癌的多藥耐藥方面均起著一定作用。其中p-gp170、GST-π有更高的陽性表達(dá)率，提示可能其在肝癌的多藥耐藥方面發(fā)揮更大的作用。由肝癌組織、癌旁組織和肝硬化組織中p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表達(dá)情況可見，前兩者在肝癌組織中的陽性表達(dá)率顯著增高，這提示可作為肝癌組織惡變的標(biāo)志物。至于TopoⅡ在3種組織中表達(dá)無明顯差異，提示其在肝癌耐藥中的作用不占主導(dǎo)地位。綜合分析三者在肝癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) p-gp170與 GST-π、TopoⅡ與GST-π、TopoⅡ與p-gp170、GST-π、TopoⅡ及p-gp170、GST-π、TopoⅡ的陽性表達(dá)有關(guān)，提示肝癌耐藥的調(diào)控可能存在共同的誘導(dǎo)機(jī)制。本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)p-gp170及GST-π與臨床分期、病理分級、腫瘤大小、數(shù)目、門脈癌栓、肝硬化、生存率等有關(guān)。說明p-gp170與GST-π的表達(dá)可能僅與腫瘤的耐藥性有關(guān)，與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等因素?zé)o關(guān)。本組資料中p-gp170、GST-π、TopoⅡ陽性表達(dá)與年齡無明顯關(guān)系，但在30～60歲年齡段3種耐藥基因的陽性表達(dá)較其他年齡組要高，其生物學(xué)意義因例數(shù)少，尚有待于進(jìn)一步探討。某一耐藥細(xì)胞常有幾種機(jī)制參與耐藥形成［15］。3種耐藥基因的綜合檢測在臨床上具備較大意義，一方面明確腫瘤耐藥的病因；另一方面依據(jù)其原有耐藥機(jī)制指導(dǎo)臨床化療用藥，制定個體化的化療方案；其次可依據(jù)不同的耐藥機(jī)制，為針對多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)及選擇病例提供依據(jù)，研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)劑以增強(qiáng)化療療效，延長患者的有效生存期。

綜上所述，p-gp170、GST-π在肝癌組織中的高表達(dá)，可作為肝癌組織惡變的標(biāo)志物；TopoⅡ與肝癌的浸潤轉(zhuǎn)移及生存關(guān)系密切，臨床上綜合檢測p-gp170、GST-π和TopoⅡ意義重大，可以依據(jù)耐藥機(jī)制的不同制定有效的個體化療方案，研究應(yīng)用p-gp170、GST-π、TopoⅡ逆轉(zhuǎn)劑可以增強(qiáng)化療療效，延長患者的有效生存期。

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Expressions of p-gp170，GST-π，TopoⅡin the Hepatocellular Carcinoma

Zhang Liang，Sui Chengxu，Song Lei
（The Second Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116027，China）

ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of p-gp170，GST-π and TopoⅡin the hepatocellular carcinoma.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expressions of pgp170，GST-π and TopoⅡin the 35 cases of hepatocellular carcinoma，the 20 cases of paraneoplastic tissues form hepatocellular carcinoma and the 10 cases of hepatic cirrhosis.The relationship with clinicopathologic parameters and survival rate were comprehensively analyzed.ResultsThe positive expression rate of p-gp170，GST-π in the hepatocellular carcinoma were higher than those in the 20 cases of paraneoplastic tissues and the 10 cases of hepatic cirrhosis（P＜0.05）.The expression of TopoⅡin the hepatocellular carcinoma was related with cancer embolus（P＜0.05）.In the hepatocellular carcinoma，the positive expression rate of p-gp170+GST-π was higher than those of the p-gp170+GST-π+TopoⅡ，the p-gp170+TopoⅡ，the GST-π+TopoⅡ（P＜0.05）.The 2-year survival rate of the hepatocellular carcinoma with TopoⅡpositive expression was lower than that of the hepatocellular carcinoma with TopoⅡnegative expression（P＜0.05）.Conclusionp-gp170，GST-π are higher expressions in the hepatocellular carcinoma，and can be the marker of hepatocellular carcinoma；TopoⅡ may be relative to imbibition and survival of the hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma；p-gp170；GST-π；TopoⅡ

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.06.005

R735.7；R730.23

A

1673-5412（2014）06-0472-05

2014-03-27）

張亮（1983-），男，碩士，醫(yī)師，主要從事腫瘤介入治療研究。F-mail：zlwy198335@163.com

宋磊（1975-），男，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤及腫瘤介入治療研究。F-mail：songlei_1975@126.com