徐斌 張祥勝

（1.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室；2.鹽城師范學院生命科學與技術學院）

響應面法優(yōu)化耐鹽烴降解菌培養(yǎng)基的初步研究＊

徐斌1，2張祥勝1，2

（1.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室；2.鹽城師范學院生命科學與技術學院）

海洋溢油污染對海洋和沿海灘涂生態(tài)環(huán)境造成嚴重威脅，篩選耐鹽烴降解菌株和優(yōu)化烴降解菌培養(yǎng)條件至關重要。以實驗室篩選的一株烴降解菌為研究對象，在已有的單因素試驗的基礎上，采用響應面法對烴降解菌培養(yǎng)基進行優(yōu)化，結果表明：當酵母粉質量濃度為2.74 g／L，NH4NO3質量濃度為1.47 g／L，磷酸鹽質量濃度為1.22 g／L時，烴降解率為65.81%，比單因素優(yōu)化試驗最優(yōu)水平下的烴降解率增加14.58個百分點。

產表面活性劑烴降解菌；響應面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

0 引 言

隨著石油的廣泛利用，石油污染也隨之而來，特別是在石油勘探、開采、運輸、煉制等過程中，由于處理不當或意外事故，將會引起油品的泄漏［1］。石油污染物進入土壤，會堵塞土壤孔隙，使土壤透氣性降低，破壞土壤微生態(tài)環(huán)境。土壤中的石油向下滲漏，可能導致地下水污染［2］，向空氣中散發(fā)，會污染空氣，威脅人類健康［3］。溢油事故、海上鉆探泄漏等造成的海洋石油污染，對海洋和沿海灘涂生態(tài)環(huán)境的破壞更是災難性的［4］。在諸多石油污染修復方法中，微生物修復技術被公認為是治理石油污染的較好方法，日益受到人們的廣泛關注［4-6］。溫度、鹽度、營養(yǎng)條件、溶氧量等環(huán)境因素影響烴降解菌的降解效率，尤其是營養(yǎng)鹽，對海洋烴降解菌的降解效率有一定影響［7］。因此，結合菌株篩選，進行降解條件的優(yōu)化很有必要。響應面法是一種優(yōu)化試驗設計的方法，具有試驗次數(shù)少、結果精確等優(yōu)點［8-9］，但尚未在烴降解菌培養(yǎng)基優(yōu)化中得到廣泛應用［10］。

本研究通過對自行篩選的一株耐鹽石油降解菌株，采用響應面法對培養(yǎng)基主要成分進行了優(yōu)化，以更有效地發(fā)揮烴降解菌的生物修復潛力，為日后該菌株的推廣和進行針對性的現(xiàn)場修復提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 g／L，牛肉膏3 g／L， NaCl 5 g／L。培養(yǎng)基p H值在7.0～7.2，經(jīng)121℃高壓滅菌20 min。

烴降解菌的基礎培養(yǎng)基成分：MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4NO31 g，磷酸鹽1 g（KH2PO4、K2HPO4兩種磷酸鹽均為1 g），F(xiàn)eSO40.05 g，CaCl20.02 g，酵母粉1 g，NaCl 35 g，原油5 g，去離子水1 L。p H值7.0～7.2，121℃高壓滅菌20 min。進行參數(shù)優(yōu)化時，培養(yǎng)基待優(yōu)化成分根據(jù)實驗方案進行設置。

1.2 菌株來源

菌株J3是由大慶油田污染土壤中分離篩選出的產表面活性劑烴降解菌［11-12］，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌，對石油烴的降解率可達48%。進行響應面法優(yōu)化試驗前，菌株進行了連續(xù)多代馴化，以充分發(fā)揮其降解性能。

1.3 響應面法對烴降解菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 烴降解菌培養(yǎng)基的優(yōu)化

在已有的烴降解菌培養(yǎng)基單因素優(yōu)化的基礎上，以酵母粉濃度、NH4NO3濃度、磷酸鹽濃度為自變量，利用三因素三水平的Box-Benhnken響應面分析法進行試驗。以烴降解率為響應值，對烴降解菌培養(yǎng)基進行優(yōu)化，共17個試驗點，其中一類為12個析因點，另一類為5個中心點。試驗因素水平見表1。

1.3.2 烴降解率的計算方法

取貯存于4℃的斜面培養(yǎng)基1支，用接種環(huán)刮取菌苔，接種于存有50 m L肉湯培養(yǎng)基的150 m L搖瓶內，放入恒溫搖床中，在180 r／min，30℃條件下培養(yǎng)24 h。按5%的比例接種于烴降解菌培養(yǎng)基中，在180 r／min，30℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d后用重量法測定剩余石油烴的質量［13-14］。烴降解率計算公式如下：

表1 Box-Benhnken試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 回歸方程的建立

采用Design-Expert V8.0.6.1軟件對數(shù)據(jù)進行降解率回歸方程的建立，該模型對應的回歸方程：

2.2 響應面圖以及等高線分析

響應面圖是各個試驗因子在交互作用下得到的響應值的結果構成的一個三維空間曲面。根據(jù)Design-Expert軟件V8.0.6.1可得到響應圖，如圖1所示。結果表明，當酵母粉質量濃度在1.00～2.50 g／L，NH4NO3質量濃度在0.70～1.50 g／L時，兩者之間有增效作用，且降解率隨著濃度增加而增加；而當酵母粉質量濃度在2.50～3.00 g／L，NH4NO3質量濃度在0.50～0.70 g／L時，降解率隨著濃度增加而下降，見圖1（a）。當酵母粉質量濃度在1.00～2.50 g／L，磷酸鹽質量濃度在0.7～1.50 g／L時，兩者之間有增效作用，且降解率隨著濃度增加而增加；而當酵母粉質量濃度在2.50～3.00 g／L，磷酸鹽質量濃度在0．50～0.70 g／L時，降解率隨著濃度增加而下降，見圖1（b）；當NH4NO3質量濃度在0.50～1.50 g／L，磷酸鹽質量濃度在0.50～1.50 g／L時，兩者之間有增效作用，且降解率隨著濃度增加而增加，見圖1（c）。

由回歸方程和Design-Expert軟件分析結果，可獲得最優(yōu)配方：酵母粉質量濃度2.74 g／L，NH4NO3質量濃度1.47 g／L，磷酸鹽質量濃度1.22 g／L，此時烴降解率存在最大值，其理論值為65.81%，與烴降解菌培養(yǎng)基單因素試驗的最優(yōu)水平下的降解率相比，提高了14.58個百分點。

圖1 響應面試驗等高線

3 結 論

經(jīng)響應面法優(yōu)化的烴降解菌培養(yǎng)基，在含NaCl 35 g／L的情況下，培養(yǎng)基最優(yōu)配方為酵母粉質量濃度為2.74 g／L，NH4NO3質量濃度為1.47 g／L，磷酸鹽質量濃度均為1.22 g／L，此時理論烴降解率為65．81%，比單因素優(yōu)化試驗最優(yōu)水平下的烴降解率提高了14.58個百分點。本實驗各因素不同水平的組合中，最高降解率為65.16%，接近理論最高值。

本研究在優(yōu)良菌株篩選的基礎上，應用響應面法提供了最優(yōu)培養(yǎng)基的理論成分組成，為可能的溢油污染或沿海灘涂石油污染的生物修復提供了技術支持，對保護海洋灘涂生態(tài)環(huán)境也將發(fā)揮積極作用。

［1］ Zhang Xiangsheng,Xu Dejun,Zhu Chunyan,et al.Isolation and Identification of Biosurfactant Producing and Crude Oil Degrading Pseudomonas Aeruginosa Strains [J].Chemical Engineering Journal,2012,209:138-146.

［2］ 陳爭超,張祥勝,向廷生,等.低能離子束二次注入誘變石油微生物菌株的研究[J].輻射研究與輻射工藝學報, 2013,31(4):1-5.

［3］ 李春榮,王文科,曹玉清,等.石油污染土壤的生態(tài)效應[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2007,26(5):1929-1932.

［4］ 曲維政,鄧聲貴.災難性的海洋石油污染[J].自然災害學報,2001,10(1):69-74.

［5］ 許曄,劉生瑤,曾錚.淺析生物修復技術在石油污染治理中的應用[J].油氣田環(huán)境保護,2008,18(4):50-53.

［6］ 張信芳.海洋石油污染的微生物降解過程及生態(tài)修復技術展望[J].環(huán)境科學與管理,2012,37(5):97-99.

［7］ 陳碧娥,王麗娜.營養(yǎng)鹽對湄洲灣海洋細菌生長及降解石油烴的影響[J].海洋環(huán)境科學,2005,24(4):52-54.

［8］ 王永菲,王成國.響應面法的理論與應用[J].中央民族大學學報(自然科學版),2005,14(3):236-240.

［9］ Zhang Xiangsheng,Lu Dequan.Response Surface Analysis of Rhamnolipid Production by Pseudomonas Aeruginosa Strain Z41 with Two Response Values[J]. African Journal of Microbiology Research,2013,7(22): 2757-2763.

［10］Zhou Xiang，Xin Zhijun，Lu Xihong，et al.High Efficiency Degradation Crude Oil by a Novel Mutant Irradiated from Dietzia Strain by12C6＋Heavy Ion Using Response Surface Methodology［J］.Bioresource Technology，2013，137：386-393.

［11］向廷生,郭曉博,張祥勝.低能離子誘變烴降解菌所產表面活性劑的研究[J].微生物學雜志,2013,33(1):48-53.

［12］向廷生,馬飛,張祥勝.低能離子誘變產表面活性劑的烴降解菌研究[J].環(huán)境科學與技術,2012,35(11):41-45.

［13］丁明宇,黃健,李永祺.海洋微生物降解石油的研究[J].環(huán)境科學學報,2001,21(1):84-88.

［14］張祥勝,張玉輝,許德軍.搖瓶發(fā)酵烴降解率的測定方法的研究[J].鄭州師范教育,2013,8(5):43-45.

1005-3158（2014）02-0007-02

2013-11-01）

（編輯 李煜）

10.3969／j.issn.1005-3158.2014.02.003

國家自然科學基金項目（No.10905035）和江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設實驗室開放課題（JLCBE11010）資助。徐斌，鹽城師范學院生物技術專業(yè)在讀碩士，研究方向：環(huán)境微生物。通信地址：江蘇省鹽城市希望大道鹽城師范學院新長校區(qū)，224051