張瑤，徐平，李文均，陶勇

放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

張瑤1，徐平2，李文均3，陶勇1

1 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 (北京) 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心，北京 102206 3 云南大學(xué)云南省微生物研究所 西南微生物多樣性教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，云南 昆明 650091

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，蛋白質(zhì)組學(xué)旨在闡明生物體全部或部分蛋白質(zhì)在生命活動中的作用和功能。隨著組學(xué)理論基礎(chǔ)和技術(shù)方法的逐漸成熟，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究被提高到了前所未有的高度。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為緊密，是產(chǎn)生抗生素和酶制劑的主要來源。近130多年的放線菌系統(tǒng)學(xué)研究和2001年模式菌株的全基因組測序，為功能基因組研究奠定了基礎(chǔ)。與先前的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比，放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)能更直接、更準(zhǔn)確地解釋生命現(xiàn)象，得到了快速發(fā)展，并受到研究者的高度關(guān)注。近年來放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要包括復(fù)雜形態(tài)分化和發(fā)育過程、非凡的環(huán)境適應(yīng)能力、與植物共生固氮、代謝機(jī)理及特殊功能、病原放線菌致病性和篩查天然產(chǎn)物等幾個方向，為進(jìn)一步促進(jìn)放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

放線菌，蛋白質(zhì)組學(xué)，雙向電泳，質(zhì)譜，機(jī)理

放線菌 (Actinobacteria) 是一類重要的微生物資源，目前已被廣泛應(yīng)用于工、農(nóng)、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域。放線菌作為獨(dú)特的微生物類群，不但編碼多種生物活性物質(zhì)和酶類，而且具有復(fù)雜的形態(tài)分化和發(fā)育過程，同時具有非凡的環(huán)境適應(yīng)能力[1]，廣泛存在于土壤、海洋、冰川、熱泉、鹽湖、鹽礦和動植物體等多種生境。自2001年7月完成放線菌模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)的全基因組測序后[2]，放線菌基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等相繼蓬勃興起。

截止到2013年11月，國內(nèi)外研究者完成放線菌144個屬、547個物種全基因組測序。對放線菌鏈霉菌屬Streptomyces[3-8]、弗蘭克氏菌屬Frankia[9-10]、糖多孢菌屬Saccharopolyspora[11-13]、游動放線菌屬Actinoplanes[14]、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium[15]、戈登氏菌屬Gordonia[16]和棒桿菌屬Corynebacterium[17]7個屬展開了轉(zhuǎn)錄組研究。放線菌基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究有力地推動了放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。這對詮釋放線菌的生活方式、活性物質(zhì)調(diào)控機(jī)理和人體健康的關(guān)系，研究病原放線菌在疾病發(fā)生中的作用，開發(fā)新藥等都具有重要意義。因此，放線菌組學(xué)時代正在興起，本文旨在闡述放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)新進(jìn)展。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)及技術(shù)簡介

1.1 蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué)

1994年澳大利亞Wilkins等在意大利的一次科學(xué)會議上首次提出了蛋白質(zhì)組 (Proteome)的概念，并定義為“一個基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”[18]。然而此定義并沒有考慮到蛋白質(zhì)組的組分種類多 (至少百倍于基因數(shù))、豐度跨度大、翻譯后修飾形式廣、時空特異性繁復(fù)、組分間的網(wǎng)絡(luò)性等特點(diǎn)[19]。蛋白質(zhì)組是動態(tài)的，且易受供體細(xì)胞、組織或生物體等所處環(huán)境的影響。蛋白質(zhì)組學(xué) (Proteomics) 作為研究蛋白質(zhì)組的一個工具，系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于生物體生長發(fā)育、細(xì)胞代謝、疾病發(fā)生等過程的整體而全面的認(rèn)識。

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容比較廣，主要包括組成蛋白質(zhì)組學(xué)、相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)和差異蛋白質(zhì)組學(xué)[20]。其中差異蛋白質(zhì)組學(xué)是研究熱點(diǎn)，主要通過比較分析不同生理狀態(tài)、突變株與野生株、外界環(huán)境脅迫或相近物種間蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜，實(shí)現(xiàn)對體系內(nèi)代謝調(diào)控的動態(tài)監(jiān)測，從而揭示機(jī)體自身調(diào)控關(guān)鍵因子和對內(nèi)外界環(huán)境變化產(chǎn)生反應(yīng)的本質(zhì)規(guī)律，能夠反映蛋白質(zhì)的動態(tài)本質(zhì)和功能。因此蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為分子生物學(xué)水平研究放線菌最有價值的技術(shù)手段之一。通過研究不同生長期和不同生理條件下蛋白質(zhì)組的變化，可以獲得大量生物體自身調(diào)控和功能應(yīng)答等多方面信息。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分離手段是二維凝膠電泳 (2D-E)[21-22]，這種方法能分析數(shù)千個蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中曾發(fā)揮過重大作用。但是，由于基于二維凝膠電泳的蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)耗費(fèi)人力，并且在高分子量蛋白質(zhì)、低分子量蛋白質(zhì)、極堿性蛋白質(zhì)和疏水性蛋白質(zhì)檢測方面較弱[23-24]；實(shí)驗分離的重復(fù)性不高，蛋白質(zhì)的回收率不穩(wěn)定；難以將蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化進(jìn)行定量[25]等問題，新分離方法和先進(jìn)技術(shù)被不斷地開發(fā)和改進(jìn)，如差異凝膠電泳技術(shù) (Difference gel electrophoresis，DIGE)[26-27]，同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù) (Isotope coded affinity tags, ICAT)[28]，多維液相色譜技術(shù)(Multidimensional liquid chromatography，MDLC)[29-31]，穩(wěn)定同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記技術(shù) (Stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC)[32]，多反應(yīng)監(jiān)測 (Multiple reaction monitor, MRM)[33]、同位素標(biāo)記相對和絕對定量 (Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)[34]等這些新的方法和手段，極大地豐富了蛋白質(zhì)組的測定方法，并發(fā)現(xiàn)先前未被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)功能?；谀z電泳體系的蛋白質(zhì)鑒定策略是近年來放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究常用的技術(shù)策略，主要包括2種技術(shù)：一是基于二維凝膠電泳 (2-DE) 的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，二是基于一維凝膠電泳分離-高效液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(GeLC-MS/MS) 的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略。

2 放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究

放線菌是呈菌絲狀生長，主要以孢子繁殖，是細(xì)菌中的一種特殊類型，但在培養(yǎng)特征上與真菌相似?；诙鄻踊奈锓N資源、活性產(chǎn)物和獨(dú)特的遺傳特性，放線菌在系統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域都占據(jù)了不可替代的位置，在分子生物學(xué)領(lǐng)域也得到越來越廣泛的關(guān)注。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的日臻成熟，對放線菌的研究已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止停留在物種鑒定、活性化合物分離等層次上，研究者更關(guān)注放線菌基因如何調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)，并進(jìn)而對生命活動進(jìn)行調(diào)控，揭示自然界生命的奧秘。隨著組學(xué)的逐漸成熟，分子水平的實(shí)驗技術(shù)不斷發(fā)展，放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各個方面均有較大突破，新的研究內(nèi)容和方法不斷出現(xiàn)。目前放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中于鏈霉菌屬Streptomyces、弗蘭克氏菌屬Frankia、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium、擬無枝酸菌屬Amycolatopsis、高溫單孢菌屬 Thermomonospora、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、馬杜拉放線菌屬Actinomadura、高溫雙岐菌屬Thermobifida、棒桿菌屬Corynebacterium、丙酸桿菌屬Propionibacterium和紅球菌屬Rhodococcus 11個屬。

2.1 復(fù)雜形態(tài)分化和發(fā)育過程

放線菌具有復(fù)雜的形態(tài)分化和發(fā)育過程，初期是絲狀營養(yǎng)菌絲體的生長，接下來是氣生菌絲的形成，最后分化形成孢子鏈。Jayapal等[35]采用iTRAQ標(biāo)記技術(shù)，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對S. coelicolor的生長發(fā)育過程進(jìn)行研究，對不同時間點(diǎn)的蛋白質(zhì) (7、11、14、16、22、26、34和38 h) 進(jìn)行標(biāo)記，此方法共鑒定了1 100個蛋白質(zhì)，占理論總蛋白質(zhì)的14%，其中330個蛋白質(zhì)在不同時間點(diǎn)樣品中被共同檢測到。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)已鑒定蛋白質(zhì)中80%的蛋白質(zhì)與核苷酸生物合成相關(guān)，76%的蛋白質(zhì)與核糖體亞基相關(guān)，43%的蛋白質(zhì)與次要氨基酸的合成相關(guān)，40%的蛋白質(zhì)參與中心代謝，39%的蛋白質(zhì)與能量代謝相關(guān)。細(xì)菌在生長過程中一般都要經(jīng)歷間歇性饑餓和適應(yīng)，在實(shí)驗過程中表現(xiàn)出兩階段生長期。S. coelicolor在生長過程中不僅要適應(yīng)初級代謝，同時還要激活自身形態(tài)變化和抗生素的生物合成。Novotna等[36]結(jié)合蛋白質(zhì)組技術(shù)和代謝數(shù)據(jù)，對S. coelicolor液體培養(yǎng)過程中兩階段生長的整體動態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)熱激蛋白質(zhì)并非僅僅在高溫脅迫時產(chǎn)生，在特定的代謝途徑中也被合成，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)204個蛋白質(zhì)與代謝和環(huán)境脅迫蛋白質(zhì)相關(guān)。蛋白質(zhì)聚類結(jié)果表明參與中心代謝的酶幾乎都參與糖酵解、三羧酸循環(huán)以及蛋白質(zhì)水解過程。

Manteca等[37]采用iTRAQ和LC-MS/MS技術(shù)對S. coelicolor液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的初始區(qū)域菌絲 (MI) 和多核菌絲 (MII) 的蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較，蛋白質(zhì)鑒定發(fā)現(xiàn)固液體培養(yǎng)的MI和MII中83%的蛋白質(zhì)具有較高的相似性，參與次生代謝 (放線菌素和Ⅱ型聚酮化合物生物合成，β-內(nèi)酰胺酶，差向異構(gòu)酶) 的蛋白質(zhì)在MII中上調(diào)，初級代謝 (核糖體、三羧酸循環(huán)和產(chǎn)能) 的相關(guān)蛋白質(zhì)在MI中被廣泛地檢測到，MII固體和液體培養(yǎng)時顯著差異蛋白質(zhì)與菌絲后期區(qū)域化和孢子的形成相關(guān)。Manteca等[38]采用iTRAQ標(biāo)記和LC-MS/MS技術(shù)對S. coelicolor固體培養(yǎng)不同發(fā)育階段 (12、24、72 h) 的胞質(zhì)蛋白質(zhì)、膜內(nèi)在蛋白質(zhì)和膜外在蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，共鑒定了626個蛋白質(zhì)，占理論總蛋白質(zhì)的8%，已鑒定蛋白質(zhì)中36%的蛋白質(zhì)與初級代謝相關(guān)，并且主要分布于胞質(zhì)蛋白質(zhì)和膜內(nèi)在蛋白質(zhì)中；多數(shù)脅迫、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌相關(guān)蛋白質(zhì)主要分布于膜蛋白質(zhì)中；相對于初級營養(yǎng)菌絲時期，多數(shù)次級代謝相關(guān)蛋白質(zhì)更集中于后期繁殖菌絲體形成期，如ActVA (SCO5077)、ActVA4 (SCO5079) 和羥酰輔酶A脫氫酶 (SCO5072)與放線紫素的合成，轉(zhuǎn)酮酶 (SCO6663) 參與安莎霉素的合成；而核糖體蛋白質(zhì) (SCO4653、SCO4711和SCO3124)，糖酵解和三羧酸循環(huán)酶(SCO5423、SCO2951、SCO4809和SCO4855)，氨基酸代謝相關(guān)酶 (SCO2504、SCO1773和SCO3304) 等初級代謝相關(guān)蛋白質(zhì)主要分布于初級營養(yǎng)菌絲發(fā)育時期中。結(jié)合比較生物信息學(xué)闡明初級代謝到次級代謝的轉(zhuǎn)換介于初始區(qū)域菌絲和多核菌絲之間。Jayapal等[39]采用SILIC和iTRAQ兩種技術(shù)對S. coelicolor的生長發(fā)育進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雙標(biāo)記方法更能全面地鑒定到未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和未知功能蛋白質(zhì)。

2.2 環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)

放線菌來源廣泛，生境復(fù)雜多樣，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，因此生存于極端環(huán)境中的放線菌引起了研究者的關(guān)注。Schmidta等[40]采用2-DE技術(shù)對酸性礦排水區(qū) (Acid mine drainage AMD) 分離菌株耐受重金屬鎳脅迫的機(jī)理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在鎳刺激下，鑒定到編碼合成放線菌素合成的4個蛋白質(zhì)，3個核糖體蛋白質(zhì)(S8、S9和L29)，1個假定蛋白質(zhì)Lsr2和1個tetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子spot C6。Kim等[41]對S. coelicolor不同pH脅迫所引起不同σ因子的表達(dá)和脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同pH脅迫后對次級代謝發(fā)揮重要作用的σ因子如sigH (熱激)、sigR (氧脅迫)、sigB (滲透壓脅迫)和hrdD均上調(diào)，相當(dāng)一部分熱激蛋白質(zhì)包括DnaK家族和GroEL2分子伴侶均上調(diào)，而hspR下調(diào)，氧脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)如硫氧化還原蛋白質(zhì)、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶以及和滲透壓休克相關(guān)蛋白質(zhì)如囊泡合酶均整體上調(diào)。σ因子在細(xì)菌應(yīng)對外界環(huán)境脅迫和病菌感染時發(fā)揮關(guān)鍵作用[42]。Wang等[43]采用基于2-DE的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對S. coelicolor野生株和SigN缺失突變株M145Z進(jìn)行了比較，研究發(fā)現(xiàn)SigN缺失株M145Z有24個蛋白質(zhì)發(fā)生明顯地上下調(diào)，上調(diào)的蛋白質(zhì)參與能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)、ATP結(jié)合、ppGpp的嚴(yán)格應(yīng)激反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄抗終止等，下調(diào)蛋白質(zhì)與有關(guān)抗生素的合成和分化相關(guān)。

Kinoshita等[44]在日本分離到一株新的谷氨酸鹽產(chǎn)生菌谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum，工業(yè)規(guī)模上每年帶來2萬t谷氨酸添加劑和150萬t賴氨酸飼料添加劑[45]。該菌在發(fā)酵過程中會遭受所處環(huán)境的各種壓力，如氧、滲透、pH等脅迫，而滲透壓脅迫更為顯著，也是研究熱點(diǎn)。20年來，研究者從分子水平研究了C. glutamicum高滲鹽脅迫機(jī)理，對轉(zhuǎn)運(yùn)和生物合成途徑有所了解，并發(fā)現(xiàn)一些可溶性溶質(zhì)發(fā)揮一定作用[46-47]。Franze等采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)C. glutamicum[48]可產(chǎn)生可溶性溶質(zhì)，如脯氨酸和甜菜堿來應(yīng)對環(huán)境脅迫，防止水分過度流失。Fischer等[49]對采用特異性完整膜肽富集技術(shù) (Specific integral membrane peptide level enrichment, SIMPLE) 對主要膜蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)附著蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。Washburn等[50]采用多維液相蛋白鑒定技術(shù) (Multidimensional protein identification technology, MudPIT) 對胞質(zhì)蛋白質(zhì)、膜相關(guān)蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)研究了研究，共鑒定了1 058個蛋白質(zhì)，占理論蛋白質(zhì)的35%。與對照組相比，明顯地發(fā)現(xiàn)了111個調(diào)控蛋白。這些蛋白，如用于合成脯氨酸的ProP和四氫甲基嘧啶羧酸酶在脅迫刺激下蛋白質(zhì)水平明顯地上調(diào)了20倍，合成甜菜堿和甘氨酸的BetP蛋白質(zhì)分別上調(diào)了2.7和3.0倍。意外的是滲透相關(guān)蛋白質(zhì)LcoP和 EctP沒有發(fā)生變化，而多數(shù)脂代謝和細(xì)胞壁合成蛋白質(zhì)上調(diào)，硫代謝相關(guān)蛋白質(zhì)下調(diào)；高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶MetE、O-乙酰絲氨酸 (硫醇)-裂解酶CysK、胱硫醚合成酶MetB、O-乙酰-巰基酶MetY和鐵氧還蛋白質(zhì)-亞硫酸鹽還原酶CysI在蛋白質(zhì)水平均上調(diào)。因此生物體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用在今后的研究中更加值得關(guān)注。

2.3 與植物共生固氮相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)

Frankia與非豆科植物共生形成根瘤并能固定大氣中的氮。據(jù)報道，F(xiàn)rankia可與至少200多種植物共生。Mastronunzio[51]基于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)對Frankia CcI3的孢外蛋白質(zhì)進(jìn)行了深入分析，共檢測到1 000多個共生蛋白質(zhì)。其中固氮蛋白質(zhì)最豐富，還有結(jié)節(jié)特異性分泌蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)。這為揭示Frankia 與植物的共生關(guān)系提供一定線索。Mastronunzio等[52]對不同植物共生的Frankia蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)多數(shù)蛋白質(zhì)參與能源和氮代謝，固氮酶和固氮酶鐵蛋白質(zhì)最為豐富，可能在共生中發(fā)揮重要作用。Udwary[53]結(jié)合基因組信息和蛋白質(zhì)組技術(shù)對Frankia共生主要天然產(chǎn)物合成潛力進(jìn)行了挖掘。Huang[54]對CcI3培養(yǎng)條件下和在木麻黃根瘤進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，分別鑒定到1 000多個蛋白質(zhì)，意味著在不同條件下至少25%的基因被激活，還發(fā)現(xiàn)管家功能相關(guān)蛋白質(zhì)廣泛存在。

2.4 代謝機(jī)理及特殊功能相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)

放線菌的研究是伴隨著抗生素工業(yè)的發(fā)展而來，其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣，因而具有多樣的生物學(xué)活性。一般在野生菌株中這些生物活性次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較低。為了滿足在醫(yī)藥與工農(nóng)業(yè)應(yīng)用中的需求, 需要對野生株進(jìn)行改造。因此對代謝機(jī)理和關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能研究至關(guān)重要。王玉霞[55]基于“shotgun”蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，采用2D LC-MS/MS技術(shù)分析了藤黃灰鏈霉菌Streptomyces luteogriseus產(chǎn)抗(麥拓萊霉素，Maituolaimysin) 菌株103和突變不產(chǎn)抗菌株cnnl的菌體總蛋白質(zhì)提取物，分別鑒定到726和809個蛋白質(zhì)，建立了兩個菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，并對兩個菌株所鑒定蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) (分子量、等電點(diǎn))、亞細(xì)胞定位和功能分類進(jìn)行了統(tǒng)計分析。Maréchala等[56]采用基于2-DE蛋白質(zhì)技術(shù)對抗生素低產(chǎn)菌株變鉛青鏈霉菌S. lividans野生株和相應(yīng)抗生素高產(chǎn)菌株ppk突變株進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)貯存的脂質(zhì)降解而非己糖分解代謝的突變對抗生素產(chǎn)量的影響巨大。Tiffert等[57]對S. coelicolor野生株和GlnR缺失突變株蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)50個差異蛋白質(zhì)，且多數(shù)蛋白質(zhì)都參與氨基酸的生物合成和碳代謝，表明GlnR并非單純地與氮代謝相關(guān)，而且在微生物整個代謝中發(fā)揮重要作用。Mason等[58]對藍(lán)色鏈霉菌S. cyaneus、嗜溫?zé)釂捂呔鶷hermomonospora mesophila和馬杜拉放線菌 Actinomadura sp. 的孢外蛋白質(zhì)對木質(zhì)纖維素的增溶作用進(jìn)行了研究。Gallo等[59]通過對擬無枝酸菌Amycolatopsis balhimycinachan產(chǎn)balhimycin的野生株和不產(chǎn)抗生素突變株比較，發(fā)現(xiàn)抗生素的合成始終與balhimycin(bal)生物合成基因簇特異酶、碳代謝、細(xì)胞能量和氧化還原平衡上調(diào)酶相關(guān)。Hau?mann等[60]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，采用Simple-MudPIT技術(shù)對木質(zhì)素降解紅球菌Rhodococcus jostii RHA1膜蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，對類固醇的利用機(jī)制進(jìn)行了研究。Unell等[61]對 5 ℃和28 ℃、4-氯苯酚和苯酚培養(yǎng)的氯酚節(jié)桿菌Arthrobacter chlorophenolicus蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)差異性很大。不僅如此，作者在這個工作中還鑒定了數(shù)百個未知蛋白質(zhì)，闡明了4-氯苯酚降解途徑。嗜熱裂孢菌Thermobifida fusca屬于嗜熱放線菌，一種植物細(xì)胞壁的主要降解菌，Adav等[62]采用iTRAQ和LC-MS/MS，對含纖維素、木質(zhì)素、纖維素和木質(zhì)素混合培養(yǎng)基上生長的T. fusca分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的胞外酶系統(tǒng)，包括纖維素酶的離散多酶復(fù)合物、半纖維素酶、糖苷水解酶、蛋白質(zhì)酶、過氧化物酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。當(dāng)菌株在纖維素、木質(zhì)素、纖維素和木質(zhì)素等底物上生長時，纖維素酶、半纖維素酶和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白質(zhì)上調(diào)。此外，他們還鑒定了降解木質(zhì)素DYP型過氧化物酶、新穎非血紅素過氧化物酶、過氧化氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶和超氧化物歧化酶。C. gluta micum具有產(chǎn)生谷氨酸鹽，賴氨酸等氨基酸的能力。Fr?nzel等[63]對產(chǎn)賴氨酸菌株DM1730突變株進(jìn)行了研究，共發(fā)現(xiàn)了1 107個可溶性蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)，應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)分布較廣泛，而參與細(xì)胞生長、分裂和細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)相對較少，還發(fā)現(xiàn)大量賴氨酸的合成會造成C. glutamicum氧脅迫和離子濃度受限。Li等[64]采用2-DE和 MALDI-TOF-MS技術(shù)對谷氨酸產(chǎn)生菌株C. glutamicum ATCC 14067的胞質(zhì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)166個蛋白點(diǎn)代表139種不同的蛋白質(zhì)，產(chǎn)谷氨酸菌株ATCC 14067和ATCC 13032有明顯的差異，意味著不同菌株的蛋白質(zhì)還是有其獨(dú)特之處。Barriuso等[65]對 C. glutamicum ATCC13032適應(yīng)不同pH值的胞質(zhì)蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。

沈雪玲[66]利用蛋白質(zhì)對接技術(shù) (Proteinprotein docking technology)，建立了核糖體、新生肽鏈、4.5S RNA、Ffli、FtsY、SecYEG轉(zhuǎn)運(yùn)孔道等多方相互作用的理論三維結(jié)構(gòu)模型，提出了大腸桿菌FtsY膜定位機(jī)制的假設(shè)。通過比較S. coelicolorFtsY和E. coli FtsY在關(guān)鍵區(qū)域的差異，最終提出了鏈霉菌FtsY A結(jié)構(gòu)域在膜定位中發(fā)揮不同功能的假說。利用膜蛋白質(zhì)分離和Mal-PEG標(biāo)記技術(shù)，他們分析了鏈霉菌FtsY的A結(jié)構(gòu)域膜定位功能。石宣明等[67]用蛋白質(zhì)酶K保護(hù)/高pH法制備鏈霉菌膜內(nèi)側(cè)蛋白質(zhì)組樣品，并用多維蛋白質(zhì)鑒別技術(shù)進(jìn)行分析，得到154個可能的膜內(nèi)側(cè)蛋白質(zhì) (包括膜內(nèi)在蛋白質(zhì)和膜外周蛋白質(zhì))，其中含跨膜區(qū)的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)44個，含3個以上跨膜區(qū)的膜內(nèi)在蛋白質(zhì)有23個，還鑒定了一批膜內(nèi)側(cè)蛋白質(zhì)的親水性肽段及其在膜上的拓?fù)湮恢谩amboa等[68]研究發(fā)現(xiàn)非病原性絲狀菌S. lividans產(chǎn)生的重組O-糖蛋白質(zhì)APA會隨不同培養(yǎng)條件而變化。Bradshaw等[69]采用無標(biāo)記LC-MS/MS對S. coelicolor的擬核系統(tǒng)地檢測新穎的擬核相關(guān)蛋白質(zhì)，基于高分度和預(yù)測的DNA結(jié)合能力，共鑒定了24個擬核相關(guān)蛋白質(zhì)。

2.5 病原放線菌致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)

少數(shù)放線菌是致病菌，會引起人和動植物病害，如棒桿菌、分枝桿菌和丙酸桿菌等，部分棒桿菌會引起小反芻動物干酪樣淋巴結(jié)炎慢性疾病；部分丙酸桿菌駐留在毛囊皮脂腺內(nèi)，會引起痤瘡，多數(shù)分枝桿菌為病原菌，會引起反芻動物衰弱慢性腸炎、肺結(jié)核和麻風(fēng)病等疾病。組學(xué)從開始的描述性研究逐步深入到機(jī)理性認(rèn)識，揭示了致病菌重要生理和病理特征，如持留和休眠的分子機(jī)理。這為認(rèn)識致病菌系統(tǒng)進(jìn)化、發(fā)現(xiàn)更好的診斷標(biāo)記、藥物靶標(biāo)和候選疫苗組分提供了基礎(chǔ)。Malen等[70]使用了無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，比較了結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv和毒性較弱菌株H37Ra的差異分泌蛋白質(zhì)，旨在探索這些分泌蛋白質(zhì)在宿主組織降解和誘發(fā)炎癥方面的作用機(jī)制。為了解M. tuberculosis特有的生物合成和分泌過程，Wolfe[71]對M. tuberculosis的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。Lini等[72]發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)分枝桿菌M. leprae小熱激蛋白質(zhì) (sHsp18) 可防止限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和NdeⅠ熱失活。Bell等[73]通過分離亞細(xì)胞組分并富集細(xì)胞膜組分，共鑒定了M. tuberculosis細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、裂解物和分泌產(chǎn)物，共得到1 051個蛋白質(zhì)。Rosenkrands等[74]采用代謝標(biāo)記，對M. tuberculosis低氧脅迫蛋白質(zhì)組 (包括細(xì)胞組分和分泌蛋白質(zhì)) 進(jìn)行了鑒定。Betts等[75]采用2-DE技術(shù)對M. tuberculosis H37Rv和CDC 1551蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較，共發(fā)現(xiàn)約有1 750個蛋白質(zhì)有差異。Starck等[76]對M. tuberculosis在好氧和厭氧條件下的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了50個差異蛋白質(zhì)，且結(jié)核菌休眠誘導(dǎo)約1%基因表達(dá)。Cho等[77]于2012年對美國食品藥品局標(biāo)準(zhǔn)品PPD-S2進(jìn)行分析，揭示了已使用60多年的用于診斷潛伏結(jié)核病和體外免疫檢測感染結(jié)核菌的純化蛋白質(zhì)衍生物 (Purified protein derivative, PPD) 的蛋白質(zhì)組成。

假結(jié)核棒桿菌Corynebacterium pseudotuberculosis會引發(fā)山羊患干酪樣淋巴結(jié)炎。Seyffert等[78]采用2-DE免疫印跡法對C. pseudotub erculosis的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，共發(fā)現(xiàn)了23個免疫反應(yīng)點(diǎn)，對其中6個蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定，其中細(xì)菌復(fù)蘇因子 (RpfB)、 NlpC/P60、假定外排蛋白質(zhì)和表層蛋白質(zhì) (Spl A) 等4個蛋白質(zhì)在其他細(xì)菌中已有報道，而假定分泌蛋白質(zhì) (spot2) 雖與已報道的其他放線菌蛋白質(zhì)序列有一定的相似性，但目前還未被詳細(xì)描述，另一個蛋白質(zhì) (spot6) 歸屬于金屬蛋白質(zhì)酶家族，廣泛存在于綠膿假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、梭狀芽胞桿菌Clostridium spp.、炭疽芽胞桿菌Bacillus anthracis和單核細(xì)胞增生利斯特菌Listeria monocytogenes等病原細(xì)菌中。瘡皰丙酸桿菌Propionibacterium acnes可與人體皮膚共生，引發(fā)一系列皮膚病。Holland等[79]采用2-DE和 MALDI-MS對P. acnes (5個物種，4個不同類型)的分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，共得到239個蛋白質(zhì)。其中，菌株266、KPA、P6、329和487分別得到64、63、54、30和28個蛋白質(zhì)點(diǎn)。進(jìn)一步蛋白質(zhì)鑒定發(fā)現(xiàn)其中有20個蛋白質(zhì)在絕大多數(shù)菌株中都能被檢測到，且這些蛋白質(zhì)具有多樣的生物降解活性，包括糖苷水解酶類、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、溶菌酶、溶血磷脂酶、三?；视椭久负推渌鞍酌?。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了其他分泌的因素，包括克里斯蒂-阿特金斯-蒙克-彼得森 (CAMP) 因子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 和一些假定蛋白質(zhì)是P. acnes特有蛋白質(zhì)。

這些蛋白質(zhì)組學(xué)在探索病原放線菌分子機(jī)制研究方面的嘗試及其結(jié)果將為發(fā)病機(jī)理的研究和治療靶點(diǎn)的尋找提供有益的線索，也為將來微生物疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供經(jīng)驗。

2.6 天然產(chǎn)物篩查相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)

具有抗癌和抗真菌等生理活性的多數(shù)抗生素是由非核糖體肽合成酶 (NRPSs) 和聚酮合酶 (PKSs) 合成的[80]。盡管基因組研究顯示許多微生物具有合成這些非核糖體肽 (NRPS) 和聚酮類化合物 (PKS) 的巨大潛力，但很難預(yù)測這些天然產(chǎn)物產(chǎn)生的可能性、培養(yǎng)條件，也難于闡明其合成機(jī)理[81]。Bumpus等[82]借助NRPS和PKS的片段大和它們共同輔因子的獨(dú)特標(biāo)記性離子，首次提出次級代謝產(chǎn)物的蛋白質(zhì)組學(xué)調(diào)查技術(shù) (Proteomic Investigation of Secondary Metabolism，PrISM)，檢測NRPS和PKS基因簇的表達(dá)情況。此方法在檢測Bacillus和Streptomyces等已知NRPS/PKS系統(tǒng)時顯示了良好的檢測效果。當(dāng)對環(huán)境中新分離到的22株未知活性菌株去篩查時，發(fā)現(xiàn)了雙效菌素生物合成基因簇，同時還發(fā)現(xiàn)一個NRPS基因簇編碼一個新的7殘基脂肽。這種“蛋白質(zhì)至上”策略可為研究者提供一個高效檢測產(chǎn)生新型天然產(chǎn)物基因簇表達(dá)的方法。2012年Chen等[83]也采用改進(jìn)的PrISM方法，對26株未測序放線菌針對性地篩查NRPSs和PKSs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)6株菌株中含有10個NRPS/ PKS基因簇。

PrISM蛋白質(zhì)組學(xué)方法可用于發(fā)現(xiàn)新的生物合成途徑、探測新的生物合成轉(zhuǎn)換、鑒定新的天然產(chǎn)物，并可揭示基因簇和代謝產(chǎn)物的相關(guān)性。因此，也可應(yīng)用于其他微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。

3 展望

20世紀(jì)生物學(xué)經(jīng)歷了由表及里、宏觀到微觀、描述性到定量分析的發(fā)展歷程。人們對生物體的認(rèn)識也逐步由表型深入到分子層次。生物體是一個非常復(fù)雜的系統(tǒng)，唯有通過各種調(diào)控機(jī)理、合成途徑和動態(tài)網(wǎng)絡(luò)的整體研究才能全面系統(tǒng)地揭示復(fù)雜的生命現(xiàn)象。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為放線菌的研究提供了新的思路和手段，特別是其與多種質(zhì)譜法、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生物信息學(xué)等的融合可更好地應(yīng)用于放線菌蛋白質(zhì)研究中。

伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)理論和技術(shù)的不斷進(jìn)步和完善，放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)已取得了巨大的進(jìn)展，但與其他生物如大腸桿菌、酵母、果蠅及小鼠相比，放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)相對滯后。具體表現(xiàn)在：1) 目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)為定量蛋白質(zhì)組學(xué)，而在放線菌相關(guān)的研究中目前還多使用2-DE方法，技術(shù)相對落后，方法、策略上的創(chuàng)新較少。因此在較好的雜志中很少見到放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究的“身影”。2) 研究對象主要集中于放線菌模式菌株S. coelico lor，而對其他稀有放線菌的研究較少，且不深入。但對一些生命禁區(qū)發(fā)現(xiàn)的放線菌特殊類群進(jìn)行研究，可能會進(jìn)一步解釋生物進(jìn)化和生命起源。3) 研究不夠系統(tǒng)，重金屬脅迫方面，只研究了鎳脅迫，而其他重金屬影響卻沒有相關(guān)研究。在重金屬耐受機(jī)理探索方面也僅僅停留在蛋白質(zhì)點(diǎn)的變化，缺乏深入研究。4) 蛋白質(zhì)的功能研究多數(shù)是基于生物信息學(xué)歸類，相應(yīng)的功能驗證實(shí)驗較缺乏。5) 多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究是基于比較蛋白質(zhì)組學(xué)、差異蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組相結(jié)合而展開，而翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)報道幾乎沒有。Hesketh等[84]采用2-DE和MALDI-TOF技術(shù)檢測到2002年公布的S. coelicolor所公布的理論蛋白質(zhì)的10%，并發(fā)現(xiàn)平均每個基因均能檢測到1.2個蛋白質(zhì)，意味著還存在著廣泛地轉(zhuǎn)錄或翻譯后修飾現(xiàn)象。質(zhì)譜研究也證明在放線菌中存在N-乙?；?、腺苷酰化、蛋白質(zhì)酶解加工等現(xiàn)象。因此對放線菌此方面的研究可能更好地揭示細(xì)胞周期調(diào)控和信號傳導(dǎo)等眾多生命活動的分子機(jī)制。

極端微生物 (Extremophiles) 一詞最早由Mcelory于1974年提出，是指生長在生命禁區(qū)極端環(huán)境中的微生物類群，由于其特殊的生理生化和遺傳特性，引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。地球上存在著多種鹽環(huán)境，有自然形成的，如死海、美國大鹽湖等水域環(huán)境以及鹽山、干鹽湖、咸水灘等鹽土環(huán)境；還有人工形成的，如鹽場、鹽池、鹽腌制食品等。在這些鹽環(huán)境中，生活著多樣性豐富的微生物, 它們行使著物質(zhì)循環(huán)的功能。這些微生物在長期進(jìn)化過程中，形成了一些獨(dú)特的細(xì)胞組分，同時通過其特有的調(diào)控機(jī)理來適應(yīng)鹽環(huán)境，從而成為鹽生境中的主角。

目前包括本研究團(tuán)隊在內(nèi)的我國很多學(xué)者已陸續(xù)對新疆、西藏、內(nèi)蒙古、云南鹽礦等地開展了嗜鹽菌資源的研究[85-88]，發(fā)現(xiàn)放線菌中的擬諾卡氏菌Nocardiopsis是高鹽環(huán)境分布較為廣泛的類群，屬于放線菌群落中的優(yōu)勢菌。我們推測Nocardiopsis對高鹽特殊生境的適應(yīng)性可能是長期自然選擇的結(jié)果。國內(nèi)外目前對Nocardiopsis的研究主要集中于新物種的分離鑒定、活性化合物的分離、物種基因組分析等，但對其復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理了解甚少。Li等[89]對17株Nocardiopsis菌株全基因組的比較為進(jìn)一步從蛋白組水平認(rèn)識其嗜鹽分子機(jī)制提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。對Nocardiopsis鹽環(huán)境適應(yīng)機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，不僅為放線菌鹽環(huán)境適應(yīng)性研究打開大門，而且可為利用這些微生物特殊的生理適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行極端環(huán)境的改造提供線索。

放線菌最為熟知的特征是具有非凡的次級代謝產(chǎn)物編碼能力。已知的微生物生物活性化合物中有超過一半以上都是由放線菌產(chǎn)生的。多種來源于放線菌的包括抗生素在內(nèi)的生理活性物質(zhì)在保護(hù)人類健康、防治農(nóng)業(yè)病蟲害和保護(hù)環(huán)境等方面發(fā)揮著重要的作用。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究，放線菌中廣泛存在的次級代謝產(chǎn)物基因資源還可能被繼續(xù)挖掘和利用，因而具有重要的意義。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

《生物工程學(xué)報》入選“2013年中國國際影響力優(yōu)秀學(xué)術(shù)期刊”

據(jù)2013年12月30日《中國新聞出版報》消息，“2013中國最具國際影響力學(xué)術(shù)期刊”、“2013中國國際影響力優(yōu)秀學(xué)術(shù)期刊”遴選工作已由中國學(xué)術(shù)期刊（光盤版）電子雜志社、清華大學(xué)圖書館、中國學(xué)術(shù)文獻(xiàn)國際評價研究中心完成并發(fā)布，《生物工程學(xué)報》繼入選“2012中國國際影響力優(yōu)秀學(xué)術(shù)期刊”后，再次入選“2013中國國際影響力優(yōu)秀學(xué)術(shù)期刊”。

“2013中國國際影響力優(yōu)秀學(xué)術(shù)期刊”的遴選目的旨在從國際角度全面揭示，力求客觀、全面、系統(tǒng)地反映我國學(xué)術(shù)期刊的學(xué)術(shù)影響力。評價中心采用的“期刊國際影響力指數(shù)”分科技、人文社科兩個序列對我國學(xué)術(shù)期刊進(jìn)行了排序，由70位期刊評價研究專家評審，根據(jù)指數(shù)高低分別按TOP5%選出“2013中國最具國際影響力學(xué)術(shù)期刊”，按TOP5%?10%選出“2013中國國際影響力優(yōu)秀學(xué)術(shù)期刊”，科技類各175種，社科類各56種。

相關(guān)鏈接：http://piccache.cnki.net/kns/images2009/other/gonggao/2013CAJZPDF/01.pdf

Advances in actinobacterial proteomics

Yao Zhang1, Ping Xu2, Wenjun Li3, and Yong Tao1
1 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Science, Beijing 100101, China 2 State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Engineering Research Center for Protein Drugs, National Center for Protein Sciences, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China 3 Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China, Ministry of Education, Yunnan Institute of Microbiology, Yunnan University, Kunming 650091, Yunnan, China

Protein is the executor of physiological function, and direct embodiment of the life phenomena. Proteomics aims to systematically clarify all or parts of proteins’ role and function in life movement. In post genome era, proteomics began to play more important role in life science field. Actinobacteria are closely linked to human production and life, which have produced many clinically important secondary metabolites, including antibiotics, antitumorals and enzymes. Actinobacterial systematics and its model organism Streptomyces coelicolor in 2001 genome sequence laid the foundation for further functional genomic studies. Actinobacterial proteomics was more directly and exactly to interpret the activity of life than genomics and transcriptomics, which grew much faster and

so much attention from scientists in the near years. Complex morphological differention, stronge environment adaptiveness, nitrogen-fixing capacity, metabolic mechanism, pathogenicity and natural produces’ discovery were systematically reviewed in this study, which was expected to be the basis for promoting Actinobacterial proteomics study in the near future.

actinobacteria, proteomics, 2-dimensional electrophoresis, mass spectrum, mechanism

December 23, 2013; Accepted: January 13, 2014

Ping Xu. Tel: +86-10-83147777-1314; Fax: +86-10-80705155; E-mail: xupingghy@gmail.com Wenjun Li. Tel/Fax: +86-871-65033335; E-mail: wjli@ynu.edu.cn; liact@hotmail.com

張瑤, 徐平, 李文均, 等. 放線菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(7): 1044?1058.

Zhang Y, Xu P, Li WJ, et al. Advances in actinobacterial proteomics. Chin J Biotech, 2014, 30(7): 1044?1058.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31270054, 31070673, 31170780), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB910600).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31270054, 31070673, 31170780)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB910600) 資助。