王 尉，林 楠，樂(lè)勝鋒，王 覃，周曉晶，趙新穎，杜 寧，張經(jīng)華

（北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089）

茶葉在我國(guó)有數(shù)千年的飲用歷史，同時(shí)歷代藥書(shū)中也有茶葉入藥的記載。通過(guò)研究表明，茶不僅能止渴、提神醒腦、消除疲勞，還具有抗衰老、抗輻射、抗菌消炎、降低血糖血脂、防治心腦血管病等多種生理功能。茶多酚作為是茶葉中重要的活性成分，其在茶葉中含量很高，約占茶葉干質(zhì)量的25%～35%，主要含有6 類(lèi)成分：黃烷醇類(lèi)、4-羥基黃烷醇類(lèi)、花色苷類(lèi)（花青素類(lèi)、花白素類(lèi)）、黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)和酚酸及縮酚酸類(lèi)。其中以黃烷醇類(lèi)（主要是兒茶素類(lèi)化合物）最為重要，占茶多酚總量的60%～80%。兒茶素不僅僅對(duì)茶葉的滋味具有重要的作用，而且大量的研究表明兒茶素還具有重要的生物活性，在抗氧化、清除自由基[1-4]、抗輻射[5]、抗病毒[6-7]、抗菌消炎[8-9]、降血壓血脂[10-14]和預(yù)防癌癥[15-20]等方面具有重要的功能。

高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）作為20世紀(jì)70、80年代間發(fā)展起來(lái)的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)[21-22]，結(jié)合了液-液萃取和分配色譜的優(yōu)點(diǎn)，是一種無(wú)需任何固態(tài)載體或支撐的液-液分配色譜技術(shù)。其根據(jù)樣品在兩相中分配系數(shù)的不同達(dá)到樣品之間相互分離的目的。HSCCC具有無(wú)不可逆吸附、回收率高、進(jìn)樣量大[23]等特點(diǎn)。該技術(shù)在綠茶化學(xué)成分分離中也得到了較好的應(yīng)用。Cao Xueli等[24]對(duì)綠茶提取物進(jìn)行兩步HSCCC分離，可以得到EGCG、GCG、ECG 3 種兒茶素成分。成超等[25]采用高效逆流色譜（high-performance countercurrent chromatography，HPCCC）對(duì)兒茶素粗品進(jìn)行分離，在120 min內(nèi)一次制備即可得到兒茶素和表兒茶素兩種兒茶素異構(gòu)體。但是，尚未有綠茶活性成分HSCCC分離純化方法系統(tǒng)性研究的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HSCCC技術(shù)對(duì)市售綠茶進(jìn)行活性成分研究，通過(guò)對(duì)綠茶有效部位的分段萃取和多種HSCCC溶劑系統(tǒng)的分離，共得到8 種高純度單體化合物，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、甲醇、磷酸（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國(guó)Fisher scientific公司；咖啡堿（caffeine，CFA）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素（epicatechin，EC）、兒茶素（catechin，C）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）（對(duì)照品） 上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；龍井綠茶 北京吳裕泰茶業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TBE-300B半制備型高速逆流色譜儀 上海同田生物技術(shù)有限公司；LC-20A高效液相色譜儀（配SPDM20A檢測(cè)器） 日本Shimadzu公司；ALPHA 1-2 plus冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液配制

稱(chēng)取CFA、EGC、EC、C、EGCG、GCG、ECG、GA對(duì)照品各10 mg分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，可得1 mg/mL對(duì)照 品溶液。再?gòu)钠渲蟹謩e吸取1 mL溶液置于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即單個(gè)對(duì)照品的質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL。

1.3.2 高效液相色譜條件

Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%磷酸溶液（A）-甲醇（B），線(xiàn)性梯度洗脫，20%～80% B（0～30 min），流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：30℃。

1.3.3 樣品的提取

將綠茶粉碎過(guò)0.3 mm篩，稱(chēng)取綠茶粉末200 g，加入80%乙醇2 L，60 ℃回流提取3 次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液，減壓回收乙醇得提取物浸膏。所得浸膏用蒸餾水分散，分別用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，減壓回收溶劑得二氯甲烷和乙酸乙酯浸膏，備用。剩余水相蒸干，備用。

1.3.4 溶劑選擇和高速逆流色譜操作過(guò)程

對(duì)于綠茶中兒茶素等化學(xué)成分的HSCCC分離均采用乙酸乙酯-水的中等極性溶劑體系，根據(jù)待分離化合物的極性進(jìn)行輔助溶劑的選擇。對(duì)于極性較大的EGC和CFA采用正丁醇-乙酸乙酯-水的極性溶劑體系；對(duì)于EC、C、EGCG、GCG等兒茶素類(lèi)成分，可按照化合物的極性強(qiáng)弱調(diào)節(jié)溶劑體系中正己烷的比例，以到達(dá)良好的分離效果。

將選定的溶劑體系充分混合后，靜置分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。先以10 mL/min的流速泵入固定相，待固定相充滿(mǎn)管道后。打開(kāi)主機(jī)調(diào)整轉(zhuǎn)速為900 r/min，主機(jī)正轉(zhuǎn)，當(dāng)達(dá)到設(shè)定轉(zhuǎn)速時(shí)，以2 mL/min的流速泵入流動(dòng)相。主機(jī)溫度控制在25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為280 nm，當(dāng)流動(dòng)相從主機(jī)出口流出時(shí)進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠茶的提取

對(duì)綠茶粉末采用80%乙醇，料液比1:10（g/mL），60 ℃回流提取1 h，濾渣重復(fù)2 次，合并濾液，減壓濃縮，所得浸膏在60 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算樣品浸膏的提取率為13.8%。通過(guò)對(duì)綠茶提取物和混合對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC分析，如圖1所示，結(jié)果表明綠茶中以?xún)翰杷貫橹饕幕钚猿煞志驯惶崛〕鰜?lái)。

圖 1 綠茶提取物（A）對(duì)照品（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards

2.2 綠茶化學(xué)成分分離純化

對(duì)二氯甲烷萃取物采用正丁醇-乙酸乙酯-水（0.2∶1∶2，V/V）溶劑體系進(jìn)行HSCCC分離，可得到CFA，如圖2、3所示。對(duì)乙酸乙酯部位首先采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.8∶5∶1∶5，V/V）溶劑體系進(jìn)行第1次HSCCC分離，將收集的組分分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其中第Ⅳ組分為ECG（如圖4、5），對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分進(jìn)行第2次HSCCC分離，溶劑體系分別為正丁醇-乙酸乙酯-水（0.2∶1∶2，V/V）、正己烷-乙酸乙酯-水（1∶20∶20，V/V）、正己烷-乙酸乙酯-水（1∶8∶8，V/V），可得到EGC、EC、C、EGCG、GCG，見(jiàn)圖6～11。對(duì)水相萃取物采用乙酸乙酯-乙醇-水（5∶0.5∶ 6，V/V）溶劑體系進(jìn)行HSCCC分離，可得到GA，如圖12、13所示。

圖 2 二氯甲烷萃取物的HSCCC色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of dichloromethane extract

圖 3 二氯甲烷萃取物純化后HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of purified dichloromethane extract

圖 4 乙酸乙酯萃取物HSCCC色譜圖Fig.4 HSCCC chromatogram of ethyl acetate extract

圖 5 乙酸乙酯萃取物純化后HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of purified ethyl acetate extract and purified fractions

圖 6 峰Ⅰ的HSCCC色譜圖Fig.6 HSCCC chromatogramof peakⅠ

圖 7 峰Ⅰ純化后EGC的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of purified peakⅠ

圖 8 峰Ⅱ的HSCCC色譜圖Fig.8 HSCCC chromatogram of peak Ⅱ

A.峰Ⅱ純化后的EC；B.峰Ⅱ純化后的C；C.峰Ⅱ純化后的EGCG。

圖 10 峰Ⅲ的HSCCC色譜圖Fig.10 HSCCC chromatogram of peak Ⅲ

圖 11 峰Ⅲ純化后GCG的HPLC色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of purified peak Ⅲ

圖 12 水相萃取物的HSCCC色譜圖Fig.12 HSCCC chromatogram of water extract

A.水相萃取物；B.純化后GA。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用HSCCC的方法，從綠茶原料中分離得到CFA、EGC、EC、C、EGCG、GCG、ECG、GA 8 種單體化合物，其純度分別為99.5%、97.2%、98.2%、97.6%、98.8%、99.1%、99.2%和98.8%。其中包含EGCG等6 種兒茶素類(lèi)化合物以及沒(méi)食子酸和咖啡堿。尤其對(duì)于綠茶中含量較低的C（提取物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5‰，下同）、EC（7‰）、EGC（8‰）3 種兒茶素類(lèi)化合物，通過(guò)2 次HSCCC分離，即可得到高純度單體，該方法簡(jiǎn)便可行。

HSCCC法較常規(guī)柱色譜的分離方法，無(wú)需多種固定相填料，僅通過(guò)對(duì)不同溶劑系統(tǒng)選擇便可達(dá)到對(duì)不同化合物的分離純化，具有成本低廉、分離快速的優(yōu)點(diǎn)。因而顯示了HSCCC法在天然產(chǎn)物活性成分研究開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)，也可為中草藥質(zhì)量控制過(guò)程中所需要的高純度單體的制備提供了一種簡(jiǎn)單實(shí)用的方法。

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