馬曉年，邵婭婷，李 菲，熊 杰，曹秋娥,*

（1.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，教育部自然資源藥物化學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650091；2.云南省疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650022）

茶在中國已有3 000余年的食用歷史，是目前世界上最為流行的飲料之一。茶葉中不僅含有豐富的維生素和礦物質(zhì)，而且含有許多對人體有保健作用的功效成分，如茶蛋白、茶多酚、茶多糖、咖啡堿、茶葉皂苷、氨基酸、茶色素等，其中對人體健康最有益的物質(zhì)之一是茶多酚。茶多酚是茶葉中酚類物質(zhì)及其衍生物的總稱，主要包括兒茶素類、黃酮、黃酮醇類、花青素類、花白素類和酚酸及縮酚酸類，具有強抗氧化性和降糖、減肥、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、抗輻射等作用[1-4]，目前其腫瘤化學(xué)預(yù)防作用及抗HIV作用也引起了人們的廣泛關(guān)注[2-6]。

茶葉中多酚類物質(zhì)的測定已有不少研究[7-10]，采用的方法包括原子吸收光譜法[11]、紫外-可見分光光度法[12]、近紅外光譜法[13-14]、色譜法[15]與毛細(xì)管電泳法[16]等，但現(xiàn)有這些方法都沒有涉及茶葉中兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚和楊梅素的同時分離分析。肖俊松[17]、孫曉莉[18]、邸羿[19]、付靜[20]、Peres[21]和Bonoli[22]等分別采用高效液相色譜、超高效液相色譜和毛細(xì)管電泳測定了茶葉中的兒茶素類成分，但都沒有涉及山奈酚、楊梅素和槲皮素的分析；李家華等[23]建立了測定茶中楊梅素、槲皮素和山奈酚的高效液相色譜法，但沒有研究兒茶素和表兒茶素的檢測；López等[24]用毛細(xì)管膠束電動色譜測定了茶葉中7 種兒茶素類化合物和槲皮素、百里香酚，但沒有測定山奈酚和楊梅素；衷明華等[25]建立了茶葉中4 種有效成分的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，但只涉及了本研究中的5 種成分中的表兒茶素。因此，本研究采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式，在優(yōu)化電解質(zhì)溶液與儀器工作條件的基礎(chǔ)上，建立了一種同時分離測定兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚和楊梅素的新方法，該方法簡單快速、重復(fù)性好、線性范圍寬，可用于茶葉中這5 種組分的同時測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)對照品兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚、楊梅素 中國食品藥品檢定研究院；β-環(huán)糊精 美國Sigma Aldrich公司；Na2B4O7、乙腈、甲醇（均為分析純） 上海化學(xué)試劑有限公司；水為艾柯純水器UP級水。

1.2 儀器與設(shè)備

P/ACETMMDQ型高效毛細(xì)管電泳儀（配有二級管陣列紫外檢測器） 美國Beckman Coulter公司；未涂層石英毛細(xì)管（57 cm×50 cm，75 μm） 河北省永年銳灃色譜器件有限公司；pHS-2C型pH計 上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚、楊梅素儲備液（1.0 mg/mL）均用甲醇配制，4 ℃保存。樣品溶液：參照文獻(xiàn)[23]，稱取一定量經(jīng)干燥粉碎后的茶葉樣品或添加了一定量目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品的茶葉樣品，加入40 mL甲醇和4 mL鹽酸，85 ℃水浴回流1.5 h，過濾并用少量甲醇多次洗滌殘渣，合并濾液與洗滌液，減壓蒸餾至近干，殘渣用甲醇溶解并定容到50 mL。所有溶液在使用前均用0.45 μm濾膜過濾。

1.3.2 毛細(xì)管電泳條件

運行電解質(zhì)溶液：含有10 mmol/L Na2B4O7、5 mmol/L β-環(huán)糊精、8%（V/V）乙腈的緩沖溶液（pH 9.11）；電泳儀器條件：分離電壓20 kV；毛細(xì)管柱溫25 ℃；二級管陣列紫外檢測器（經(jīng)3D全波長掃描，最終選擇檢測波長為200 nm）；采用壓力（0.5 psi，3 447.38 Pa）進(jìn)樣5.0 s。

為確保重復(fù)性，毛細(xì)管柱每天在運行前及2次運行之間均依次用0.1 mol/L NaOH、去離子水和運行緩沖溶液分別沖洗3、2、4 min。數(shù)據(jù)處理采用32 Karat軟件。

各組分的相對遷移時間（tR）定義為組分的遷移時間（tm）與內(nèi)標(biāo)物（即溶劑甲醇）峰的遷移時間（ts）之差。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳條件的優(yōu)化

2.1.1 緩沖液pH值及硼砂濃度對分離度的影響

由于被測組分均含有羥基，可以與硼原子絡(luò)合并電離而帶負(fù)電荷，因此實驗選擇了毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離模式和硼砂緩沖溶液為電解質(zhì)溶液。在固定緩沖溶液中硼砂濃度為10 mmol/L的條件下，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl在pH 8.0～9.5范圍內(nèi)調(diào)節(jié)溶液的pH值，研究電解質(zhì)溶液的pH值對分離的影響。由圖1可知，兒茶素和表兒茶素在所測定pH值范圍內(nèi)并沒有得到有效分離，但當(dāng)電解質(zhì)溶液的pH值達(dá)到9.11時，這2 個組分的分離度達(dá)到最大。因此實驗選擇電解質(zhì)溶液的pH值為9.11。

圖 1 pH值對5種多酚類化合物相對遷移時間的影響Fig.1 Effect of pH on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

固定電解質(zhì)溶液的pH值為9.11后，研究了硼砂濃度（5.0～15.0 mmol/L）對分離度的影響。圖2表明，隨電解質(zhì)溶液中硼砂濃度的增加，組分之間的分離度有所增加，但遷移時間明顯延長，而且在硼砂濃度大于15 mmol/L后，基線噪音嚴(yán)重，檢測靈敏度下降。為縮短分析時間、降低基線噪音，選用10 mmol/L的硼砂緩沖體系（pH 9.11）為分離緩沖溶液。

圖 2 硼砂濃度對5種多酚類化合物相對遷移時間的影響Fig.2 Effect of Na2B4O7 concentration on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

圖 3 3 β-環(huán)糊精濃度對5 種多酚類化合物相對遷移時間的影響Fig.3 Effect of β-CD concentration on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

因為兒茶素和表兒茶素在僅含硼砂的電解質(zhì)溶液中不能得到有效分離，所以實驗考慮在電解質(zhì)溶液中添加β-環(huán)糊精，利用其對立體異構(gòu)體具有不同的包合能力來改善兒茶素和表兒茶素的分離效果。由圖3可知，β-環(huán)糊精的加入不僅能縮短分析時間，而且能明顯改善兒茶素和表兒茶素的分離度。當(dāng)β-環(huán)糊精的添加濃度為5 mmol/L時，各組分之間的分離度理想，而且遷移時間較短。因此，實驗選擇在電解質(zhì)溶液中添加5 mmol/L的環(huán)糊精。

2.1.3 乙腈添加量對分離度的影響

雖然在含有5 mmol/L β-環(huán)糊精的濃度為10 mmol/L的硼砂緩沖溶液（pH 9.11）中，標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液中各組分能得到有效分離，但在此電解質(zhì)溶液中，茶葉中共存的其他組分對待測組分，尤其是兒茶素有干擾，因此實驗進(jìn)一步考慮在電解質(zhì)溶液中加入乙腈，并研究了乙腈的添加量對分離度的影響。由圖4可知，隨著電解質(zhì)溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)增加，各組分間的分離度有所增加，遷移時間則明顯延長。當(dāng)乙腈的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到8%時，茶葉中共存的其他組分與待測組分的電泳峰之間不再有重疊，故實驗選擇乙腈的添加量為8%（V/V）。

圖 4 乙腈體積分?jǐn)?shù)對5種多酚類物質(zhì)相對遷移時間的影響Fig.4 Effect of acetonitrile concentration on relative migration time for five kinds of polyphenolic compounds

2.1.4 儀器條件對分離度的影響

在上述選定的電解質(zhì)溶液中，分別研究了分離電壓（15～30 kV）、毛細(xì)管柱溫（15～30 ℃）和0.5 psi（3 447.38 Pa）壓力下的進(jìn)樣時間（3～10 s）對分離檢測的影響。結(jié)果表明，隨分離電壓和毛細(xì)管柱溫的增加，遷移時間縮短，基線噪音增大，分離度有所下降；隨進(jìn)樣時間的延長，檢測靈敏度增加，但峰形展寬，柱效下降。實驗最終選擇分離電壓為20 kV、毛細(xì)管柱溫為25 ℃、壓力（0.5 psi，3 447.38 Pa）進(jìn)樣時間為5.0 s。

由圖5可知，在上述優(yōu)化的電泳條件下，不僅5 個組分彼此之間達(dá)到了基線分離，而且樣品中的其他共存組分與待測組分之間也得到了有效分離。

2.2 工作曲線與精密度

利用上述選定的最佳電泳介質(zhì)及儀器工作條件對一系列不同質(zhì)量濃度的兒茶素、表兒茶素、山奈酚、楊梅素和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進(jìn)行電泳分離分析，以各組分的峰面積A為縱坐標(biāo)、對應(yīng)質(zhì)量濃度ρ/（μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，求得各組分的工作曲線。此外，實驗還對質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液平行測定了7次，計算了各組分遷移時間tm和峰面積A的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。由表1可知，本方法線性范圍較寬、精密度好。

圖 5 優(yōu)化條件下標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液（A）和福建產(chǎn)鐵觀音樣品溶液（B）的電泳圖Fig.5 Electropherogram of standard mixture (A) and Tieh-Kuan-Yin tea (B) under optimized conditions

表 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與精密度Table 1 Calibration curves and precision (expressed as RSD) of the method

2.3 樣品分析與回收率

表 2 樣品中各組分的含量（n=5）=5Table 2 Contents of five polyphenolic compounds in tea determined byTable 2 Contents of five polyphenolic compounds in tea determined by the method (od (n n = 5)= 5)

在選定的最佳電泳條件下，分別對福建產(chǎn)鐵觀音、四川產(chǎn)苦丁茶、四川產(chǎn)竹葉青、云南普洱綠茶、云南普洱紅茶中的兒茶素、表兒茶酚、山奈酚、楊梅素和槲皮素進(jìn)行了分析測定。同時，在茶葉樣品中添加一定量的兒茶素、表兒茶素、山奈酚、楊梅素和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品后測定，對各樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗。由表2、3可知，本方法測定不同茶葉中的這5 種多酚類物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在4.0%以內(nèi)，加標(biāo)回收率均在95.4%～105.6%之間。

表 3 加標(biāo)回收率（ =3）Table 3 Spike recoveries of five polyphenolic compounds in tea ( = 3)%

3 結(jié) 論

兒茶素、表兒茶素、山奈酚、楊梅素和槲皮素是茶葉中重要的茶多酚，其中前2 種是茶葉中的代表性兒茶素類物質(zhì)，后3 種是茶葉中的代表性黃酮，因此同時分析測定茶葉中這5 種組分具有重要意義。本研究所建立的毛細(xì)管區(qū)帶電泳法可以在14 min內(nèi)實現(xiàn)茶葉中兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚和楊梅素的同時分離分析，其工作曲線的線性范圍分別為2.0～210.0、2.0～210.0、1.0～150.0、1.0～150.0 μg/mL和2.0～200.0 μg/mL，對樣品檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.0%以內(nèi)，加標(biāo)回收率在95.4%～105.6%。

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