張奉蘇，陳 菲，劉訓紅*，楊念云，侯 婭，馬 陽，陸娟娟

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023）

樟芝（Antrodia camphorata），又名牛樟芝、牛樟菇、樟內菇、紅樟菇，屬于非褶菌目多孔菌科，是我國臺灣特有的珍稀食藥兩用真菌，早期原住民以樟芝作為解酒之用，近年來研究表明，樟芝含有多糖類、固醇類、三萜類、核苷類、不飽和脂肪酸、免疫蛋白等多種生理活性成分，具有解毒保肝、消除腫瘤、補腎強心、益胃整腸、強化免疫、鎮(zhèn)痛抗菌等多方面藥理作用[1-3]。樟芝作為一種極具開發(fā)潛力和應用前景的保健、藥用菌，近年來逐漸成為國內外研究和開發(fā)的熱點。目前，保健食品發(fā)展方向是向功能因子明確的第3代產品轉移，保健功能因子的研究已引起國內外高度重視[4]。樟芝具有豐富的營養(yǎng)成分，脂肪酸類成分尤其是不飽和脂肪酸是樟芝保健食品重要的功能因子之一。現(xiàn)代研究證實，不飽和脂肪酸具有降血脂、降血壓、軟化血管、促進免疫以及抗炎、抗腫瘤等生理活性[5-9]，已經引起人們的廣泛重視，以其作為重要功能因子的保健食品已被越來越多的人所接受。超臨界CO2流體萃取法因具有操作方便、能耗低、無污染、純度高、無溶劑殘留等特點，國內外已廣泛應用于植物油脂研究[10-14]。本實驗在前期研究基礎上[15-19]，采用超臨界CO2流體萃取法提取樟芝菌粉油脂類成分，應用衍生化氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技術分析鑒定其脂肪酸的組成，并建立其色譜指紋圖譜，以期為市售樟芝菌粉及其保健食品的質量評價和控制以及樟芝新品的研發(fā)提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟芝樣品：C1～C10（普通發(fā)酵菌粉，批號分別為：02L07、02L11、02L14、02L18、02L21、02L25、02L28、03L04、03L07、03L11）、ST（三萜含量較高的發(fā)酵菌粉，批號0J10D17）、J6（樟芝膠囊，批號0J02L07）、D（椴木栽培樟芝子實體） 臺灣長庚生物科技股份有限公司；CZ（赤芝） 安徽亳州藥材市場。

以上樣品均經南京中醫(yī)藥大學劉訓紅教授鑒定，D為多孔菌科真菌樟芝（Antrodia camphorata）的干燥子實體，C1～C10、ST及T6分別為多孔菌科真菌樟芝的發(fā)酵菌粉及其膠囊，CZ為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss. ex Fr.）Karst.的干燥子實體。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定實驗室。

氯化鈉、正己烷、石油醚、氫氧化鉀（均為分析純） 南京化學試劑有限公司；三氟化硼甲醇溶液美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

7890A/5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、HP-5 ms毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技有限公司；HA221-50-06超臨界萃取儀 南通華安超臨界有限公司；HH-S型水浴鍋 鞏儀市英峪予華儀器廠；Anke TGL-16B離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

采用超臨界CO2技術，萃取釜壓力為20 MPa，萃取溫度48 ℃；分離釜Ⅰ壓力7 MPa，溫度40 ℃；分離釜Ⅱ壓力5 MPa，溫度35 ℃。萃取時間90 min，CO2流速為30 L/h。稱取各樣品發(fā)酵菌粉100 g，過40 目篩，分別置萃取釜中萃取，從分離釜Ⅰ和分離釜Ⅱ收集樣油。

稱取樣油200 μL，置10 mL具塞試管中，加0.4 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，搖勻，在60 ℃水浴中放置20 min，至油珠全部消失溶液變透明，冷卻至室溫，加BF3-CH3OH溶液3 mL，搖勻，水浴中放置6 min，加正己烷3 mL，保持微沸3 min，取出冷卻至室溫，振搖，加飽和氯化鈉溶液2 mL，靜置，吸取上清液，加無水Na2SO4干燥后過0.22 μm濾膜待分析。

1.3.2 色譜條件

采用程序升溫：初溫80 ℃，以10 ℃/min升至150 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至195 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至230 ℃保持10 min，總計運行59.5 min。進樣口溫度250 ℃，分流比10∶1，載氣為氮氣，流速為10 mL/min。

1.3.3 質譜條件

電子電離（election ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲時間3 min，掃描范圍40～350 u，電子倍增器電壓700 V。

1.4 樣品分析

樣品按上述分析條件進行GC-MS分析，各色譜峰相應的MS圖經人工解析及G1701BA化學工作站NIST 11譜圖庫檢索定性；根據G1701BA化學工作站數(shù)據處理系統(tǒng)，對各色譜峰的峰面積進行歸一化處理，求得各組分的相對百分含量。根據GC-MS總離子流圖的峰數(shù)、峰位和峰面積值以及成分鑒定結果，標定共有峰，建立其指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸組成分析

經GC-MS檢測，得到11 批樟芝菌粉、樟芝椴木栽培品以及赤芝的脂肪酸總離子流圖。樟芝菌粉C8的GC-MS總離子流色譜見圖1。各色譜峰相應的MS圖經對照品對照及NIST 11 MS庫檢索定性，并根據數(shù)據處理系統(tǒng)對色譜峰的峰面積進行歸一化處理。樟芝菌粉脂肪酸組成分析結果見表1。

目前，獨立學院法學專業(yè)基本上選用與普通高校法學專業(yè)相同的本科系列教材。這些教材大多是普通高校法學本科專業(yè)的規(guī)劃教材、統(tǒng)編教材，知識體系完整、系統(tǒng)，“內容過于理論化，缺乏案例分析，缺乏法律職業(yè)技能訓練內容”［2］30，對獨立學院法學專業(yè)的學生來說難度可想而知。

圖 1 樟芝菌粉（C8）的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram (TIC) of fatty acids in Antrodia camphorata powder (C8)

2.2 指紋圖譜分析

2.2.1 指紋圖譜測定

對10 批次樟芝菌粉樣品（C1～C10）在同一上述實驗條件下進樣分析，測定所有供試品的GC-MS總離子流圖，見圖2。根據樟芝菌粉揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖所給出的峰數(shù)、峰保留時間和峰面積值等相關參數(shù)以及成分鑒定結果，進行分析比較，制定樟芝菌粉GC-MS指紋圖譜。

表 1 樟芝菌粉中脂肪酸組成分析結果Table 1 Identified fatty acids in Antrodia camphorraattee powwddeerr編號 組分名稱 分子式 保留時間/min相對百分含量/%C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 J6 D CZ ST 1辛酸甲酯 C9H18O24.5350.02 — — — — 0.01 — — — — — — — 0.01 2壬酸甲酯 C10H20O25.601— — — — — — — — — — — — 0.07 —3癸酸甲酯 C11H22O 26.7200.01 — — 0.01 — — 0.020.020.020.01 — — — 0.01 4月桂酸甲酯 C13H26O29.528 0.01 — 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 — — 0.08 0.01 5肉豆蔻酸甲酯 C15H30O214.596 0.31 0.22 0.35 0.24 0.34 0.34 0.25 0.25 0.19 0.22 0.25 0.88 0.57 0.25 6十五碳酸甲酯 C16H320217.568 0.05 0.02 0.08 0.04 0.05 0.06 0.04 0.03 0.03 0.03 0.04 1.10 0.99 0.03 7棕櫚酸甲酯 C17H34O220.659 7.40 17.00 12.94 16.8 14.60 18.75 17.13 9.91 16.25 13.75 17.21 13.28 16.34 13.66 8（Z）-十六烯酸甲酯 C17H32O221.361 0.21 0.17 0.20 0.17 0.21 0.21 0.18 0.19 0.15 0.17 0.17 1.53 1.07 0.19 9（7E,10E）-十六碳二烯酸甲酯 C17H30O222.529 0.02 — 0.03 — 0.03 0.03 0.02 0.01 — — 0.02 — — 0.01 10 十七酸甲酯 C18H36O223.586 0.11 0.09 0.13 0.10 0.10 0.11 0.10 0.11 0.10 0.11 0.10 0.33 0.43 0.06 11 （10Z）-十七碳烯酸甲酯 C18H34O224.319 0.06 0.04 0.07 0.05 0.05 0.06 0.05 0.05 0.04 0.05 0.06 0.39 0.25 0.05 12 9,12-十七碳二烯酸甲酯 C18H32O225.723 0.02 — — — — — — 0.01 — — — — — —13 硬脂酸甲酯 C19H38O226.540— — — — — — — — — — — 2.474.96—14 油酸甲酯 C19H36O227.060 10.20 39.45 14.40 15.80 11.40 14.98 11.94 14.59 10.68 9.95 31.5 23.42 44.24 11.5 15 反油酸甲酯 C19H36O227.172 5.20 5.23 14.12 7.06 7.85 13.46 9.17 3.04 8.34 8.52 6.52 — 1.17 7.76 16 （11E）-十八碳烯酸甲酯 C19H36O227.824 — — — — — — 0.61 — — — — 0.32 — —17 亞油酸甲酯 C19H34O228.402 10.35 31.12 22.27 16.9 24.96 22.63 27.46 8.57 15.95 19.14 16.13 22.94 16.69 16.19 18 （8E,11E）-十 八碳二烯酸甲酯 C19H34O229.805 — — 0.04 — — — — — — — — — — —19 順-10-十九烯酸甲酯 C20H38O230.3740.01 — — — — — — 0.01 — — — — — —20 亞麻酸甲酯 C19H32O230.6361.28 1.18 1.35 1.22 1.33 1.33 1.26 1.30 1.20 1.24 1.25 — — 1.31 21 花生酸甲酯 C21H42O233.581 0.43 0.36 0.40 0.36 0.27 0.31 0.38 0.46 0.50 0.47 0.36 — 0.59 0.39 22 （11E）-二十碳酸甲酯 C21H40O234.265 1.66 1.46 1.51 1.54 1.30 1.46 1.62 1.76 1.87 1.72 1.55 0.71 — 1.73 23 （11Z,14Z）-二十碳酸二烯酸甲酯 C21H38O236.166 0.08 0.05 0.09 0.07 0.08 0.09 0.09 0.08 — 0.07 0.08 — — 0.06 24 二十一碳酸甲酯 C22H44O237.579— — — — — — — — — — — — 0.49—25 （6Z,9Z,11E）-十八碳酸甲酯 C19H32O240.288 0.06 0.08 0.23 0.26 0.23 0.23 0.27 0.30 0.37 0.29 0.26 — — 0.18 26 山崳酸甲酯 C23H46O241.536 0.20 0.13 0.19 0.20 0.12 0.14 0.20 0.20 0.27 0.23 0.19 1.74 1.70 0.15 27 芥酸甲酯 C23H44O242.207—0.19— — — — — — — — — — — —28 （9Z,11E,13E）-十八碳三烯酸甲酯 C19H32O242.212 0.67 0.09 0.57 0.72 0.53 0.54 0.72 0.79 0.83 0.8 0.62 1.07 — 0.32 29 二十三烷酸甲酯 C24H48O245.2190.03 — 0.02 0.03 — 0.02 0.03 0.03 0.04 0.03 — 1.01 2.12 0.04 30 木蠟酸甲酯 C25H50O248.923 0.42 0.21 0.30 0.48 0.20 0.22 0.37 0.30 0.39 0.40 0.31 5.06 3.04 0.23 31 順-15-二十四酸甲酯 C25H48O249.585 0.13 0.14 0.11 — 0.08 0.09 0.11 0.10 0.14 0.13 0.12 0.75 — 0.11 32 二十五酸甲酯 C26H52O252.539 0.04 — 0.03 0.03 0.06 0.03 0.04 0.05 0.04 0.06 0.04 2.59 0.82 —33 21-甲基二十二碳酸甲酯 C24H48O257.230 0.21 — 0.18 0.21 0.11 0.14 0.24 0.19 0.22 0.21 0.20 5.18 — —

圖 2 樟芝菌粉GC-MS指紋圖譜共有模式Fig.2 GC-MS fingerprints and common pattern of 10 batches of A. camphorata powder

2.2.2 共有指紋峰標定

經對脂肪酸成分GC-MS總離子流圖的分析，標定11 個共有峰作為樟芝菌粉指紋圖譜的特征峰，依次為：肉豆蔻酸甲酯、十五碳酸甲酯、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、花生酸甲酯、（11E）-二十碳酸甲酯、（11Z,14Z）-二十碳酸二烯酸甲酯、（6Z,9Z,11E）-十八碳酸甲酯、山崳酸甲酯、（9Z,11E,13E）-十八碳三烯酸甲酯、木蠟酸甲酯。以棕櫚酸甲酯（3號峰）為參照峰，分別求出各共有峰與之相比的α值（調整保留時間之比）和各共有峰的相對峰面積（峰面積之比），結果見表2。

表 2 樟芝菌粉GC-MS指紋圖譜中共有峰的相對保留時間α值和相對峰面積Table 2 Relative retention time (α) and relative peak area of common GC-MS fingerprint peaks fromom A. camphorataata powderwder峰號 α 相對峰面積C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 5 0.707 0.042 0.013 0.027 0.014 0.023 0.018 0.015 0.025 0.012 0.016 6 0.850 0.007 0.001 0.006 0.002 0.003 0.003 0.002 0.003 0.002 0.002 7 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 17 1.375 1.399 1.831 1.721 1.006 1.710 1.207 1.603 0.865 0.982 1.392 21 1.625 0.058 0.021 0.031 0.021 0.018 0.017 0.022 0.046 0.031 0.034 22 1.659 0.224 0.086 0.117 0.092 0.089 0.078 0.095 0.178 0.115 0.125 23 1.751 0.011 0.003 0.007 0.004 0.005 0.005 0.005 0.008 0.004 0.005 25 1.950 0.008 0.005 0.018 0.015 0.016 0.012 0.016 0.030 0.023 0.021 26 2.011 0.027 0.008 0.015 0.012 0.008 0.007 0.012 0.020 0.017 0.017 28 2.043 0.091 0.005 0.044 0.043 0.036 0.029 0.042 0.080 0.051 0.058 30 2.368 0.057 0.012 0.023 0.029 0.014 0.012 0.022 0.030 0.024 0.029

2.2.3 色譜峰的重疊率

以對照譜圖（R）為基準，按以下公式計算：

重疊率=（（待測樣品與對照譜圖共有的峰數(shù)×2/（待測樣品與對照譜圖峰數(shù)和））×100，C1～C10號樣品色譜峰的重疊率依次為：86.66%、87.35%、86.35%、87.60%、88.45%、85.60%、86.35%、87.35%、83.34%、86.87%。

2.2.4 相似度評價

按照中位數(shù)夾角余弦法計算相似度，進行色譜峰差異性評價和整體相似性評價。各相似度值如下：C1：0.995 4，C2：0.999 0，C3：0.999 9，C4：0.999 7，C5：0.999 5，C6：0.999 8，C7：0.999 7，C8：0.998 6，C9：0.998 8，C10：0.999 8。結果顯示10 批樣品指紋譜相似度較好，均在0.99以上。

2.2.5 不同商品樟芝及赤芝的指紋譜比較

根據中位數(shù)夾角余弦值的相似度計算方法[20-23]，與樟芝菌粉指紋譜比較，樟芝膠囊（J6）具有11 個共有峰，夾角余弦值和中位數(shù)相關系數(shù)分別為0.999 8和0.999 7，三萜含量高的樣品（ST）具有11 個共有峰，夾角余弦值和中位數(shù)相關系數(shù)分別為0.998 9和0.997 1。樟芝椴木栽培品具有8 個共有峰，赤芝具有7 個共有峰，與樟芝菌粉指紋譜差異明顯。

3 討 論

實驗結果表明，樟芝菌粉中含有33 種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸有18 種，占脂肪酸含量的75.29%，單不飽和脂肪酸占總脂肪酸的36.64%，多不飽和脂肪酸占總脂肪酸的38.65%，不飽和脂肪酸的含量是飽和脂肪酸的 3倍，以油酸和亞油酸為主，且多為人體必需脂肪酸。從而說明樟芝菌粉具有良好的營養(yǎng)、保健及藥用價值，其開發(fā)應用前景廣闊。

不同批次的臺灣普通樟芝菌粉中脂肪酸組成的差異較小，顯示樟芝菌粉發(fā)酵工藝的穩(wěn)定。普通樟芝菌粉與三萜含量較高的樟芝菌粉的脂肪酸組成組成相似，但各化合物的相對含量不同。樟芝膠囊與普通菌粉的脂肪酸組成和含量幾無差異。椴木栽培樟芝子實體及靈芝與臺灣普通樟芝菌粉的脂肪酸組成在組成和含量上有較大差異。

指紋圖譜分析結果表明，不同批次樟芝菌粉之間既有相關性，又有區(qū)別。相應共有指紋峰均已在色譜圖上體現(xiàn)，色譜峰重疊率、指紋譜相似度較好，但各峰面積有所不同，說明不同批次樟芝菌粉成分含量有一定差異。棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、（9Z,11E,13E）-十八碳三烯酸甲酯、（11E）-二十碳酸甲酯可列為樟芝菌粉指紋譜共有特征峰中n強峰，其配比關系為1∶（0.865～1.831）∶（0.078～0.224）∶（0.005～0.091），這對評價樟芝菌粉的品質具有一定意義。經對不同商品樟芝及靈芝與樟芝菌粉指紋譜比較、分析，其共有峰數(shù)目、色譜圖相似度及n強峰峰面積比值均具有一定差異。

本實驗采用超臨界CO2流體萃取法提取樟芝菌粉油脂類成分[24-25]，應用衍生化GC-MS技術分析鑒定其脂肪酸的組成，并建立其脂肪酸類成分GC-MS指紋圖譜，從而為市售樟芝菌粉及其保健食品的質量評價和控制以及樟芝新品的研發(fā)提供實驗依據。

[1]WU S H, RYVARDEN L, CHANG T T. Antrodia camphorata(“niuchang-chih”), new combination of a medicinal fungus in Taiwan[J].Botanical Bulletin of Academia Sinica, 1997, 38: 273-275.

[2]黃大斌, 楊箐, 黃進華. 樟芝生物學特性研究[J]. 食用菌學報, 2001,8(2): 24-28.

[3]藍明煌, 藍蒼洲, 藍仲良. 樟芝的固體培養(yǎng)方法, 所得固體培養(yǎng)物及其產品與用途: 中國, 1379082[P]. 2002-11-13.

[4]張紅城, 董捷, 曲臣, 等. 八種蜂花粉中脂肪酸的測定及GC-MS分析[J].食品科學, 2009, 30(24): 419-424.

[5]唐華, 鄭強峰, 葛剛, 等. 檵木與紅花檵木葉中脂肪酸GC-MS分析[J].中藥材, 2011, 34(10): 1549-1552.

[6]王雪, 青苗惠, 胡萍. 膳食中多不飽和脂肪酸營養(yǎng)與生理功能的研究進展[J]. 食品科學, 2004, 25(11): 337-339.

[7]張月紅, 劉英華, 王覲, 等. 中長鏈脂肪酸食用油降低超重高甘油三酯患者血脂和低密度脂蛋白膽固醇水平的研究[J]. 中國食品學報,2010, 10(2): 20-27.

[8]BORGES O P, CARVALHO J S, CORREIA P R, et al. Lipid and fatty acid profile of Castanea sativa Mill. Chestnut of 17 native Portuguese cultivars[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2007, 20(2):80-89.

[9]黃霄檬, 趙保堂, 王俊龍, 等. 鎖陽脂肪酸組成成分的GC-MS分析[J].甘肅科技, 2009, 25(5): 38-40.

[10]LI Xiuqin, SONG Aihua, LI Wen, et al. Analysis of the fatty acid from Bupleurum Chinense DC in China by GC-MS and GC-FID[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 53(12): 1613-1617.

[11]周鳴謙, 劉云鶴, 林春梅. 超臨界CO2萃取黑莓籽油及其成分分析[J].食品科學, 2012, 33(8): 39-42.

[12]馬志虎, 侯喜林, 湯興利, 等. 響應面法優(yōu)化超臨界CO2萃取韭菜籽油[J]. 中國油脂, 2009, 34(7): 13-17.

[13]鄧瑞雪, 劉振, 秦琳琳, 等. 超臨界CO2流體提取洛陽牡丹籽油工藝研究[J]. 食品科學, 2010, 31(10): 142-145.

[14]司寶莉, 王青寧, 王永莉, 等. 超臨界流體萃取沙棘籽化學成分的氣相色譜-質譜分析[J]. 藥物分析雜志, 2009, 29(2): 261-264.

[15]陳菲, 張奉蘇, 劉訓紅, 等. 樟芝菌粉質量的初步分析[J]. 中藥材,2012, 35(10): 1623-1627.

[16]張奉蘇, 陳菲, 傅興圣, 等. 高效毛細管電泳法同時測定牛樟芝中5種核苷類成分的含量[J]. 中國藥學雜志, 2013, 48(9): 623-626.

[17]陳菲, 劉訓紅, 楊念云, 等. 樟芝的研究概述[J]. 中藥材, 2011,34(11): 1804-1808.

[18]陳菲, 張奉蘇, 劉訓紅, 等. 超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜同時測定樟芝菌粉中6 個核苷類化合物及其指紋圖譜研究[J]. 藥物分析雜志, 2013, 33(12): 2080-2086.

[19]CHEN Fei, ZHANG Fengsu, YANG Nianyun, et al. Simultaneous Determination of 10 nucleosides and nucleobases in Antrodia camphorata using QTRAP LC-MS/MS[J]. Journal of Chromatographic Science, 2013, DOI: 10.1093chromsci/bmt128.

[20]劉圣金, 吳德康, 林瑞超, 等. 礦物類中藥青礞石的XRD Fourier指紋圖譜研究[J]. 中國中藥雜志, 2001, 36(8): 2498-2502.

[21]王媚, 張月嬋, 劉訓紅, 等. 羅布麻葉HPCE指紋圖譜的研究[J]. 中藥材, 2010, 33(2): 201-204.

[22]傅興圣, 韓樂, 劉訓紅, 等. 杜仲飲片HPCE指紋圖譜的研究[J]. 中藥材, 2012, 35(3): 378-372.

[23]周逸芝, 韓樂, 劉訓紅, 等. 甘草飲片HPCE指紋圖譜研究[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學, 2012, 29(5): 405-409.

[24]王翠艷, 侯冬巖, 回瑞華, 等. 葵花籽中脂肪酸的氣相色譜-質譜分析[J].食品科學, 2006, 27(11): 428-429.

[25]姜顯光, 侯冬巖, 回瑞華, 等. 馬蘭籽油中脂肪酸的不同甲酯化方法與GC-MS分析[J]. 食品科學, 2009, 30(2): 253-255.