楊倩，鄭璞，于芳，劉偉，孫志浩

嗜乙酰乙酸棒桿菌Corynebacterium acetoacidophilum-Δldh缺氧條件下代謝葡萄糖途徑的變化

楊倩，鄭璞，于芳，劉偉，孫志浩

江南大學生物工程學院 教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122

缺氧條件下嗜乙酰乙酸棒桿菌Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870生長停滯，卻能夠代謝葡萄糖產生以乳酸和琥珀酸為主的有機酸。采用以sacB基因為反向篩選標記的同源重組染色體基因敲除系統(tǒng)，敲除嗜乙酰乙酸棒桿菌的乳酸脫氫酶基因，得到的Δldh菌株CCTCC NO. M20122041在缺氧條件下不產乳酸，葡萄糖消耗速率降低了29.3%，產琥珀酸和乙酸濃度分別提高45.6%和182%；NADH/NAD+值小于1 (約0.7)；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和乙酸激酶的比酶活分別提高84%和12倍。說明嗜乙酰乙酸棒桿菌中乳酸合成途徑的阻斷驅使了琥珀酸和乙酸代謝途徑加強，推測加強NADH供給和阻斷乙酸產生支路可能是提高C. acetoacidophilum菌株產琥珀酸產量的有效途徑。

嗜乙酰乙酸棒桿菌，ldhA-敲除菌，缺氧，琥珀酸，代謝途徑

谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum是微生物發(fā)酵生產氨基酸工業(yè)的經典菌種，近年來通過代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產生物基化學品，成為研究熱點[1]。如以C. glutamicum R為出發(fā)菌株，通過同時過表達甲基乙二醛合酶基因 (mgs) 和醛酮還原酶基因 (CgR-2242)，構建了生產丙二醇菌C. glutamicum RP3[2]；通過敲除乳酸脫氫酶基因 (ldh)、木酮糖激酶基因(xylB) 和果糖磷酸轉移酶基因 (ptsF)，并同時過表達木糖還原酶基因 (CtXR)，構建了生產木糖醇菌C. glutamicum CtXR7[3]；從模式菌C. glutamicum ATCC13032出發(fā)，用L-賴氨酸脫羧酶基因 (cadA) 取代L-高絲氨酸脫氫酶基因(hom)，構建生產二元胺尸胺菌C. glutamicum TM45[4]；敲除精氨酸阻遏蛋白 (ArgR) 基因和鳥氨酸阻遏蛋白 (ArgF) 基因，并同時過表達鳥氨酸脫羧酶基因 (sprC)，構建C. glutamicum ORN1(pVWEx1-speC)生產腐胺[5]；過表達谷氨酸脫羧酶基因 (gadB)，構建C. glutamicum GAD生產丁氨酸[6]。在利用谷氨酸棒桿菌生產有機酸方面，Dominguez等報道了在氧氣供應不足條件下，谷氨酸棒桿菌能產生少量有機酸[7]。Inui等發(fā)現(xiàn)缺氧條件下谷氨酸棒桿菌不生長，但是可以代謝葡萄糖產生以乳酸和琥珀酸為主的有機酸，并分析了缺氧條件下谷氨酸棒桿菌的全局代謝情況[8-9]。隨后Wendisch等則分析大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌產有機酸和氨基酸的代謝工程策略，認為通過基因改造的谷氨酸棒桿菌將會成為一個有前景的產有機酸的生物催化劑[10]。2008年Okino等以C. glutamicum R為出發(fā)菌構建了C. glutamicumΔldhA-pCRA717，在高菌體濃度 (50 g DCW/L) 的條件下，分批補加葡萄糖和碳酸氫鈉，琥珀酸產量達到目前報道的最高產量，46 h產146 g/L[11]。2012年Litsanov等研究以C. glutamicum ATCC 13032為出發(fā)菌，構建C. glutamicum BOL-3，該菌敲除了合成乙酸的多種酶的基因，并過表達3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gapA)，可產琥珀酸134 g/L，摩爾轉化率為1.67[12]。說明了谷氨酸棒桿菌在生產生物基琥珀酸上具有很大的應用潛力。

嗜乙酰乙酸棒桿菌Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870也屬于產谷氨酸棒桿菌[13]，本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)：其在缺氧條件下具有一定的積累琥珀酸優(yōu)勢，其中琥珀酸和乳酸積累的最高濃度分別為22.5 g/L與60 g/L[14]。為消除主要的副產物——乳酸，提高琥珀酸的產率，本文報道了以C. acetoacidophilum ATCC13870為出發(fā)菌株，構建敲除了乳酸脫氫酶基因的菌株C. acetoacidophilum-Δldh CCTCC NO. M20122041[15]，并考察敲除乳酸脫氫酶基因對菌體生長、生理特性以及代謝途徑的影響，以期為實現(xiàn)高效生產琥珀酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

菌株嗜乙酰乙酸棒桿菌C. acetoacidophilum ATCC13870，由江南大學生物催化研究室保藏。菌株E. coli JM109購于生工生物工程(上海)股份有限公司。菌株C. acetoacidophilum-Δldh由本研究構建。質粒pMD19-T、pMD18-T購于TaKaRa公司。用于谷氨酸棒桿菌基因組的克隆載體pK19mobsacB由中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所鄧小昭教授惠贈。ldh基因敲除質粒pK19mobsacB-Δldh由本研究構建。

1.1.2 試劑和溶液

T4 DNA連接酶、限制性內切酶Hind Ⅲ、堿性磷酸酶購自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、2×PCR Mix 反應液購自廣州東盛生物科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒購自捷瑞生物工程 (上海) 有限公司；質粒DNA少量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒和瓊脂糖購自生工生物工程 (上海) 有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

感受態(tài)培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基，甘氨酸30 g/L，Tween80 1 g/L。

活化培養(yǎng)基 (LBHIS)：酵母粉2.5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，腦心浸液18.5 g/L，山梨醇91 g/L。

種子培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中添加5 g/L葡萄糖。

菌體培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，F(xiàn)eSO45 mg/L，硫胺素0.2 mg/L，尿素2.5 g/L，玉米漿10 g/L，生物素0.2 mg/L。

轉化培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO46 mg/L，MnSO44.2 mg/L，生物素0.2 mg/L，硫胺素0.2 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 C. acetoacidophilum-Δldh的構建

引物設計：根據乳酸脫氫酶基因ldh在谷氨酸棒桿菌基因組 (GenBank Accession No. Nc_006958.1) 中上下游的DNA序列，設計上游引物1、2，下游引物3、4。引物序列見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

基因ldh上下游DNA序列的擴增：以C. acetoacidophilum ATCC13870基因組為模板，引物1、2用于擴增基因ldh的上游序列，引物3、4用于擴增基因ldh的下游序列。上下游序列PCR反應條件相同：95 ℃變性50 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)。反應結束后，1%瓊脂糖電泳檢測，膠回收純化試劑盒回收PCR產物。

基因ldh上下游DNA序列的拼接與測序:以基因的上游和下游序列為模板，引物1、4為正向和反向引物，overlap PCR拼接反應條件：95 ℃變性50 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)。膠回收純化試劑盒回收拼接產物，拼接產物連接到pMD18-T載體中，在16 ℃下連接過夜，轉化E. coli JM109。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，陽性克隆提取質粒酶切驗證，測序驗證。

基因敲除載體pK19mobsacB-Δldh的構建：將上述PCR產物和質粒pK19mobsacB分別進行Hind Ⅲ單酶切，1%的瓊脂糖電泳，分別回收酶切的PCR產物和硅膠柱純化質粒片段，酶切的PCR產物和去磷酸化的質粒片段進行連接，16 ℃條件下連接過夜，轉化到E. coli JM109。挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，陽性克隆進一步酶切驗證。構建好的基因敲除載體命名為pK19mobsacB-Δldh。

基因敲除載體轉化C. acetoacidophilum ATCC13870: 將pK19mobsacB-Δldh于1.8 kV、5 ms電擊條件下，電轉化到C. acetoacidophilum ATCC13870感受態(tài)細胞，通過卡那抗性及蔗糖選擇壓力篩選，得到敲除了乳酸脫氫酶基因的C. acetoacidophilum-Δldh。

1.2.2 C. acetoacidophilum-Δldh產琥珀酸的方法

C. acetoacidophilum種子于30 ℃、200 r/min下耗氧培養(yǎng)24 h，然后以5% (V/V) 的接種量接于菌體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min下耗氧培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)好的菌體離心富集，以20 g/L (干重)的菌體濃度懸浮于轉化培養(yǎng)基中30 ℃、200 r/min下恒溫振蕩。

1.2.3 有機酸及葡萄糖的測定方法

葡萄糖及有機酸的測定參照文獻[16]。

1.2.4 相關酶活測定方法

菌體粗酶液的制備: 將轉化過程中的菌體離心去上清液，用緩沖液洗滌2次，緩沖液包括 (100 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1 mmol/L MgCl2, 2 mmol/L DTT)。加50 μL 100 g/L的溶菌酶，冰浴下超聲破碎25 min，4 ℃、8 000 r/min下離心25 min。取上清液即為粗酶液。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)、蘋果酸脫氫酶 (MDH)、富馬酸酶 (FUM) 酶活測定方法參考文獻[17]，乳酸脫氫酶 (LDH) 酶活測定方法參考文獻[18]，乙酸激酶 (AK) 酶活測定方法參考文獻[19]。

酶活測定的反應試劑混合后，加入粗酶液啟動反應，反應體系為1 mL，在酶標儀(BioTek-Power Wave XS2，Gene公司) 上測定相應的吸光值，PEPC、MDH、LDH、AK測定OD340，F(xiàn)UM測定OD250。

酶活單位定義為在30 ℃下，每分鐘使1 nmol底物轉化為產物的酶量為1 U。粗酶液中蛋白量的測定通過Bradford法測定，標準物為牛血清白蛋白。比酶活為每毫克蛋白的酶活單位，單位為U/mg。

1.2.5 NADH/NAD+的測定方法

NADH/NAD+的測定方法參照文獻[20]。

2 結果與分析

2.1 基因敲除菌C. acetoacidophilum-Δldh的鑒定

按照方法1.2.1獲得了乳酸脫氫酶基因敲除菌，以出發(fā)菌株ATCC13870為對照，用PCR鑒定法以引物1、4進行驗證，鑒定電泳圖譜見圖1。用同樣兩條引物擴增，出發(fā)菌株ATCC13870的PCR擴增產物為1 500 bp，而敲除菌C. acetoacidophilum-Δldh的PCR產物僅為1 000 bp，兩個片段大小區(qū)別明顯，C. acetoacidophilum-Δldh染色體上被刪除的基因序列長度大致為500 bp，表明ldh基因已經被成功敲除。

2.2 ldh基因的敲除對C. acetoacidophilum生長的影響

出發(fā)菌ATCC13870和C. acetoacidophilum-Δldh在搖瓶上的生長曲線如圖2所示，兩者生長良好，生長趨勢基本相同，10 h進入穩(wěn)定期，之后菌體緩慢增長。但是C. acetoacidophilum-Δldh與ATCC13870相比在生物量上稍有降低，10 h后C. acetoacidophilum-Δldh OD660達到34，出發(fā)菌株此時OD660達到36。說明ldh基因的敲除對C. acetoacidophilum生長的影響不顯著。

圖1 C. acetoacidophilum-Δldh的PCR鑒定電泳圖譜Fig. 1 PCR indentification of C. acetoacidophilum-Δldh. M: λDNA/ Hind III marker; 1: C. acetoacidophilum ATCC13870 PCR product; 2: C. acetoacidophilum-Δldh PCR product.

2.3 C. acetoacidophilum-Δldh與ATCC13870對葡萄糖的代謝產物

將培養(yǎng)相同時間的C. acetoacidophilum-Δldh與ATCC13870分別離心，進行有機酸轉化，其中用于轉化的菌體濃度為26.5 g CDW/L，初始葡萄糖濃度為90 g/L，碳酸氫鈉濃度為33.6 g/L，轉化過程曲線見圖3。轉化30 h，C. acetoacidophilum-Δldh殘留葡萄糖濃度為20.5 g/L，琥珀酸濃度為60.5 g/L，而ATCC13870的殘?zhí)?.03 g/L，琥珀酸38.4 g/L，C. acetoacidophilum敲除乳酸脫氫酶基因后，產琥珀酸能力明顯增強。

圖2 ATCC13870與C. acetoacidophilum-Δldh的生長曲線Fig. 2 Cell growth profiles of ATCC13870 and C. acetoacidophilum-Δldh.

比較兩株菌轉化12 h的代謝產物及過程參數見表2，與ATCC13870相比，C. acetoacidophilum-Δldh不產乳酸，而琥珀酸、乙酸質量濃度分別增加了45.6%和182%，并且有部分的富馬酸產生。理論上1 mol葡萄糖在碳酸氫鹽充足的情況下可生成2 mol的琥珀酸[21]，這個過程中需要4 mol的NADH的參與，而1 mol葡萄糖完全酵解可產生2 mol的NADH，因此糖酵解代謝過程中產生的NADH不能滿足琥珀酸生成所需要NADH的量，而從丙酮酸生成乙酸的過程中也有NADH的產生，因此這可能是代謝產物中乙酸產量增加的原因。C. acetoacidophilum-Δldh另一特點是葡萄糖消耗速率有所下降，比原始菌株降低了29.3%，但糖酸轉化率提高了109%，產琥珀酸平均速率增加了65%，說明乳酸脫氫酶基因的敲除使C. acetoacidophilum的代謝途徑發(fā)生了變化，乳酸途徑的消除使得琥珀酸和乙酸途徑加強。

圖3 ATCC1380與C. acetoacidophilum-Δldh耗糖和產酸曲線Fig. 3 Glucose consumption and the succinic acid production of ATCC13870 and C. acetoacidophilum-Δldh. □: ATCC13870 succinic acid concentration;○: C. acetoacidophilum-Δldh succinic acid concentration; ■: ATCC13870 glucose concentration;●: C. acetoacidophilum-Δldh glucose concentration.

2.4 C. acetoacidophilum-Δldh與ATCC13870在缺氧條件下NADH/NAD+比值的變化

在缺氧條件下NADH的氧化完全依賴于有機酸的生成[22]，因此缺氧條件下菌體轉化葡萄糖產琥珀酸的過程中NADH起著不可或缺的作用。表3表明ATCC13870和Δldh菌株在缺氧條件下代謝葡萄糖過程中NADH/NAD+的情況。Δldh菌株的NADH/NAD+水平明顯低于原始菌株，這可能是由于琥珀酸的生成需要的還原當量NADH多于乳酸生成途徑中的消耗量，因此生成琥珀酸較多的體系中，NADH/NAD+水平較低。Δldh菌不產乳酸，琥珀酸的產量是出發(fā)菌株的2倍左右，而原始菌株產乳酸及琥珀酸的比率接近1∶1，故C. acetoacidophilum-Δldh在缺氧產酸的過程中NADH/NAD+水平較低。同時，NADH與NAD+的不平衡也會影響到糖酵解代謝，可能造成了Δldh菌的葡萄糖消耗速率下降。

表2 缺氧轉化12 h代謝產物及轉化過程參數的比較Table 2 Comparison of metabolic products and conversion parameters at 12 h oxygen deprivation culture

表3 兩種菌株缺氧轉化10 h NADH/NAD+比值Table 3 Rate of NADH/NAD+of the two different strains at 10 h oxygen deprivation culture

2.5 C. acetoacidophilum-Δldh與ATCC13870在缺氧條件下葡萄糖代謝關鍵酶活性的比較

缺氧條件下嗜乙酰乙酸棒桿菌代謝以產有機酸為主，葡萄糖經糖酵解生成磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸，從丙酮酸出發(fā)分為3條途徑，一條經乳酸脫氫酶催化在NADH的參與下生成乳酸，一條經羧化酶催化在碳酸氫鹽的參與下生成四碳化合物草酰乙酸，從而進入TCA循化的還原臂一側生成琥珀酸，一條經丙酮酸脫氫酶復合體催化在NAD+的參與下生成乙酰輔酶A，進而再經過磷酸轉乙酰激酶，乙酸激酶的催化生成乙酸 (圖4)。缺氧條件下轉化產酸過程中測定乙醛酸途徑的關鍵酶異檸檬酸裂合酶(ICL) 酶活，結果出發(fā)菌株與敲除菌株均未檢測出該酶活。并且在轉化過程中分別加入氟乙酸及丙二酸，加入氟乙酸的轉化體系產琥珀酸正常，加入丙二酸的轉化體系幾乎不產琥珀酸。由于丙二酸是TCA還原臂中琥珀酸脫氫酶的強抑制劑，而氟乙酸是檸檬酸合酶的抑制劑，可以說明缺氧條件下嗜乙酰乙酸棒桿菌不能通過檸檬酸循環(huán)或乙醛酸循環(huán)途徑生成琥珀酸。從對代謝途徑中關鍵酶活性的分析，反映阻斷了乳酸產生支路后，代謝流轉向了琥珀酸和乙酸的產生途徑。如圖5所示，C. acetoacidophilum-Δldh沒有表現(xiàn)出LDH活性，PEPC活性提高了84%，AK活性提高了12倍，F(xiàn)UM活性提高了17.3%，MDH酶活提高了17.4%。PEPC、FUM和MDH活性的增加表明四碳途徑的加強。在C. acetoacidophilum中，丙酮酸羧化酶 (PC) 的酶活測定數據不穩(wěn)定 (數據未列出)，這與文獻[9,23-25]報道的一致，Inui等[9]也曾證實PEPC是谷氨酸棒桿菌中合成草酰乙酸的關鍵酶。而AK活性的顯著增加，加強了乙酰輔酶A的代謝，從而強化了乙酸途徑。Joeri等[26]指出：副產物乙酸的產生可以補給用于琥珀酸生成的還原當量，因此可推測，AK活性以及乙酸產量的增加可能與Δldh菌株在缺氧產酸過程中NADH與NAD+不平衡 (表3) 有關。

3 結論

本文采用以sacB基因為反向篩選標記的同源重組染色體基因敲除系統(tǒng)，敲除嗜乙酰乙酸棒桿菌的乳酸脫氫酶基因，構建C. acetoacidophilum-Δldh菌株。生長培養(yǎng)表明乳酸脫氫酶基因的敲除不會對C. acetoacidophilum菌體的生長造成很大的影響。Δldh菌株不產乳酸，說明C. acetoacidophilum中乳酸脫氫酶并沒有其他的同工酶存在。在缺氧條件下，葡萄糖對琥珀酸的轉化率提高了109%，產琥珀酸平均速率增加了65%，產琥珀酸和乙酸濃度分別提高了45.6%和182%，PEPC活性提高了84%，AK酶活提高了12倍，說明Δldh菌株葡萄糖代謝流分布發(fā)生了變化，乳酸產生支路被阻斷后，代謝流更多的偏向了琥珀酸和乙酸產生途徑。

圖4 缺氧條件下嗜乙酰乙酸棒桿菌代謝圖Fig. 4 Metabolic pathways of C. acetoacidophilum under oxygen deprivation conditions. GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate; PEPC: phosphoenolpyruvatecarboxylase; PEPCK: phosphoenolpyruvat carboxykinase; PC: pyruvate carboxylase; MDH: malate dehydrogenase; FUM: fumarate dehydratase; LDH: lactate dehydrogenase; AK: acetate kinase; PDHC: pyruvate dehydrogenase complex; PTA: phosphotransacetylase.

圖5 ATCC13870與C. acetoacidophilum-Δldh缺氧條件下比酶活Fig. 5 Enzymatic activities of ATCC13870 and C. acetoacidophilum-Δldh under oxygen-deprived condition.

從代謝途徑分析，1 mol葡萄糖完全酵解可產生2 mol的NADH，在碳酸氫鹽供應充足的情況下理論上可產生2 mol的琥珀酸，而生成2 mol的琥珀酸需要4 mol的NADH，因此以葡萄糖為底物代謝產琥珀酸的過程中存在氧化還原輔酶的不平衡。本研究也發(fā)現(xiàn)C. acetoacidophilum-Δldh產琥珀酸過程中，NADH/NAD+比值小于1，說明Δldh菌產琥珀酸過程中可能存在NADH不足。因此加強NADH的供給和阻斷乙酸產生支路，將是構建高效生產琥珀酸菌C. acetoacidophilum的方向。

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(本文責編 郝麗芳)

Metabolic shift of Corynebacterium acetoacidophilum-Δldh under oxygen deprivation conditions

Qian Yang, Pu Zheng, Fang Yu, Wei Liu, and Zhihao Sun
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Lactate and succinate were produced by Corynebacterium acetoacidophilum from glucose under oxygendeprivation conditions. To construct knockout mutant, lactate dehydrogenase gene (ldh) of C. acetoacidophilum was deleted by double-crossover chromosome replacement with sacB gene. Comparing with the wild strain ATCC13870, ldhA-deficent mutant produced no lactate with glucose consumption rate decreased by 29.3%, while succinate and acetate concentrations were increased by 45.6% and 182%, respectively. Moreover, the NADH/NAD+rate was less than 1 (about 0.7), and the activities of phosphoenolpyruvate carboxylase and acetate kinase of the ldhA-deficent mutant were enhanced by 84% and 12 times, respectively. Our studies show that succinicate and acetate production pathways are strengthened by blocking lactate synthesis. It also suggests that improving NADH supply and eliminating acetate generation are alternative strategies to get high succinate-producer.

Corynebacterium acetoacidophilum, ldhA-deficent mutant, oxygen deprivation, succinic acid, metabolic

July 30, 2013; Accepted: September 16, 2013

Pu Zheng. Tel: +86-510-85918252; E-mail: zhengpu@jiangnan.edu.cn

楊倩, 鄭璞, 于芳, 等. 嗜乙酰乙酸棒桿菌Corynebacterium acetoacidophilum-Δldh缺氧條件下代謝葡萄糖途徑的變化.生物工程學報, 2014, 30(3): 435?444.

Yang Q, Zheng P, Yu F, et al. Metabolic shift of Corynebacterium acetoacidophilum-Δldh under oxygen deprivation conditions. Chin J Biotech, 2014, 30(3): 435?444.

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020301-012).

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA020301-012) 資助。

Received: July 30, 2013; Accepted: September 16, 2013

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020301-012).

Corresponding author: Pu Zheng. Tel: +86-510-85918252; E-mail: zhengpu@jiangnan.edu.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA020301-012) 資助。

Received: July 30, 2013; Accepted: September 16, 2013

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020301-012).

Corresponding author: Pu Zheng. Tel: +86-510-85918252; E-mail: zhengpu@jiangnan.edu.cn

國家高技術研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA020301-012) 資助。