邱義蘭，吳俊文，邱果，李桑，李燁，劉勝姿，劉如石,3

1 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081 2 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013 3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410128

戊型肝炎是全球最主要的病毒性肝炎之一，由HEV感染導(dǎo)致，戊型肝炎多數(shù)呈自限性，其癥狀與甲肝相似，但癥狀更重，死亡率更高，該病孕婦死亡率高達(dá) 20%，慢性肝病患者合并戊型肝炎感染容易引發(fā)肝衰竭，病死率達(dá)70%[1-4]。HEV 至少可以分為 4 個(gè)基因型，在中國(guó)主要流行的是基因Ⅰ型和基因Ⅳ型 HEV。根據(jù)易感宿主又可以分為 2 個(gè)大類(lèi)：一類(lèi) (H類(lèi)) 僅分離于人類(lèi)，包括基因Ⅰ型和基因Ⅱ型，是迄今病因明確的大規(guī)模戊肝爆發(fā)的病原體，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物目前只成功感染非人靈長(zhǎng)類(lèi)；另一類(lèi)(Z類(lèi)) 廣泛分布于世界各地，只見(jiàn)于小規(guī)模流行和臨床散發(fā)病例，可以感染多種哺乳動(dòng)物，目前研究發(fā)現(xiàn)豬為 Z類(lèi)HEV的天然宿主[5-7]。由于缺乏可靠的 HEV細(xì)胞培養(yǎng)模型及動(dòng)物模型，對(duì)完整 HEV的研究較少，因此，H類(lèi)和Z類(lèi)在跨種間感染入侵宿主細(xì)胞機(jī)制的差異，以及致病機(jī)理至今還不清楚。

HEV ORF2 編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白，形成病毒衣殼蛋白，介導(dǎo)HEV與宿主的吸附?，F(xiàn)有的研究結(jié)果證明，HEV的主要中和表位位于 ORF2的aa384-606之間，也是主要介導(dǎo)HEV與嗜性細(xì)胞吸附的區(qū)域[2-3,8-10]。本實(shí)驗(yàn)室在表達(dá)基因Ⅰ型HEV衣殼蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用大腸桿菌表達(dá)基因Ⅳ型 HEV衣殼蛋白缺失體 (ORF2 aa384-606)，并研究了重組表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)性質(zhì)和部分物理性質(zhì)，證明表達(dá)的基因Ⅳ型HEV衣殼蛋白模擬了天然病毒顆粒的中和表位，其與受體的結(jié)合方式與天然病毒結(jié)合受體的方式可能一致，為進(jìn)一步從分子水平研究戊型肝炎病毒基因Ⅰ型和基因型Ⅳ感染宿主細(xì)胞差異的機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEV基因：基因Ⅳ型HEV ORF2 (aa384-606)基因來(lái)源于我國(guó)戊肝病人的血清標(biāo)本 (廈門(mén)大學(xué)夏寧邵教授惠贈(zèng))，單克隆抗體15B2和8C11、HRP-羊抗鼠二抗、HRP-羊抗人 IgG和 HRP-羊抗人IgM (夏寧邵教授惠贈(zèng))；pMD-18T、Taq酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ和NdeⅠ (TaKaRa公司)；DNA膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) (Genestar公司)；硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell公司)；HRP-DAB底物顯色試劑盒 (TIANGEN公司)。

1.2 方法

1.2.1 rP24基因的編碼序列克隆與構(gòu)建表達(dá)載體

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化

挑取篩選的單克隆菌株，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中 (含有100 μg/mL Kan+) 37 ℃培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況。表達(dá)的包涵體蛋白先溶于4 mol/L尿素，然后樣品透析到20倍體積以上的PBS溶液 (20 mmol/L NaCl, 2.68 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 1.76 mmol/L KH2PO4, pH 7.4) 中 4℃復(fù)性，2?3 h更換一次PBS溶液，4 ℃、8 000×g離心 10 min，收集離心后的上清液即為復(fù)性的重組蛋白。

用10倍柱體積的PBS先平衡離子交換層析柱 (DEAE-5PW，21.5 mm×150 mm，日本TOSOH公司) 將復(fù)性蛋白樣品上柱，以2倍柱床體積的PBS緩沖液過(guò)柱，然后線性梯度 0–1 mol/L NaCl/PBS洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為1.0 mL/min，收集280 nm吸收值大于0.5 AU的蛋白峰，每管收集1 mL，SDS-PAGE分析收集組分的蛋白純度。

收集離子交換柱純化重組蛋白，上樣于平衡好的分子篩層析柱 (TSK-GEL G 3 000 SW 7.5 mm×300 mm，日本 TOSOH)，流速為0.5 mL/min，收集280 nm吸收值大于0.2 AU的蛋白峰，每管收集1 mL，SDS-PAGE分析收集組分的蛋白純度。

1.2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) (Western blotting)

蛋白樣品經(jīng) 12%的 SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到PVDF膜進(jìn)行雜交：用含 5%的脫脂奶的 TBS(100 mmol/L Tris·HCl, 150 mmol/L NaCl, pH7.5)緩沖液封閉 2 h。加入用脫脂奶稀釋的抗 HEV ORF2鼠源單克隆抗體，室溫反應(yīng) 2 h；TBST緩 沖 液 (100 mmol/L Tris·HCl, 150 mmol/L NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5) 洗膜3次，每次10 min；加入HRP酶標(biāo)羊抗鼠，室溫反應(yīng)2 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附分析 (ELISA)

將純化的 rP24重組蛋白用碳酸鹽緩沖液(3.5 mmol/L NaHCO3, 15 mmol/L Na2CO3,3 mmol/L NaN3) 稀釋抗原至終濃度為1 μg/mL，聚苯乙烯板的每孔包被100 μL，37 ℃包被2 h；棄孔內(nèi)液體，PBST洗滌1次，每孔加入200 μL封閉液 (2%明膠，0.5%酪蛋白，0.1% ProClin 300)，37 ℃封閉2 h后抽干；加入樣品稀釋液(2% 明膠，0.5% 酪蛋白，0.1% ProClin 300，15% 新生牛血清) 稀釋的待檢樣品 100 μL，37 ℃孵育30 min，PBST洗滌3次；每孔加入封閉液稀釋的 HRP-羊抗人二抗 100 μL，37 ℃孵育30 min，PBST洗滌3次；每孔加入100 μL顯色液，37 ℃避光顯色10 min，加終止液終止顯色液，450 nm/620 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的OD值。

1.2.5 純化后蛋白的動(dòng)態(tài)光散射

動(dòng)態(tài)光散射專(zhuān)用的石英比色皿用 0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾的超純水反復(fù)沖洗20遍以上。待測(cè)樣品經(jīng) 4 ℃、15 000×g 離心 15 min 后，取 50 μL樣品至比色皿中，待溫度平衡到25 ℃時(shí)，將比色皿放入動(dòng)態(tài)光散射儀 (美國(guó) PROTEIN SOLUTION公司，DYNAORO99-D-50型) 樣品架進(jìn)行測(cè)量，入射波長(zhǎng)為824 nm，溶劑為PBS，采用Regulation算法計(jì)算，根據(jù)需要設(shè)置過(guò)濾參數(shù)和分析分辨率。

1.2.6 純化蛋白非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native Blue PAGE)

非變性電泳參考 Wittig等[11]的方法，稍作修改，具體步驟如下：配制 13%的分離膠，蛋白樣品和上樣緩沖液按 1∶1的比例混勻上樣，先恒壓100 V于4 ℃電泳，待樣品進(jìn)入濃縮膠后，恒壓300 V繼續(xù)電泳，當(dāng)?shù)鞍讟悠吩诜蛛x膠中泳動(dòng)達(dá)到分離膠的 1/3處時(shí)，更換為 1/10負(fù)極緩沖液，然后固定、染色與脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

P24基因經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增后，產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果在500?750 bp之間發(fā)現(xiàn)唯一一條清晰、大小約為600 bp DNA條帶(圖1A)，與P24基因理論值大小相符。連接到T載體上后送上海生工測(cè)序，結(jié)果顯示該序列與GenBank中基因Ⅳ型HEV基因序列 (GenBank Accession No. AB161717.1) 完全一致。然后將P24基因亞克隆到pTO-T7表達(dá)質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒 pTO-T7-P24經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切和電泳檢測(cè)后，結(jié)果在 600 bp位置處觀察到 DNA條帶，說(shuō)明P24基因已經(jīng)成功克隆到表達(dá)載體上 (圖 1B)。

2.2 rP24的誘導(dǎo)表達(dá)

將誘導(dǎo)好的重組rP24菌株和僅轉(zhuǎn)化空母體質(zhì)粒的對(duì)照組菌株制備蛋白樣品并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果在rP24重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)的試驗(yàn)組中可以觀察到一條相對(duì)較粗的蛋白條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量大小約為25 kDa，與基因Ⅳ型HEV rP24的理論分子量23.25 kDa基本一致，這種分子量大小的差異可能是重組蛋白構(gòu)象與天然蛋白不一致造成的。而在對(duì)照組中沒(méi)有出現(xiàn)這一分子量大小的蛋白條帶 (圖 2A)，說(shuō)明rP24在重組菌株中可能獲得了高效表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白與鼠源抗HEV ORF2蛋白單克隆抗體15B2發(fā)生特異性反應(yīng) (圖2B)，進(jìn)一步說(shuō)明P24基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，而且具有良好的免疫反應(yīng)性。

2.3 抗原蛋白的大量表達(dá)及包涵體純化

圖1 HEV IV型p24基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Fig. 1 Construction and identification of prokaryotic expression plasmid of genotype Ⅳ HEV P24 gene. (A)PCR products of genotype Ⅳ HEV P24 gene. M： DNA marker DL5000; 1： negative control; 2： PCR products of genotype Ⅳ HEV P24 gene. (B) Restriction map recombinant plasmid by enzyme digestion. M： DNA marker DL5000; 1： recombinant plasmid pTO-T7-P24 digested by NdeanⅠd EcoRⅠ.

圖2 HEV IV型p24基因在大腸桿菌中的表達(dá)鑒定Fig. 2 Identification of recombinant genotype ⅣHEV rP24 protein expressed in E. coli. (A) SDS-PAGE analysis of recombinant genotype Ⅳ HEV P24 protein expressed in E. coli. M： protein marker; 1： total protein expression profile of E. coli tranfected pTO-T7 with IPTG induction; 2–3： total protein expression profile of E. coli tranfected pTO-T7-P24 with IPTG induction. (B)Western blotting analysis of genotype Ⅳ HEV rP24 expressed in E. coli with 15B2. M： protein marker; 1：immunoblotting profile with 15B2 of total protein expression of E. coli tranfected pTO-T7 with IPTG induction; 2–3： immunoblotting profile with 15B2 of total protein expression of E. coli tranfected pTO-T7-P24 with IPTG induction.

超聲破碎細(xì)胞后，取100 μL細(xì)胞懸液4 ℃、12 000×g離心10 min，分別收集上清和沉淀，制備蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE，結(jié)果顯示，重組目的蛋白主要分布在沉淀，說(shuō)明目的蛋白的表達(dá)是以包涵體的形式存在 (圖 3A)。經(jīng)過(guò)Bandscan軟件分析rP24在沉淀中占到總蛋白的96%。通過(guò)用緩沖液Ⅰ (20 mmol/L Tris·HCl,5 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 7.4) 和TritonX-100緩沖液Ⅰ洗滌，去除部分雜蛋白。洗滌后的包涵體蛋白在2 mol/L、4 mol/L、8 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中均能溶解，但是rP24在2 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中溶解度較小，在4 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中溶解量很大，且rP24能形成同源二聚體，4 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中不能溶解的部分在8 mol/L尿素/緩沖液Ⅰ中可以溶解 (圖3B)，而且經(jīng)過(guò)包涵體洗滌后，去除了相當(dāng)部分雜蛋白，目的蛋白獲得了有效的純化。Western blotting結(jié)果說(shuō)明不論是單體還是二聚體都能與單克隆抗體 15B2有很強(qiáng)的反應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明rP24具有良好的免疫反應(yīng)性 (圖3C)。本研究表達(dá)的蛋白分子量約為25 kDa，二聚體蛋白的分子量約為40 kDa，小于正常天然蛋白二聚體分子量 46.5 kDa。這可能既有重組蛋白構(gòu)型問(wèn)題而導(dǎo)致相對(duì)分子量的偏差，也可能還存在通過(guò)蛋白質(zhì)的疏水作用，使蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，導(dǎo)致相同電泳條件下泳動(dòng)速度加快，從而使二聚體的相對(duì)分子量變小。

2.4 蛋白的復(fù)性、反應(yīng)活性檢測(cè)與純化

將4 mol/L尿素/bufferⅠ溶解的rP24于4 ℃的PBS中透析復(fù)性，然后將復(fù)性樣品進(jìn)行SDSPAGE。結(jié)果顯示 rP24復(fù)性后以單體和二聚體的形式存在，目的蛋白復(fù)性后，單體的量變小，二聚體的量增大。目的蛋白與抗HEV ORF2蛋白鼠源單克隆抗體8C11的Western blotting結(jié)果顯示，復(fù)性后的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性(圖4A, B)。將一抗改用HEV陽(yáng)性血清進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示聚體與血清能發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)，單體與血清的反應(yīng)能力相對(duì)弱一些，而且復(fù)性蛋白樣品在95–113 kDa之間有明顯免疫印跡反應(yīng)條帶，說(shuō)明rP24具有形成寡聚體蛋白的能力 (圖4C, D)。而復(fù)性樣品在SDS存在條件下煮沸處理后，蛋白質(zhì)的構(gòu)想發(fā)生改變，不能形成二聚體，蛋白只能以單體蛋白條帶存在。

圖3 重組IV HEV rP24蛋白包涵體純化Fig. 3 Purification of recombinant genotype Ⅳ HEV rP24 inclusion body protein. (A) SDS-PAGE analysis the expression forms of P24 protein. M： protein marker; 1： total protein expression profile of cell lysis solution with IPTG induction; 2： precipitation of cell lysis solution with IPTG induction; 3： supernatant of cell lysis solution with IPTG induction. (B) SDS-PAGE analysis dissolubility of rP24 resolved in different concentration of urea. M： protein marker; 1–3： rP24 protein dissolved in 2 mol/L, 4 mol/L, 8 mol/L urea/BufferⅠrespectively. (C) immunoblotting profile of rP24 protein with 15B2 of dissolved in 2 mol/L, 4 mol/L, 8 mol/L urea/BufferⅠrespectively. M： protein marker; 1–3： rP24 protein dissolved in 2 mol/L, 4 mol/L, 8 mol/L urea/BufferⅠrespectively.

圖4 重組P24蛋白免疫反應(yīng)活性分析Fig. 4 Immunoreacivity analysis of renatured recombinant rP24. (A) and (C) SDS-PAGE analysis of renatured rP24.M： protein marker; 1： renatured recombinant rP24 (boiled); 2： renatured rP24 (no boiled). (B) Immunoblotting profile of rP24 to 8C11. (D) Immunoblotting profile of rP24 to HEV positive serum. M： protein marker; 1： renatured rP24(boiled); 2： renatured rP24 (no boiled).

這些結(jié)果說(shuō)明rP24可以通過(guò)透析復(fù)性，蛋白復(fù)性后可以以單體、二聚體和多聚體的形式存在，其中二聚體結(jié)合最為緊密，即使在 SDS存在的不沸水浴條件下仍不被完全破壞。分析aa序列一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，p24 aa中不含有半胱氨酸，不可能形成二硫鍵，也沒(méi)有形成強(qiáng)離子鍵的 aa基礎(chǔ)；再通過(guò) DNASTAR軟件包中的Protean程序提供的Kyte-doolittle算法分析，p24 aa199-210為疏水性最強(qiáng)的區(qū)域，由于p24為病毒的衣殼蛋白，該疏水區(qū)域發(fā)生的疏水相互作用可能在形成同源二聚體作用中發(fā)揮了重要作用。

通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析，rP24一級(jí)結(jié)構(gòu)等電點(diǎn)為 5.23，適合使用陰離子交換層析進(jìn)行純化，因此采用DEAE-5PW陰離子交換層析柱進(jìn)行蛋白的純化，在rP24的離子交換層析圖譜上可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)極小穿透峰、一個(gè)主峰，另外在層析圖譜的主峰前有2個(gè)小峰。主峰的出峰時(shí)間為24 min左右，占總面積的73.75% (圖5A)，主峰前的小峰可能是不成熟的蛋白多聚體，由于不能形成正確的空間構(gòu)象，其表面所帶電荷與成熟的蛋白聚體表面所帶電荷不一樣，所以洗脫的出峰時(shí)間也不一樣。目的蛋白經(jīng)過(guò)離子交換層析純化后，蛋白聚體的均一性得到了有效的提高。

分子篩層析不僅能分離純化目的蛋白，而且還可以起到脫鹽的作用。將離子交換層析純化的蛋白上樣于分子篩層析柱 (TSK-GEL G 3 000 SW)，洗脫流速為0.5 mL/min，從rP24的凝膠層析圖譜中可以看到一個(gè)大峰和一個(gè)小峰，大峰的出峰時(shí)間為 7 min左右，占總面積的80.63%；小峰的出峰時(shí)間為5 min左右，小峰面積占總面積的12.93% (圖5B)，其中的小峰可能是復(fù)性后形成的寡聚體蛋白 (圖4C，泳道2)，其帶電性質(zhì)和二聚體相同，因而在離子交換層析中和二聚體同時(shí)被洗脫，但是在凝膠分子篩層析中，由于分子量較大而先被洗脫，收集小峰蛋白進(jìn)行Native-PAGE (圖5C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大峰蛋白的分子量介于45 kDa和98 kDa之間，為了進(jìn)一步鑒定Native blue PAGE上rP24多聚體，同時(shí)也為驗(yàn)證收集小峰蛋白為大于45 kDa的rP24多聚體，將收集的第1個(gè)峰 (保留時(shí)間為5 min) 和第2個(gè)峰 (保留時(shí)間為7.5 min) 的蛋白分別收集，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，兩個(gè)峰的蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS-PAGE，結(jié)果表明，第 1個(gè)峰和第 2個(gè)峰的蛋白在沸水浴和非沸水浴處理后，均可以形成二聚體蛋白，電泳結(jié)果通過(guò)Bandscan軟件分析顯示：純化后rP24的純度超過(guò)99%，在SDS電泳緩沖液中，單體蛋白的含量極少，主要以二聚體的形式存在 (圖6)。

2.5 rP24動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)

純化后的rP24樣品經(jīng)過(guò)過(guò)濾后，用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)量水化分子動(dòng)力學(xué)半徑，得到一個(gè)質(zhì)量貢獻(xiàn)比 100%的峰，重組 rP24的平均水化半徑為7.48 nm (圖7)，相當(dāng)于平均分子量90 kDa，rP24的分散度較小，說(shuō)明rP24經(jīng)過(guò)純化后，蛋白在PBS溶液中形成平均為四聚體的多種聚合狀態(tài)，且聚體的均一性很高。

2.6 重組rP24免疫原性

圖5 重組P24蛋白的離子交換、分子篩層析與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig. 5 Profile of ion exchange chromatogram and Molecular sieve chromatogram and native-PAGE of rP24. (A)Profile of ion exchange chromatogram of rP24. (B) Profile of molecular sieve chromatogram of rP24. (C)Native-PAGE of rP24 (M： native protein marker; 1： purified rP24).

圖 6 分子篩層析純化蛋白SDS-PAGEFig. 6 SDS-PAGE analysis of rP24 after purified by molecular sieve chromatography. M： protein marker; 1：rP24 from the first peak (no boiled); 2： rP24 from the first peak (boiled); 3： rP24 from the second peak (no boiled); 4： rP24 from the second peak (boiled).

圖7 純化重組P24分子溶液中水化半徑的檢測(cè)Fig. 7 Hydrated radius of purified recombinant p24 protein in solution.

以不同劑量的純化rP24免疫Balb/C小鼠，免疫后的不同時(shí)間從小鼠尾靜脈采血檢驗(yàn)血清的陽(yáng)轉(zhuǎn)數(shù)，其結(jié)果如表1所示，5周時(shí)，rP24 2 μg以上劑量免疫的小鼠全部陽(yáng)轉(zhuǎn)，0.5 μg免疫有6/8只小鼠陽(yáng)轉(zhuǎn)，小鼠ED50在0.6–1.0 μg之間。同時(shí)從該表中還可以看出，小鼠的免疫劑量與免疫產(chǎn)生的抗體持久性呈正相關(guān)，免疫小鼠產(chǎn)生的抗體滴度也與免疫劑量呈正相關(guān)，因此說(shuō)明表達(dá)的rP24具有良好的免疫原性。

2.7 rP24作為抗原檢測(cè)血清的特異性

HEV只有一種血清型，不同基因型的HEV抗原都能與 HEV陽(yáng)性血清反應(yīng)。本研究選用Genelab公司檢測(cè)的24份HE陽(yáng)性血清和21份HE陰性血清，用本研究表達(dá)純化的 rP24作為包被抗原包被ELISA板條后，采用間接ELISA法對(duì)24份HE陽(yáng)性血清和21份HE陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，采用北京萬(wàn)泰公司生產(chǎn)的抗 HEV-IgG診斷試劑盒作為對(duì)照，每個(gè)樣品進(jìn)行雙孔重復(fù)。

將血清進(jìn)行1∶100稀釋?zhuān)?倍標(biāo)準(zhǔn)陰性血清平均值作為陽(yáng)性血清的判斷標(biāo)準(zhǔn) (Cut off值為0.216)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism分析間接ELISA結(jié)果，結(jié)果表明：rP24對(duì)21份陰性血清的檢測(cè)結(jié)果為陰性，對(duì) 24份陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性血清的數(shù)據(jù)和陰性血清的數(shù)據(jù)之間差異極顯著性 (P<0.000 1)，雙孔數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異 (P>0.05)，該結(jié)果與北京萬(wàn)泰和Genelab公司檢測(cè)的結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明重組抗原具有良好的免疫反應(yīng)性和特異性。

表1 rP24免疫Bal b/C后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率與持久性分析Table 1 Analysis of serological conversion rate and antibody persistence of Bal b/C mice vaccinated by recombinant rP24

3 討論

HE是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在發(fā)展中國(guó)家是導(dǎo)致病毒性肝炎的最主要原因，而且時(shí)常導(dǎo)致食源性和水源性的暴發(fā)流行[12-18]。但病毒感染細(xì)胞的機(jī)制與致病機(jī)制并不清楚。Kapur等[19-21]認(rèn)為HEV進(jìn)入肝細(xì)胞是在與受體蛋白結(jié)合后，由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用完成?；颌裥秃廷蛐虷EV只能感染人，基因Ⅲ型和Ⅳ型HEV能感染人和牲畜。兩類(lèi)HEV病毒的宿主不一樣，說(shuō)明可能與細(xì)胞上的受體不同有關(guān)，并且感染機(jī)制也可能會(huì)有差異，研究感染差異的原因，將對(duì)于防控HEV跨種間感染與傳播起到一定的參考作用。

HEV ORF2編碼的病毒衣殼是病毒的最外層，因此也包含了病毒的主要中和表位。利用HEV類(lèi)病毒顆粒模擬病毒是研究病毒感染機(jī)制差異性的最佳選擇。Li等[22]利用大腸桿菌表達(dá)基因Ⅱ型HEV ORF2 aa 368-606，獲得融合蛋白p239能通過(guò)二聚體的相互作用形成一個(gè)直徑為23 nm的類(lèi)病毒顆粒。p239蛋白中具有多個(gè)中和表位，蛋白顆粒能很好的模擬HEV的空間結(jié)構(gòu)[22-23]。何水珍等[24-25]利用Ⅱ型 HEV P239蛋白吸附 HepG2 細(xì)胞的模型來(lái)模擬HEV對(duì)宿主細(xì)胞的吸附，初步確定了p239與細(xì)胞相互作用的區(qū)域位于ORF2上的aa 423–443，該段多肽可能和病毒上的細(xì)胞膜受體結(jié)合部位非?？拷蛘咧苯訁⑴c構(gòu)成了病毒與細(xì)胞特異性識(shí)別的表位。Guu等[21]和 Li等[26]表達(dá)非Ⅳ型HEV類(lèi)病毒顆粒 (aa 118-608)，可分為3個(gè)線性區(qū)域。這3個(gè)區(qū)域都含有潛在的多聚糖的結(jié)合位點(diǎn)，可能與細(xì)胞受體結(jié)合有關(guān)。

但是目前還沒(méi)有確定找到人肝細(xì)胞HEV受體，H類(lèi)和Z類(lèi)HEV感染人和動(dòng)物的差異的分子機(jī)制仍待人們?nèi)パ芯亢吞接?。由于目前還缺乏成熟的HEV細(xì)胞培養(yǎng)模型與動(dòng)物模型，不可能獲得大量的具有感染性的HEV，為了研究H類(lèi)和Z類(lèi)HEV病毒感染宿主差異的分子機(jī)制。我國(guó)流行的HEV主要為基因Ⅰ型和基因Ⅳ型，為結(jié)合HEV在我國(guó)的流行狀況，基因Ⅰ型和基因Ⅳ型HEV跨種間感染的機(jī)制，研究本研究擬在表達(dá)重組基因I型HEVORF2蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步表達(dá)Ⅳ型HEV ORF2蛋白，為研究這兩類(lèi)病毒的跨種間感染機(jī)制打下基礎(chǔ)。

本研究利用基因工程技術(shù)表達(dá)了基因Ⅳ型HEV衣殼蛋白rP24 (aa 384–606)，包含了與細(xì)胞相互作用的蛋白區(qū)域。重組蛋白通過(guò) TSK-G 3 000 SW分子篩層析柱和DEAE陰離子交換層析柱純化以后，蛋白的純度可達(dá) 99%以上，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后的蛋白在SDS緩沖液中基本上以二聚體形式存在。rP24蛋白與戊型肝炎陽(yáng)性血清及中和單克隆抗體8C11的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明重組rP24蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，能以單體、二聚體和多聚體的形式存在，說(shuō)明rP24模擬了HEV的中和表位。雖然利用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察不到 rP24形成類(lèi)病毒顆粒，但利用動(dòng)態(tài)光散色實(shí)驗(yàn)測(cè)得蛋白聚體的平均水化半徑約為7.48 nm，聚體的均一性良好。同時(shí)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)證明，rP24具有良好的免疫原性，免疫小鼠的ED50為0.6?1.0 μg。因此以上實(shí)驗(yàn)表明，rP24在PBS溶液能形成蛋白多聚體，多聚體具有一定的空間構(gòu)象，并且還包含了HEV衣殼蛋白的中和表位，因此該重組蛋白作為研究人和動(dòng)物受體的主要材料，適合進(jìn)一步研究基因Ⅰ型和基因Ⅳ型HEV感染機(jī)制的差異性，從而為預(yù)防HEV跨種間傳播的研究提供一定的參考作用。下一步我們將以此為材料進(jìn)一步研究HEV基因Ⅰ型和基因Ⅳ型HEV跨種間感染細(xì)胞差異的機(jī)制。同時(shí)，rP24也可以作為HEV血清診斷試劑的潛在關(guān)鍵原料，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

致謝：此文部分工作由湖南省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科和生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心資助。

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