張 璐，孔祥虹，何 強(qiáng)，李建華，鄒 陽，李 瑩

（陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局，陜西 西安 710068）

4-甲基咪唑（4-(5-)-methylimidazole，4-Mel）和2-甲基咪唑（2-methylimidazole，2-Mel）是一類有機(jī)雜環(huán)化合物[1]。兩種物質(zhì)互為同分異構(gòu)體。其中4-Mel具有強(qiáng)烈的驚厥作用，能使動(dòng)物（如兔、鼠、小雞等）產(chǎn)生超興奮狀態(tài)[2]。由于4-Mel具有抑制肝臟中血紅色素P450同功酶的作用，因此可能會(huì)導(dǎo)致肌肉無力從而引起痙攣[3]。4-Mel和2-Mel以亞硫酸銨為原料生產(chǎn)的焦糖色素副產(chǎn)物存在于食品中[4]。根據(jù)WHO規(guī)定，以色率2 000 EBC單位計(jì)，焦糖色素中4-Mel含量不得大于200 mg/kg[2]。美國國家毒理學(xué)規(guī)劃處（National Toxicology Program，NTP）組織和美國加州OEHHA（Office of Environmental Health Hazard Assessment）組織共同將4-Mel作為可致癌物質(zhì)發(fā)出警告[5-6]。歐盟食品安全委員會(huì)建議以亞硫酸銨為原料生產(chǎn)的焦糖色素中4-Mel每日最大攝取量不超過200 mg/（kg·d）[7]。

目前檢測4-Mel和2-Mel的方法主要集中為高效液相色譜（high perfornance liquid chromatography，HPLC）法[8-12]、氣相色譜（gas chromatography）法[13-15]、高效液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）法[4,16-17]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[17-21]、二維色譜（two dimensional chromatography）法[22-23]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（highy performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）法[24-25]。高效液相色譜法需要采用雙（2-乙基己基）磷酸鹽提取后，庚烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑為流動(dòng)相進(jìn)行檢測，前處理較為復(fù)雜。GC-MS法需要進(jìn)行衍生化，操作較為繁瑣，檢測方法靈敏度不能滿足測定要求。二維液相色譜普及率較低。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MSMS）法前處理不需要衍生，操作簡便，選擇性靈敏度明顯優(yōu)于其他檢測方法。

本研究應(yīng)用固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）技術(shù)結(jié)合UPLC-MS-MS法，建立了飲料中4-Mel和2-Mel的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有飲料均為市購。

4-Mel和2-Mel標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.5%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；4-甲基咪唑-d6（4-Mel-d6）（純度＞99.0%） 加拿大CDN公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck KgaA公司；甲酸（色譜純） 安普有限公司；甲酸銨、氨水均為分析純；去離子水由Millipore 公司超純水器制得。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQULITY Quattro Premier XE、ACQUITY UPLCHILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 mm）；OASIS?MCX固相萃取柱（3 mL，60 mg） 美國Waters公司；冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；氮吹儀美國Turbovap公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別準(zhǔn)確稱取10 mg 4-Mel和2-Mel標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－20 ℃條件下保存。

同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取4-Mel-d6標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－20 ℃條件下保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別取上述儲(chǔ)備液0.025 mL于棕色容量瓶中，用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）定容至25 mL，配制成1.0 μg/mL的混合中間標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。使用前用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）稀釋成9.0、15.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中4-Mel-d6質(zhì)量濃度為60.0 ng/mL。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取3.0 g飲料樣品于15 mL具塞離心管中，加入1.0 mg/mL的4-Mel-d660 mL用水稀釋至10 mL，渦旋1 min。4 500 r/min離心5 min，待凈化。

凈化前，首先將OASISMCX固相萃取柱依次用3 mL甲醇，5 mL水活化，將上清液試樣全部轉(zhuǎn)移到已活化好的固相萃取柱上，流速控制為1 mL/min，待試樣溶液流盡后，用5 mL 2%甲酸溶液依次淋洗，再用9 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，洗脫液用干燥氮?dú)獾抵两?，? mL乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）定容，過0.22 mm有機(jī)濾膜后，進(jìn)行UPLC-MS-MS檢測。

1.3.3 UPLC-MS-MS條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCHILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 mm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）等度洗脫；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2.0 mL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）；離子化方式：正離子模式（ESI+）；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multi-reactions monitoring，MRM）；離子源電壓：2.9 kV；離子源溫度：115 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣（N2）：600 L/h；錐孔氣（N2）：50 L/h；碰撞氣為氬氣；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

注：*.定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于4-Mel和2-Mel為同分異構(gòu)體，具有相同的分子質(zhì)量和離子碎片，因此在質(zhì)譜上無法分離。這就需要利用液相實(shí)現(xiàn)對(duì)這兩種化合物的分離。實(shí)驗(yàn)中考察了ACQUITY BEH amide、ACQUITY BEH shield RP 18和ACQUITY BEH HILIC等不同色譜柱的分離情況。由圖1可知，在ACQUITY BEH amide上目標(biāo)化合物不能分離，在ACQUITY BEH shield RP 18盡管目標(biāo)化合物得到分離，但分離效果較差，而在ACQUITY BEH HILIC可不僅實(shí)現(xiàn)完全分離，且峰形良好。

圖 1 4-Mel和2-Mel在不同色譜柱上的保留色譜圖Fig.1 Chromatograms of 4-Mel and 2-Mel on different columns

實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇、乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)的化合物的響應(yīng)情況，結(jié)果表明當(dāng)乙腈為有機(jī)相時(shí)，化合物的響應(yīng)更高且噪音更低。因此選擇乙腈作為有機(jī)相。實(shí)驗(yàn)中考察了目標(biāo)化合物在乙腈-水，乙腈-0.1%的甲酸溶液，乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液體系中的分離情況。結(jié)果表明，在乙腈-水、乙腈-0.1%的甲酸溶液中目標(biāo)化合物得不到有效的分離。而在乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液體系中目標(biāo)無法實(shí)現(xiàn)完全分離和無可實(shí)現(xiàn)分離。同時(shí)，乙腈與5 mmol/L甲酸銨溶液的比例也影響目標(biāo)化合物的分離情況。當(dāng)乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液比例為7∶3（V/V）、8∶2（V/V）時(shí)，4-Mel和2-Mel均分離不完全，而當(dāng)兩者比例達(dá)到9∶1（V/V）時(shí)，4-Mel和2-Mel不僅達(dá)到完全分離而且峰形良好，典型的果汁飲料基質(zhì)加標(biāo)色譜圖見圖2。

圖 2 果汁基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of juice matrix standard

2.2 固相萃取柱選擇

考察了Waters OASISHLB、Aglient Bond Elut C18和Waters OASISMCX對(duì)樣品的凈化效果和回收率。采用50 ng/mL的4-Mel和2-Mel標(biāo)準(zhǔn)溶液作為回收率實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，在Waters OASISHLB柱上目標(biāo)化合物沒有保留。在Aglient Bond Elut C18柱上，4-Mel回收率為158.2%而2-Mel回收率為26.2%。在Waters OASISMCX柱上4-Mel和2-Mel的回收率分別為113.2%和107.9%，凈化效果良好。這是由于咪唑環(huán)的pKa為14.52，呈弱堿性，具有陽離子交換功能，故選擇具有強(qiáng)陽離子交換作用的反相吸附劑的固相萃取柱進(jìn)行選擇性吸附，能夠更好的對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行富集。因此選擇Waters OASISMCX（3 mL，60 mg）柱為凈化柱。

2.3 固相萃取柱條件優(yōu)化

分別考察了不同水平梯度的氨水-甲醇溶液對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力，當(dāng)氨水低于4%時(shí)，4-Mel回收率低于85%，當(dāng)氨水高于5%時(shí)，4-Mel和2-Mel回收率均低于90%。當(dāng)氨水-甲醇溶液中氨水為5%時(shí)，目標(biāo)化合物回收率為105%和107%。因此選擇5%氨水-甲醇溶液作為洗脫溶液（圖3A）。同時(shí)考察了不同體積的5%氨水-甲醇溶液的洗脫能力，使用7 mL的5%氨水-甲醇洗脫回收率可達(dá)到95%以上，9 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫回收率可達(dá)100%以上（圖3B），故選擇9 mL 5%氨水-甲醇溶液為洗脫溶液。

2.4 方法的線性范圍、回收率、精密度

表 2 4-Mel和2-Mel的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of detection of 4-Mel and 2-Mel l目標(biāo)化合物 線性方程 線性范圍/（ng/mL）相關(guān)系數(shù)（R2）定量限/（μg/kg）4-Mel y=19.433x＋94.563 9～500 0.999 5 3.0 2-Mel y=120.06x＋693.21 9～500 0.999 8 3.0

為了消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中采用了內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度為9.0、15.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL系列的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中4-Mel-d6質(zhì)量濃度為60.0 ng/mL。按優(yōu)化條件通過UPLC-MS-MS檢測，4-Mel和2-Mel的相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99（表2）。在樣品中加入低質(zhì)量濃度4-Mel和2-Mel混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（加入量9.0 ng）重復(fù)測定6 份樣品，以信噪比大于10倍確定定量限（LOQ）為3.0 mg/kg。對(duì)不含焦糖色飲料、焦糖色飲料及咖啡進(jìn)行四水平五平行的加標(biāo)回收率測定，在不含焦糖色的飲料中的4-Mel和2-Mel的平均回收率分別為93.1%和90.1%。在含焦糖色的飲料中4-Mel和2-Mel的平均回收率分別為106.1%和90.1%。在咖啡中4-Mel和2-Mel的平均回收率分別為97.0%和104.3%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6.7%（表3）。

n=5）=5 Table 3 Average recoveries and precision obtained in spiked beverage,表 3 不同基質(zhì)中4-Mel和2-Mel的加標(biāo)回收率和精密度（Table 3 Average recoveries and precision obtained in spiked beverage,coca and coffee samples by the developed method (n = 5) = 5)樣品 樣品中含量/（μg/kg）目標(biāo)化合物加標(biāo)量/（μg/kg）回收率/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%軟飲料4-Mel 3.0 76.0 6.5 25.0 87.1 6.7 50.0 101.1 5.5 75.0 108.5 3.0 2-Mel 3.0 67.5 5.2 25.0 87.8 4.2 50.0 107.9 2.1 75.0 96.8 1.8可樂142.9 4-Mel 25.0 103.8 3.4 50.0 109.8 2.5 75.0 104.5 2.8 2-Mel 25.0 93.2 4.2 50.0 105.8 4.1 75.0 114.0 2.7咖啡34.4 4-Mel 25.0 101.4 1.8 50.0 87.2 1.7 75.0 102.5 2.0 6.8 2-Mel 25.0 97.7 2.1 50.0 96.7 2.8 75.0 108.1 3.3

2.5 實(shí)際樣品測定

按本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)市售的49 批軟飲料、24 批焦糖色飲料（標(biāo)簽顯示：添加以亞硫酸銨為原料生產(chǎn)的焦糖色素）、5 批咖啡飲料、5 批功能性飲料中4-Mel和2-Mel的含量進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在49 批軟飲料中檢出有12 批含有4-Mel，含量在1.2～30.1 mg/kg之間，5 批還有2-Mel含量在1.5～7.6 mg/kg之間；在24 批焦糖色飲料中檢出4-Mel含量在16.5～102.3 mg/kg之間；5 批咖啡飲料中4-Mel含量在8.6～37.2 mg/kg之間，2-Mel含量在2.9～7.9 mg/kg之間；5 批功能性飲料中未檢出含有4-Mel和2-Mel。結(jié)果表明，目前以亞硫酸銨為原料生產(chǎn)的焦糖色素仍然在普遍應(yīng)用。

3 結(jié) 論

建立了水溶解樣品、OASISMCX固相萃取柱凈化、UPLC-MS-MS法檢測飲料中4-Mel及其同分異構(gòu)體2-Mel的檢測方法。在優(yōu)化條件下，4-Mel和2-Mel得到快速檢測，檢出限可達(dá)3.0 mg/kg。該方法快速、簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能很好的應(yīng)用于實(shí)際飲料中4-Mel和2-Mel的日常檢測。

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