楊 丹，劉 新*，張穎彬，尹 鵬

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，浙江 杭州 310008）

全氮量與綠茶品質(zhì)密切相關(guān)，是重要的品質(zhì)指標(biāo)值[1]，綠茶中的總氮主 要包括蛋白質(zhì)、游離氨基酸、生物堿、葉綠素、芳香物質(zhì)中的含氮化合物等成分中的氮。綠茶中全氮量的傳統(tǒng)測(cè)定方法以凱氏定氮法[2]為主，此測(cè)定方法存在測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣、污染環(huán)境等缺陷。近紅外光譜技術(shù)是一種綠色、快速、高效的新型定性、定量分析技術(shù)，目前在農(nóng)產(chǎn)品[3-4]、食品工業(yè)[5-6]等領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用，是近年來(lái)發(fā)展最快的測(cè)定技術(shù)之一，在茶葉及茶制品的理化檢測(cè)、品質(zhì)評(píng)價(jià)、真?zhèn)巫R(shí)別等方面也表現(xiàn) 出巨大的潛力。

日本最早開始研究近紅外光譜技術(shù)在茶葉中的應(yīng)用，測(cè)定綠茶中包括總氮量在內(nèi)的主要化學(xué)成分[7-8]，已研制出專門的近紅外分析 儀，廣泛應(yīng)用于茶葉的品質(zhì)檢測(cè)以及茶葉生產(chǎn)加工過(guò)程中的質(zhì)量管理[9-10]。而我國(guó)有關(guān)近紅外光譜技術(shù)還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，主要集中在成品茶[11-12]、茶湯[13-15]、茶鮮葉[3,16]常規(guī)理化成分的測(cè)定和茶葉種類產(chǎn)地識(shí)別[17-19]等方面，關(guān)于應(yīng)用現(xiàn)代近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIR）技術(shù)檢測(cè)綠茶中全氮量的研究報(bào)道甚少，與日本相比，我國(guó)茶葉因茶樹品種、種植地域、加工工藝的不同，綠茶種類繁多，有必要研制出適用于我國(guó)茶葉品質(zhì)檢測(cè)的實(shí)用模型。

本實(shí)驗(yàn)將開展利用傅里葉變換近紅外光譜（fourier transform near infrared spectroscopy，F(xiàn)T-NIR）技術(shù)檢測(cè)綠茶全氮量的研究，以期建立穩(wěn)定性好、精確度高的綠茶全氮量近紅外分析模型。全氮量與綠茶嫩度密切相關(guān)，鮮葉原料品質(zhì)的優(yōu)劣，主要與鮮葉嫩度相關(guān)。綠茶的嫩度等級(jí)從單芽、一芽一葉、一芽二葉直到較粗老產(chǎn)品，全氮量的變化趨勢(shì)明顯且較易分類，為了進(jìn)一步提高綠茶全氮量近紅外定量分析模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，對(duì)綠茶樣品進(jìn)行評(píng)審分類，建立綠茶全氮量不同嫩度等級(jí)的子模型。希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，能推進(jìn)近紅外光譜技術(shù)在茶葉成分檢測(cè)中的應(yīng)用推廣，提高茶葉產(chǎn)品相應(yīng)的品質(zhì)檢測(cè)水平。

1 材料與方法

1.1 材料及制備

選用2011—2012年的具有代表性的綠茶樣品425 個(gè)，每年分多次取樣且所有樣品各不相同，不斷的增加模型中的樣本數(shù)量。為了更好的增加穩(wěn)定性，每個(gè)樣品均在同一天測(cè)定化學(xué)值并采集光譜圖。樣品覆蓋全國(guó)主要 產(chǎn)茶區(qū)，包含茶樹品種不同（中小葉種、大葉種）、老嫩度差異明顯，加工工藝不同（炒青、烘青、蒸青等）的樣品。每份樣品取30 g左右，選用0.5 mm的篩網(wǎng)，粉碎離心過(guò)篩，得到粒度均勻的粉碎樣。

1.2 儀器與設(shè)備

AntarisⅡ傅里葉近紅外光譜分析儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；KJELTEC2300全自動(dòng)定氮儀 瑞典Foss Tecator公司；ZM200超離心研磨機(jī)（0.5 mm的篩網(wǎng)） 德國(guó)Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 全氮量的測(cè)定

采用凱氏定氮法，稱取0.5 g綠茶粉碎樣于消化管，加入濃硫酸與催化劑消解，用全自動(dòng)定氮儀測(cè)定每份樣品全氮量，同時(shí)測(cè)定茶樣的干物質(zhì)率，將全氮量以干態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。取3 次平行測(cè)定的平均值 為每個(gè)樣品的實(shí)際測(cè)定值。

1.3.2 光譜采集

采用傅里葉近紅外光譜分析儀掃描粉碎過(guò)篩的樣品，每個(gè)樣品重復(fù)裝樣3 次，裝樣量（20、10 mL小燒杯）、樣品松緊度（金屬圖章壓實(shí)）， 掃描次數(shù)64 次，分辨率4 cm－1，光譜采集范圍3 800～12 000 cm－1，旋轉(zhuǎn)裝樣皿，每個(gè)樣品掃描前均采集背景光譜。

1.3.3 綠茶全氮量校正模型的建立與外部驗(yàn)證

考慮到樣品量較大，根據(jù)全氮量含量大小排序，平均隔n 個(gè)樣品選擇1 個(gè)樣品的方式來(lái)選擇驗(yàn)證集的方法較為繁瑣，且前期實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)結(jié)果比較也與TQ軟件自動(dòng)選擇的相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)利用TQ軟件自動(dòng)選擇325 個(gè)樣品作校正集，全譜波段下采用偏最小二乘（partial least square，PLS）回歸法建立校正模型。對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理：多元散射校正（multiplicative signal correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate，SNV）、一階導(dǎo)數(shù)（first derivative，F(xiàn)D）、卷積平滑法（savitzky-golay filter，SG）、Norris導(dǎo)數(shù)濾波（norris derivative，ND）。比較對(duì)校正模型的影響；選擇波段區(qū)間：考慮全譜區(qū)、避開儀器噪聲信號(hào)、水分、水蒸氣吸收波數(shù)區(qū)間、選擇氮的特征吸收波段區(qū)間；對(duì)校正模型進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證。

選擇余下100 個(gè)樣品作外部驗(yàn)證集，驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)性能。所有數(shù)據(jù)處理均在儀器自帶的TQ Analyst軟件中進(jìn)行，以校正集樣品的均方差（RMSEC）、交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）、相關(guān)系數(shù)、因子數(shù)為指標(biāo)來(lái)優(yōu)化模型，以驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)均方差（RMSEP）、相關(guān)系數(shù)和性能指數(shù)考察模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。

1.3.4 綠茶樣品的嫩度分級(jí)與子模型的建立

根據(jù)GB/T 23776—2009《茶葉感官審評(píng)方法》，對(duì)425 個(gè)綠茶樣品進(jìn)行感官審評(píng)，并根據(jù)老嫩度的明顯差異進(jìn)行分級(jí)：從單芽、一芽一葉、一芽二葉以及較粗老的精制茶等，共6 個(gè)等級(jí)。

將綠茶樣品根據(jù)嫩度等級(jí)在全譜波段下采用PLS建立綠茶全氮量的子模型，不進(jìn)行光譜預(yù)處理。按全氮量排序，隔n選1的方式，每個(gè)嫩度等級(jí)分別選出6 個(gè)驗(yàn)證集樣品，余下的為校正集樣品。將各嫩度等級(jí)的校正集樣品合并，建立全氮量總校正模型。各子模型和總模型預(yù)測(cè)驗(yàn)證集樣品全 氮量，評(píng)價(jià)子模型預(yù)測(cè)性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠茶全氮量的實(shí)測(cè)值

隨著綠茶嫩度的增加，全氮含量越高，結(jié)果見表1。特級(jí)到2級(jí)都屬于較嫩的茶，從單芽到一芽二葉，多為名優(yōu)綠茶。嫩度等級(jí)被評(píng)為3級(jí)的樣品以大宗型綠茶居多，炒青較多。嫩度等級(jí)被評(píng)為4級(jí)和5級(jí)的樣品的全氮量均值為4.48%、3.89%，屬于比較粗老的綠茶，如珠茶、眉茶等。

表 1 綠茶全氮量實(shí)測(cè)值Table 1 Measured values of total nitrogen content in green tea

2.2 綠茶近紅外平均光譜圖

從圖1可知，波段區(qū)間3 900～5 100 cm－1范圍內(nèi)近紅外透光率大，信息量豐富。12 000～10 200、3 900～3 800 cm－1處儀器產(chǎn)生的噪聲信號(hào)較大；在5 100～5 600 cm－1，6 900～7 400 cm－1之間仍會(huì)受水蒸氣的影響產(chǎn)生了較小的噪聲信號(hào)。因 此在模型建立時(shí)需要考慮是否有必要避開這些波數(shù)區(qū)間。氮的NIR吸收主要與N—H的分子振動(dòng)相關(guān)。有學(xué)者研究表明：N—H鍵伸縮振動(dòng)的一級(jí)倍頻在6 666 cm－1附近，伸縮振動(dòng)與彎曲振動(dòng)的組合頻在5 000 cm－1附近，帶有N—H的雜環(huán)芳香化合物，較強(qiáng)的一級(jí)倍頻出現(xiàn)在6 835 cm－1，組合頻出現(xiàn)在4 715 cm－1附近[20]。而蛋白質(zhì)的特征譜帶為10 277～9 804 cm－1、6 667～6 536 cm－1的N—H倍頻吸收，以及4 878～4 854 cm－1的N—H組合頻吸收，4 613～4 587 cm－1的N—H與C=O/N—H /C—N組合頻[21]。因此在模型建立時(shí)需要考慮特征波數(shù)區(qū)間的選取。

圖 1 綠茶近紅外平均光譜圖Fig.1 Average near-infrared spectrogram s of green tea

2.3 波段選擇與光譜預(yù)處理對(duì)綠茶全氮量模型的影響

采用PLS回歸法建立模型，采用TQ軟件中的Spectrum Outlier diagnostic排除偏差較大的9 個(gè)異常值，最終確定選擇316 個(gè)樣品作校正集，在全譜波段3 814～12 000 cm－1范圍內(nèi)建立的綠茶全氮量的PLS校正模型。各波段區(qū)間的模型在最佳光譜預(yù)處理下的預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示。

表 2 波段區(qū)間與光譜預(yù)處理選取對(duì)全氮量模型預(yù)測(cè)性能的影響Table 2 Model statistical parameters for total nitrogen content under different wavebands and spectral pretreatments

以R M S E P為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從表2可以看出，在4 691～3 959、5 126～4 848 cm－1（序號(hào)6）兩波段區(qū)間內(nèi)的模型預(yù)測(cè)性能最好，此區(qū)間內(nèi)包含了主要的N—H鍵、N—H與C—N鍵、N—H與C=O鍵的特征吸收波數(shù)，且避開了模型的水分與噪聲干擾，光譜經(jīng)過(guò)一階導(dǎo)數(shù)與SG平滑處理后，驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的RMSEP為0.092 5%。此外，與在全譜區(qū)（序號(hào)1）建立的模型相比，當(dāng)波段區(qū)間避開水分、水蒸氣吸收、儀器噪聲后，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果略好，RMSEP由原來(lái)的0.098 0%降到0.093 8%（序號(hào)2）和0.093 1%（序號(hào)8），因子載荷圖也降低了一維。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在建模之前根據(jù)組分吸收近紅外的信息對(duì)波數(shù)區(qū)間進(jìn)行選擇，是一種有效的優(yōu)化模型方法，有助于減少噪音信號(hào)的影響、提高運(yùn)算速率和模型的穩(wěn)定性。

2.4 綠茶全氮量校正模型的建立與外部驗(yàn)證

圖 2 綠茶全氮量的校正模型與外部驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Calibration model of total nitrogen content in green tea and external verification results

采用優(yōu)選后的波段區(qū)間和一階導(dǎo)數(shù)與SG平滑處理，建立了綠茶全氮量的偏最小二乘模型，校正模型的因子載荷圖見圖2b，在建模因子為9時(shí)，RESECV值趨于平緩，已降到最低值，因此選擇9個(gè)因子建立校正模型。模型因子數(shù)為9時(shí)，316 個(gè)校正集的綠茶樣品全氮量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值見圖2a；所有校正集樣品的綠茶全氮量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的校正均方差（RMSEC）為0.088 4%，預(yù)測(cè)誤差在0.001 1%～0.325 9%之間（圖2d），平均預(yù)測(cè)誤差0.069 2%，相關(guān)系數(shù)為0.994 8。為了更好的評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)性能，選擇100個(gè)樣品作外部驗(yàn)證集；用已建立的校正模型對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖2c所示：驗(yàn)證集樣品的全氮量的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的RMSEP為0.092 5%，預(yù)測(cè)誤差在0.191 2%～0.0001%之間（圖2d），平均預(yù)測(cè)誤差0.079 3%，相關(guān)系數(shù)為0.993 9，綠茶全氮量模型的預(yù)測(cè)結(jié)果很好。

將100 個(gè)驗(yàn)證集樣品全氮量的實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值采用SAS軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.009 9，在0.05顯著性水平下，T值為－0.18，P值為0.859 8，2 種測(cè)定方法無(wú)顯著性差別，可以應(yīng)用傅里葉近紅外光譜技術(shù)快速測(cè)定綠茶全氮量。

2.5 綠茶全氮量子模型的建立與外部驗(yàn)證

表 3 全氮量子模型統(tǒng)計(jì)參數(shù)Table 3 Statistic parameters of sub-models for total nitrogen content

從表3可以看出，綠茶樣品根據(jù)嫩度等級(jí)分類后，建立的各子模型的校正集樣品的RMSEC均有不同程度的降低。與嫩度總模型的預(yù)測(cè)性能相比，特級(jí)、1、3、5級(jí)的RMSEP值均值低于總模型。其中3、5級(jí)子模型的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。在校正模型的建立與應(yīng)用中，根據(jù)嫩度等級(jí)來(lái)建立子模型，可以提高模型的預(yù)測(cè)性能。3級(jí)子模型的對(duì)3級(jí)驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果最好，樣品的全氮量的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的RMSEP值最小，為0.037 9，相關(guān)系數(shù)為0.996 1。

各子模型對(duì)驗(yàn)證樣品的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的比較，見表4。嫩度等級(jí)評(píng)為特級(jí)、1、5級(jí)的驗(yàn)證集樣品的子模型預(yù)測(cè)結(jié)果（平均偏差分別為0.007%、0.018%、0.026%）均優(yōu)于總模型的預(yù)測(cè)結(jié)果（平均偏差分別為0.057%、0.041%、0.097%），其中特級(jí)樣品采用特級(jí)子模型預(yù)測(cè)全氮量時(shí)，驗(yàn)證樣品的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的平均偏差最小，為0.007%，預(yù)測(cè)值最接近實(shí)測(cè)值，而采用中小葉種和總模型預(yù)測(cè)時(shí)，其平均偏差相對(duì)較大，分別為0.049%、0.057%。3級(jí)驗(yàn)證集樣品用總模型和3級(jí)子模型預(yù)測(cè)時(shí)，其平均偏差都很小，分別為0.015%、0.018%，預(yù)測(cè)值接近實(shí)測(cè)值；因此，對(duì)于嫩度較好的樣品，采用嫩度相應(yīng)的子模型對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)，可以提高其預(yù)測(cè)性能。對(duì)于粗老的5級(jí)樣品，采用5級(jí)子模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果更好。對(duì)于嫩度一般的3級(jí)樣品，由于總模型中3級(jí)樣品總量最多，是其他樣品的2～3 倍，因此進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，采用子模型與總模型的預(yù)測(cè)結(jié)果相當(dāng)。這也說(shuō)明了校正集代表性樣品數(shù)量的重要性。

表 4 驗(yàn)證集樣品的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值Table 4 Actual measured and calculated values of the validation set%

3 結(jié) 論

傳統(tǒng)的凱氏定氮法，不僅費(fèi)時(shí)，還需大量試劑，本實(shí)驗(yàn)采用偏最小二乘法，結(jié)合傅里葉變換近紅外光譜儀，建立了近紅外光譜技術(shù)測(cè)定綠茶含氮的定量分析模型，模型能滿足綠茶全氮量的快速檢測(cè)要求。驗(yàn)證集樣品的RMSEP為0.092 5，相關(guān)系數(shù)分別為0.993 9。此外，綠茶種類繁多，嫩度不一，實(shí)驗(yàn)根據(jù)嫩度等級(jí)，建立了綠茶全氮量子模型，提高了模型的預(yù)測(cè)性能。與總模型的預(yù)測(cè)性能相比，特級(jí)、1級(jí)、3級(jí)、5級(jí)的RMSEP值均低于總模型。嫩度為3級(jí)的子模型預(yù)測(cè)結(jié)果最好，樣品的全氮量的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的RMSEP值最小，為0.037 9，相關(guān)系數(shù)為0.996 1。每年可繼續(xù)添加新樣品來(lái)優(yōu)化模型，提高模型的實(shí)際檢測(cè)性能，進(jìn)一步推廣近紅外 光譜技術(shù)在茶葉品質(zhì)快速檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

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