曲良苗，陳文炳*，繆婷玉，邵碧英，彭 娟，江樹勛

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 福州 350001；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350003）；3.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350001）

自1980年代聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)發(fā)明以來，已被廣泛應(yīng)用于食品中的動(dòng)植物成分鑒別[1-8]，在魚制品魚類成分的鑒別中的應(yīng)用也越來越多[9-11]，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在河豚魚種類鑒別及遺傳分析方面也有不少報(bào)道[12-22]。但普通PCR方法存在擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能，如果PCR擴(kuò)增所使用的引物序列與非目的物種的某段DNA的序列有部分互補(bǔ)性，就會(huì)擴(kuò)增出與目的物種大小相似的PCR產(chǎn)物，僅靠凝膠電泳圖譜判斷，可能因假陽(yáng)性結(jié)果而產(chǎn)生誤判[23]，因此有必要采取確證措施加以排除。目前常用的PCR檢測(cè)結(jié)果的確證方法主要有DNA限制性內(nèi)切酶技術(shù)與DNA測(cè)序方法[24-25]。

我國(guó)海域廣闊，河豚魚種類繁多，魚類加工食品中因混有河豚魚，使得消費(fèi)者誤食而中毒的事件時(shí)有發(fā)生，2007年發(fā)生了由于出口美國(guó)的鮟鱇魚混有河豚魚，導(dǎo)致顧客誤食而中毒的事件，這些事件對(duì)我國(guó)食品出口貿(mào)易造成負(fù)面影響。同年日本食品檢驗(yàn)部門在我國(guó)南方某食品有限公司出口的馬面鲀魚干中檢出河豚魚成分。為了保證消費(fèi)者的健康與權(quán)益，保障水產(chǎn)加工制品的質(zhì)量與安全，急需一種能夠在食品中快速檢測(cè)出河豚魚成分的方法。本研究基于作者于2011年建立的河豚魚成分檢測(cè)PCR方法[22]檢測(cè)河豚魚與其他樣品，發(fā)現(xiàn)在金槍魚與鱸魚中也能擴(kuò)增出與河豚魚DNA片段大小（423 bp）接近的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生了假陽(yáng)性結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用限制性內(nèi)切酶與DNA測(cè)序方法，分析了13 種河豚魚樣品與2 種非河豚魚（金槍魚與鱸魚）的PCR結(jié)果的差別，建立了有效的排除假陽(yáng)性結(jié)果的方法，并將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行DNA同源性查詢比對(duì)（BLAST）加以確證，為準(zhǔn)確鑒定河豚魚成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

9 個(gè)已知物種名稱的河豚魚樣品、4 個(gè)未知種類的河豚魚樣品、5 個(gè)非河豚魚樣品（表1）搜集自福建省莆田、廈門、福州等地水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市。

表 1 18 個(gè)河豚魚及其他魚類供試樣品Table 1 Eighteen samples of puffer fish and other fishes

1.2 試劑與引物

限制性內(nèi)切酶NmeA Ⅲ（2000 U/mL） 北京紐英倫生物技術(shù)有限公司。其他參照文獻(xiàn)[22]。

按照文獻(xiàn)[21]，由上海生工生物工程有限公司合成魚源性成分檢測(cè)引物（FISH）與河豚魚成分引物（HT-1），引物堿基序列、PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度與適合的退火溫度（Tm值）見表2。

表 2 魚源性成分與河豚魚成分的PCR檢測(cè)用的引物序列與退火溫度Table 2 Primer sequences and annealing temperatures for PCR detection of fish components and puffer fish component

1.3 方法

1.3.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶消化

參照文獻(xiàn)[21]優(yōu)化確立的DNA提取CTAB方法與PCR引物、擴(kuò)增體系和溫度程序，進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物凝膠水平電泳與凝膠成像，每個(gè)PCR重復(fù)3 次。按照產(chǎn)品使用說明書規(guī)定，在10 L的PCR產(chǎn)物中，加入2.0 L 10× Cutsmart Buffer、1.0 L限制性內(nèi)切酶NmeA Ⅲ、0.05 L S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SMA）溶液，再加純凈水6.95 L使總體積達(dá)到20 L，在37 ℃條件下消化16～18 h，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳與成像拍照。

1.3.2 DNA堿基序列測(cè)定

PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳后，檢出陽(yáng)性結(jié)果的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行克隆、測(cè)序。

1.3.3 序列比對(duì)與酶切位點(diǎn)確定

應(yīng)用DNAMAN 5.2.2版軟件對(duì)各個(gè)樣品PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行整理分析，結(jié)果以MASED Document/DNAMAN1格式輸出，同時(shí)在GenBank中進(jìn)行BLAST分析。應(yīng)用NEBcutter 2.0軟件進(jìn)行限制性內(nèi)切酶NmeA Ⅲ酶切位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚類內(nèi)源基因PCR擴(kuò)增

圖 1 18 種河豚魚與非河豚魚樣品的魚成分內(nèi)源基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification results of 18 fish samples using primers targeting FISH components

通過樣品的魚類內(nèi)源基因PCR擴(kuò)增，監(jiān)控DNA質(zhì)量。13 個(gè)河豚魚樣品與5 個(gè)非河豚魚樣品的魚類特異性基因（線粒體DNA）的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。18 個(gè)魚類樣品均能擴(kuò)增出大小為224 bp的魚成分PCR產(chǎn)物，說明各樣品的DNA提取是成功的，適合于PCR擴(kuò)增。

2.2 河豚魚特異基因PCR擴(kuò)增

應(yīng)用河豚魚PCR檢測(cè)引物（HT-1）對(duì)13 個(gè)河豚魚樣品與5 個(gè)非河豚魚樣品提取的DNA進(jìn)行河豚魚線粒體特異性基因（Cyt b）PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2，13 個(gè)河豚魚樣品與2 個(gè)非河豚魚樣品（金槍魚與鱸魚）共15 個(gè)樣品檢出PCR產(chǎn)物，為疑似陽(yáng)性結(jié)果。另外3 種非河豚魚類的大黃魚、鰻魚、帶魚與空白對(duì)照（ddH2O）均未擴(kuò)增出DNA條帶，判為陰性結(jié)果。

圖 2 引物HT-1對(duì)河豚魚成分的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 18 fish samples with HT-1 primers targeting puffer fishes component

2.3 PCR產(chǎn)物酶切圖譜分析

圖 3 PCR產(chǎn)物及其酶切結(jié)果電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis patterns of PCR products of puffer fishes with and without restriction endonuclease digestion

15 個(gè)檢出河豚魚成分疑似陽(yáng)性結(jié)果的樣品PCR產(chǎn)物及其經(jīng)酶切消化后的產(chǎn)物電泳圖譜見圖3。圖3A與圖3B中9 個(gè)已知學(xué)名與4 個(gè)未知學(xué)名的的河豚魚樣品，在奇數(shù)號(hào)泳道均檢出酶切產(chǎn)物，各樣品圖譜相同，均有2 條新的片段較小的條帶，分別在300 bp與200 bp的下方。由圖3B可知，23、24號(hào)泳道分別為鱸魚酶切與未經(jīng)酶切的PCR產(chǎn)物，前者無(wú)新的條帶出現(xiàn)，29、30號(hào)泳道為金槍魚的酶切與未經(jīng)酶切的PCR產(chǎn)物，酶切的電泳圖譜出現(xiàn)4 條新的條帶，圖譜與河豚魚明顯不同?？梢姡瑧?yīng)用限制性內(nèi)切酶NmeA Ⅲ酶切可以區(qū)別河豚魚與非河豚魚，進(jìn)而排除2 個(gè)非河豚魚的假陽(yáng)性結(jié)果。圖3A與圖3B中所有疑似陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物酶切后殘留PCR產(chǎn)物片段條帶位置都高于未經(jīng)酶切處理的原PCR產(chǎn)物條帶，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是加入的限制性內(nèi)切酶（蛋白）與DNA結(jié)合，使得分子質(zhì)量比原來純DNA片段更大。毛細(xì)管電泳結(jié)果（本文略）表明，經(jīng)內(nèi)切酶消化酶切后切斷的與未切斷殘留的DNA片段，因結(jié)合了內(nèi)切酶，其大小都比實(shí)際的DNA片段大。

2.4 PCR產(chǎn)物的DNA序列與酶切位點(diǎn)分析

本實(shí)驗(yàn)所用的河豚魚成分PCR檢測(cè)正向引物25 個(gè)堿基，反向互補(bǔ)20 個(gè)堿基（表2），結(jié)果正向引物有20 個(gè)連續(xù)堿基、反向互補(bǔ)有10 個(gè)連續(xù)堿基與7 個(gè)連續(xù)堿基分別與金槍魚Cyt b部分片段序列兩端互補(bǔ)，鱸魚中也存在類似情況，于是在2 個(gè)非河豚魚樣品中也能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象.

圖 4 河豚魚（兔頭鲀）Cyt b部分片段PCR產(chǎn)物堿基序列與限制性內(nèi)切酶NmeAⅢ酶切位點(diǎn)NEB cutter分析圖Fig.4 Partial sequences of the Cyt b gene of puffer fish and NmeAⅢ cleavage sites

應(yīng)用NEB cutter 2.0軟件對(duì)13 種河豚魚與2 種非河豚魚（鱸魚及金槍魚）樣品的PCR產(chǎn)物堿基序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)分析，結(jié)果表明，NmeA Ⅲ酶切位點(diǎn)為5’...GCCGAG（N）21N...3’或3’... CGGCTC（N）19N...5’。河豚魚樣品的PCR產(chǎn)物均為423 個(gè)堿基（僅出示兔頭鲀序列，其他種類河豚魚DNA序列資料略），NmeA Ⅲ酶切位點(diǎn)都只有1個(gè)（圖4），在5’端起的第256/254堿基位置，被切成2段，即電泳圖出現(xiàn)的2 條新帶（圖3），大小為256/254 bp與167/169 bp。金槍魚PCR產(chǎn)物為422 個(gè)堿基，NmeA Ⅲ酶切位點(diǎn)有2 個(gè)（圖5），分別在5’端起的第339/337 堿基與252/250堿基的位置，被切成4 段，大小為339/337、83/85 bp與252/250、170/172 bp（圖3B 第29泳道）。鱸魚PCR產(chǎn)物為423個(gè)堿基，其序列無(wú)NmeA Ⅲ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（圖6），NEB cutter 2.0軟件無(wú)法生成酶切分析圖，電泳結(jié)果無(wú)新條帶出現(xiàn)（圖3B），二者結(jié)果吻合。

2 個(gè)非河豚魚樣品中也能擴(kuò)增出與河豚魚相似的PCR產(chǎn)物，出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，原因是，河豚魚成分PCR檢測(cè)所用的正向引物25 個(gè)堿基，反向互補(bǔ)20 個(gè)堿基（表2），結(jié)果正向引物有20 個(gè)連續(xù)堿基、反向互補(bǔ)有10 個(gè)連續(xù)堿基與7 個(gè)連續(xù)堿基分別與金槍魚Cyt b部分片段序列兩端互補(bǔ)，鱸魚中也存在類似情況。

圖 5 金槍魚Cyt b部分片段PCR產(chǎn)物堿基序列與限制性內(nèi)切酶NmeAⅢ酶切位點(diǎn)NEB cutter分析圖Fig.5 Partial sequences of the Cyt b gene of tuna and NmeAⅢ cleavage sites

圖 6 鱸魚Cyt b部分片段PCR產(chǎn)物堿基序列Fig.6 Partial sequences of the Cyt b gene of weever

2.5 PCR產(chǎn)物堿基序列的GenBank查詢比對(duì)與同源性分析

13 個(gè)河豚魚樣品與2 個(gè)非河豚魚（金槍魚與鱸魚）樣品的PCR產(chǎn)物堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢比對(duì)（BLAST）結(jié)果表明，13 個(gè)河豚魚的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中河豚魚線粒體b基因（Cyt b）的部分序列（序列號(hào)有多個(gè)，略）同源性在98%～100%之間，其中有9 個(gè)樣品為100%，3 個(gè)為99%，1 個(gè)為98%。金槍魚與鱸魚的序列BLAST結(jié)果表明，金槍魚序列422 個(gè)堿基中有408個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Thunnus albacares（金槍魚）Cyt b部分序列（JN086153.1）同源性為99%（408/410，圖7），鱸魚的序列423 個(gè)堿基中有391 個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的Lateolabrax japonicus（鱸魚）Cyt b部分序列（DQ351530.1）同源性為99%（391/392，圖8），可見2 個(gè)非河豚魚PCR產(chǎn)物不是河豚魚成分，驗(yàn)證了限制性內(nèi)切酶NmeA Ⅲ的酶切結(jié)果，可有效排除假陽(yáng)性誤判。

3 結(jié)論與討論

圖 7 金槍魚樣品序列（Query）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Thunnus albacares（金槍魚）Cyt b基因部分序列（JN086153.1）比對(duì)結(jié)果圖Fig.7 BLAST results between sequences (Query) of tuna sample and partial sequences （JN086153.1）of the Cyt b gene of Thunnus albacares in GenBank

圖 8 鱸魚樣品序列（Query）與GenBank中的鱸魚（Lateolabrax japonicus Cyt b基因部分序列（DQ351530.1）比對(duì)結(jié)果圖Fig.8 BLAST results between sequences (Query) of weever sample and partial sequences (DQ351530.1) of the Cyt b gene of Lateolabrax japonicus in GenBank

普通PCR方法的缺陷之一是有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，除了實(shí)驗(yàn)環(huán)境與試劑可能受污染以及PCR反應(yīng)退火溫度不恰當(dāng)外，引物特異性不夠強(qiáng)是主要原因，而引物的特異性也不是絕對(duì)的，只要所使用的引物序列與非目的物種的某段DNA的序列有部分互補(bǔ)性，就會(huì)擴(kuò)增出與目的片段大小相似的PCR產(chǎn)物，凝膠電泳圖譜與陽(yáng)性結(jié)果接近或相同，肉眼無(wú)法判別而出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象[23]，導(dǎo)致結(jié)果誤判。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用文獻(xiàn)[21]建立的河豚魚成分（部分Cyt b基因特異序列）PCR檢測(cè)方法檢測(cè)13 個(gè)河豚魚樣品與5 個(gè)非河豚魚樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在金槍魚與鱸魚2 個(gè)非河豚魚樣品中也能擴(kuò)增出片段大小與河豚魚接近或相同的PCR產(chǎn)物，出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。目前常用的排除PCR檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果的確證方法主要有DNA限制性內(nèi)切酶技術(shù)[24-25]與DNA測(cè)序方法[22]，本研究應(yīng)用這兩種方法對(duì)河豚魚成分PCR檢測(cè)結(jié)果加以確證。金槍魚及鱸魚的PCR產(chǎn)物堿基序列經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)DNA序列比對(duì)，分別確認(rèn)為Thunnus albacares（金槍魚）與Lateolabrax japonicus（鱸魚），表明2個(gè)非河豚魚PCR產(chǎn)物不是河豚魚成分，驗(yàn)證了NmeA Ⅲ限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果，可見該方法可用于河豚魚成分PCR檢測(cè)結(jié)果的確證。為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立的NmeA Ⅲ限制性內(nèi)切酶方法是否具有廣泛的適用性，將進(jìn)一步在更多的其他魚類中可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確證應(yīng)用，為該方法的推廣應(yīng)用提供更豐富的科學(xué)依據(jù)。

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