寇龍發(fā)，高利芳，姚 情，李東坡，孫 進

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

乳化溶劑揮發(fā)法制備紫杉醇PLGA納米粒及其體外評價

寇龍發(fā)，高利芳，姚 情，李東坡，孫 進*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的采用乳化溶劑揮發(fā)法制備紫杉醇的PLGA納米粒，并對其進行體外評價。方法 基于單因素優(yōu)化和正交設(shè)計優(yōu)化考察了納米粒制備的處方及工藝。對納米粒的粒徑、zeta電位、包封率和載藥量、形態(tài)、穩(wěn)定性及體外釋放行為進行表征。 結(jié)果 采用動態(tài)光散射技術(shù)測定納米粒粒徑為(211.3±1.4) nm；測定zeta電位為(-4.42±0.70) mV；包封率和載藥量分別為(91.4±3.2)%和(4.35±0.15)%；透射電鏡結(jié)果顯示納米粒為球形,且分布均勻；體外穩(wěn)定性良好，具有明顯的緩釋效果。結(jié)論 所制備的紫杉醇PLGA納米粒粒徑分布均一、包封率高、穩(wěn)定性好，為進一步探索紫杉醇PLGA納米粒的體內(nèi)藥動學(xué)奠定了實驗基礎(chǔ)。

藥劑學(xué)；PLGA納米粒；乳化溶劑揮發(fā)法；正交設(shè)計；紫杉醇

紫杉醇作為一種廣譜抗腫瘤藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，其主要通過誘導(dǎo)和促進微管蛋白的聚合，抑制微管解聚而使腫瘤細(xì)胞的有絲分裂終止，從而阻礙腫瘤細(xì)胞復(fù)制，使腫瘤細(xì)胞死亡[1]。紫杉醇屬于BCS Ⅳ類藥物，溶解性差，滲透性差，極大地影響了其臨床應(yīng)用；但近年來紫杉醇的制劑研究取得了較大進展。已經(jīng)上市的有紫杉醇注射液（taxol）和紫杉醇白蛋白納米粒（abraxane，capxol）。此外，如脂質(zhì)體[2-3]、聚合物膠束[4-5]、聚合物納米粒[6-7]及樹枝狀分子[8-9]等新的藥物傳遞系統(tǒng)的出現(xiàn)，極大地改善了紫杉醇的體內(nèi)外性質(zhì)，為提高其臨床應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

納米粒作為藥物傳遞和控制釋放的載體具有許多優(yōu)點：(1)可有效保護藥物，避免其降解，提高藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性；(2)可以控制藥物釋放，延長體內(nèi)半衰期，提高生物利用度；(3)易實現(xiàn)靶向和定位；(4)體積微小，能夠有效穿過血管壁到達腫瘤部位。在制備納米載體的材料中，可生物降解的聚合物受到普遍重視并得到廣泛的應(yīng)用。聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]是FDA批準(zhǔn)的可用于注射劑的生物降解高分子聚合物。由于其具有良好的組織相容性和生物可降解性，優(yōu)良的成囊性能和可調(diào)節(jié)的降解速率，PLGA已廣泛應(yīng)用于納米藥物傳遞系統(tǒng)的研究。

PLGA納米粒的制備方法常用的主要有納米沉淀法和乳化溶劑揮發(fā)法。納米沉淀法制備的納米粒所形成的粒徑較小，但是重現(xiàn)性差，影響因素不易控。而乳化溶劑揮發(fā)法所制備的納米粒粒徑分布均勻，且產(chǎn)率較高。本文作者采用優(yōu)化的乳化溶劑揮發(fā)法制備PLGA納米粒，以經(jīng)典抗癌藥紫杉醇為模型藥物，以期獲得理想的粒徑分布和較高的藥物包封率，并對其體外穩(wěn)定性及釋藥行為進行研究，為進一步研究紫杉醇PLGA納米粒體內(nèi)藥動學(xué)行為奠定基礎(chǔ)。

1 儀器和材料

AR1140電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司），AG245電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），H-600透射電鏡（日本Hitachi 公司），Malvern Zeta Sizer（美國Malvern公司），LDZ5-2低速自動平衡離心機（北京醫(yī)用離心機廠），PHS-3C酸度計（上海雷磁儀器廠），HITACHI高效液相色譜儀（包括UV Detector 5410、Column Oven 5310、Autosampler 5210、Pump 5110，日本日立公司），ECOSIL-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm， Thermo Fisher中國分公司），HZQ-C空氣浴振蕩機（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），KQ-100超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

紫杉醇（paclitaxel，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，重慶美聯(lián)現(xiàn)代技術(shù)有限公司），聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物（PLGA，乳酸與羥基乙酸物質(zhì)的量比為50:50，相對分子質(zhì)量為38 000，岱罡生物科技有限公司），聚乙烯醇（PVA，相對分子質(zhì)量為20 000～30 000，含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)88%，美國ACROS公司），聚氧乙烯蓖麻油（cremophor EL，巴斯夫中國有限公司），透析袋（截留相對分子質(zhì)量：12 000～14 000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司），乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司），水為重蒸水，其他試劑（分析純，市售）。

2 方法

2.1 PLGA納米粒的制備方法

采用乳化溶劑揮發(fā)法制備紫杉醇PLGA納米粒。精密稱取一定量的藥物和PLGA，用1 mL有機相溶解，將其加入一定量的水相中，冰浴超聲乳化分散一段時間，形成納米乳，在室溫下磁力低速攪拌一段時間，揮去有機溶劑，于13 000 r·min-1高速離心30 min收集納米粒，以重蒸水反復(fù)洗滌3次后，凍干，制得紫杉醇PLGA納米粒。

2.2 處方工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗

以納米粒的制備方法為基礎(chǔ)，以粒徑為評價指標(biāo)，采用單因素實驗系統(tǒng)考察有機相的種類（二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯），表面活性劑的種類（PVA、Tween80、普朗尼克F68），表面活性劑的質(zhì)量濃度（ 5.0 g·L-1、10.0 g·L-1、20.0 g·L-1），油水相體積比（1:3、1:5、1:10），超聲強度（50 W、100 W、200 W、300 W），超聲時間（3 min、5 min、10 min）及揮去有機溶劑所用轉(zhuǎn)速（500 r·min-1、1 000 r·min-1、1 500 r·min-1），確定最優(yōu)處方工藝。

2.2.2 正交優(yōu)化設(shè)計

在各單因素實驗的基礎(chǔ)上, 選取對紫杉醇PLGA納米粒制備影響較大的4個因素: 乳化劑質(zhì)量濃度、油水相體積比、超聲強度、超聲時間。每個因素選擇3個水平, 按照L9(34) 正交表設(shè)計實驗進行處方工藝優(yōu)化。以粒徑為評價指標(biāo)，通過正交試驗的直觀分析優(yōu)化處方及最佳制備工藝。因素水平設(shè)計表見表1。

表 1 正交設(shè)計中的因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

2.2.3 最優(yōu)處方工藝驗證

綜合單因素實驗和正交優(yōu)化設(shè)計，確定最優(yōu)處方和制備工藝。并按最優(yōu)處方工藝進行3次重復(fù)驗證試驗，即分別制備3批紫杉醇PLGA納米粒樣品，測定其粒徑。

2.3 納米粒的表征

2.3.1 粒徑和zeta電位測定

取PLGA納米粒膠體溶液，以重蒸水稀釋至適當(dāng)濃度，于25 ℃下以動態(tài)光散射粒徑分析儀測定納米粒的粒徑。用zeta電位儀測定納米粒的zeta電位。

2.3.2 形態(tài)學(xué)考察（透射電子顯微鏡）

取PLGA納米粒膠體溶液，以重蒸水稀釋至適當(dāng)濃度，取1、2滴納米粒膠體溶液置于銅網(wǎng)上，用質(zhì)量濃度10.0 g·L-1磷鎢酸染色，室溫晾干，于投射電子顯微鏡下觀察納米粒的形態(tài)并拍照。

2.3.3 載藥量和包封率的測定

包封率和載藥量是納米粒質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，采用微柱離心法測定納米粒的載藥量和包封率。按公式：包封率（EE）=m包/m藥×100%計算載藥納米粒的包封率（EE）和公式：載藥量（DL）= m包/m總×100%計算載藥納米粒的載藥量（DL%）。式中，m包為納米粒中包裹的藥物質(zhì)量（mg），m藥為投入的總藥質(zhì)量（mg），m總為載藥納米粒的總質(zhì)量（mg）。

2.4 PLGA納米粒體外穩(wěn)定性考察

將制成的納米粒膠體溶液置于4 ℃冰箱中放置，于特定時間測定納米粒的粒徑變化。

2.5 載藥納米粒的體外釋放實驗

選取含有20.0 g·L-1的聚氧乙烯蓖麻油的pH值7.4的磷酸緩沖溶液（PBS）作為釋放介質(zhì)，考察載藥納米粒的釋放特征。精密移取載藥納米粒膠體溶液2.0 mL于透析袋中，然后將密封的透析袋置于50 mL的釋放介質(zhì)中，平行操作3個樣品，在37 ℃、100 次·min-1震蕩的條件下進行體外釋放試驗。于特定時間內(nèi)取出釋放介質(zhì)2 mL，并補充等量體積的新鮮介質(zhì)。用HPLC法測定樣品中紫杉醇的含量，計算藥物的累積釋放量和累積釋放百分率。紫杉醇的測定波長為227 nm，流動相為乙腈-水（體積比50︰50），流速為1.0 mL·min-1。

3 結(jié)果和討論

3.1 處方工藝優(yōu)化單因素考察

在PLGA納米粒的制備過程中，多種因素影響其粒徑分布。主要考察了有機相種類、表面活性劑種類、表面活性劑質(zhì)量濃度、油水相體積比、超聲強度、超聲時間、揮去有機溶劑所用轉(zhuǎn)速對制備的納米粒粒徑的影響。

3.1.1 有機相種類的影響

乳化溶劑揮發(fā)法所用的有機相不能與水相混溶，才能在探頭超聲條件下很好地形成納米乳。選擇的二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯三種有機溶劑與水相混合超聲后均能形成納米乳，但是二氯甲烷的乳化效果最好，所以選用二氯甲烷為有機相。

3.1.2 表面活性劑種類的影響

分別采用10.0 g·L-1的普朗尼克F68、Tween80、PVA作為表面活性劑進行處方篩選，結(jié)果見圖1A。制備過程中發(fā)現(xiàn)，以PVA為表面活性劑的樣品會有淡藍(lán)色乳光，而以Tween80和普朗尼克F68為表面活性劑的樣品中沒有乳光。由圖1 A可知，以PVA作為表面活性劑可以得到相對較小的粒徑及較小的PDI值。說明PVA作為表面活性劑可以有效降低PLGA納米粒的粒徑且控制其粒徑分布在較窄范圍內(nèi)。

3.1.3 表面活性劑質(zhì)量濃度的影響

分別采用不同質(zhì)量濃度的PVA溶液作為表面活性劑，進行處方篩選，結(jié)果見圖1B。由圖1B可知，隨著表面活性劑質(zhì)量濃度的增大，PLGA納米粒的粒徑逐漸變大，選擇10.0 g·L-1及其以下質(zhì)量濃度可獲得較小粒徑。

3.1.4 油水相體積比的影響

分別以有機相與水相體積比為1:3、1:5、1:10進行處方篩選，結(jié)果見圖1C。由圖1C可知，隨著水相比例的增大，PLGA納米粒的粒徑逐漸減小，且其比例增大到1:5時，粒徑降低的速率減小。

3.1.5 超聲強度的影響

分別以50、100、200、300 W的強度進行制備工藝考察，結(jié)果見圖1D。由圖1D可知，隨著超聲強度的增大，納米粒粒徑減小。當(dāng)粒徑下降到210 nm左右的時候不再下降。

3.1.6 超聲時間的影響

分別以3、5、10 min的超聲時間進行制備工藝的考察，結(jié)果見圖1E。由圖1E可知，隨著超聲時間的延長，納米粒粒徑減小，且超聲時間超過5 min后，納米粒粒徑減小且速率變緩。

3.1.7 揮去有機溶劑所用轉(zhuǎn)速的影響

分別以500、1 000、1 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速進行制備工藝的考察，結(jié)果見圖1F。由圖1F可知，轉(zhuǎn)速對納米粒粒徑幾乎不影響。實驗操作中發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)速能夠影響有機溶劑揮去的時間，轉(zhuǎn)速越大，有機溶劑揮去越快。

圖1 納米粒的處方工藝對粒徑的影響Fig. 1 The effects of preparation and formulation of the nanoparticles on particle size

3.2 正交設(shè)計優(yōu)化

在單因素分析的基礎(chǔ)上，選取對納米粒粒徑影響較大的4個因素（表面活性劑質(zhì)量濃度、油水相體積比、超聲強度、超聲時間）對其進行正交優(yōu)化。正交實驗設(shè)計結(jié)果見表2。

表 2 正交實驗設(shè)計結(jié)果Table 2 The results of the orthoganol design

以粒徑為指標(biāo)進行直觀分析，由極差R確定主次因素順序為A＞C＞B＞D，其中A因素K1＞K3＞K2，K2為最優(yōu)水平；B因素K1＞K2＞K3，K3為最優(yōu)水平；C因素K1＞K2＞K3，K3為最優(yōu)水平；D因素K1＞K2＞K3，K3為最優(yōu)水平。因此確定A2B3C3D3為最優(yōu)處方，即表面活性劑選擇質(zhì)量濃度10.0 g·L-1PVA溶液，油水相體積比為1︰10，超聲強度為300 W，超聲時間為10 min。

3.3 粒徑分布及zeta電位

以最優(yōu)處方工藝制備PTX-PLGA-NPs（紫杉醇PLGA納米粒），動態(tài)光散射粒徑測定儀測定結(jié)果為PTX-PLGA-NPs的平均粒徑為(211.3±1.4) nm（圖2），分布均勻；zeta電位為(-4.42±0.70) mV。由于使用的PLGA的羧基端連有甲基封端，因此制備的納米粒所顯示電負(fù)性并不明顯，而呈相對中性。

圖 2 紫杉醇PLGA納米粒的粒徑分布Fig. 2 The size distribution of paclitaxel loaded PLGA nanoparticles

3.4 形態(tài)學(xué)考察（TEM）

透射電鏡結(jié)果（圖3、4）顯示，制得的紫杉醇PLGA納米粒呈球形，表面圓整光滑，粒子之間無黏連現(xiàn)象，分散性良好，且粒徑分布較為均一。與動態(tài)光散射結(jié)果相比，此粒徑偏小。原因是動態(tài)光散射粒徑儀測定時樣品處于水環(huán)境中，離子表面較為伸展，且有表面活性劑PVA的存在，在納米粒周圍形成一定范圍的水化層；而拍攝TEM時樣品制備需要干燥，導(dǎo)致粒子會發(fā)生輕微皺縮。圖3中PLGA納米粒未經(jīng)過洗去表面活性劑的步驟，因此周圍有一層由PVA形成的暈；而圖4中的PLGA納米粒經(jīng)過多次洗去表面活性劑的步驟，納米粒表面的環(huán)狀暈減少。

圖 3 紫杉醇PLGA納米粒的透射電鏡照片（未洗去表面活性劑）Fig. 3 TEM image of the paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles (without washing)

圖 4 紫杉醇PLGA納米粒的透射電鏡照片（洗去表面活性劑）Fig. 4 TEM image of the paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles (washed)

3.5 包封率和載藥量的測定

采用本研究優(yōu)化后的處方工藝（有機相為二氯甲烷，水相為10.0 g·L-1PVA溶液，油水相體積比為1:10，超聲強度為300 W，超聲時間10 min）重復(fù)制備紫杉醇PLGA納米粒3批，以微柱離心法測定其包封率和載藥量。測得納米粒的平均包封率為(91.4±3.2)%，平均載藥量為(4.35±0.15)%，且制備工藝的重復(fù)性良好。

3.6 PLGA納米粒的體外穩(wěn)定性試驗

由PLGA納米粒的穩(wěn)定性實驗結(jié)果（圖5）可知，4 ℃條件下，PLGA納米粒在15 d內(nèi)粒徑基本不發(fā)生變化，由PDI值可看出粒徑分布變化不大。由此得出，本研究所制備的PLGA納米粒穩(wěn)定性良好。

3.7 紫杉醇PLGA納米粒的體外釋放試驗

紫杉醇在水中的溶解度低，當(dāng)用普通溶出介質(zhì)時，溶出液中只有痕量的藥物，文獻中有報道采用1.0 g·L-1Tween 80[10-11]、10.0 g·L-1Tween 80[12]、20.0 g·L-1Tween 80[13]等作為紫杉醇體外釋放的增溶劑。但是經(jīng)實驗驗證后發(fā)現(xiàn)，釋放過程中會有沉淀在透析袋中產(chǎn)生，增溶效果并不理想；釋放介質(zhì)中加入20.0 g·L-1的cremophor EL[14]可以有效增加紫杉醇在釋放介質(zhì)中的溶解度，使其達到漏槽條件，故本實驗采用20.0 g·L-1cremophor EL作為增溶劑。使用含有20.0 g·L-1cremophor EL的pH值7.4的PBS作為釋放介質(zhì)研究PLGA納米粒中紫杉醇的釋放特征（圖6）。

圖 5 P LGA納米粒在4 ℃的穩(wěn)定性Fig. 5 S tability of PLGA n anoparticles at 4 ℃

圖 6 紫杉醇PLGA納米粒的體外釋放行為(n=3)Fig. 6 Release behavior of the paclitaxel-loadedPLGA nanoparticles (n=3)

從結(jié)果可以看出，PLGA納米?？梢钥刂谱仙即季徛尫?，并且沒有明顯的突釋現(xiàn)象；72 h以內(nèi)的釋放接近于零級釋放，并且在第72小時累積釋放度達到70%以上；結(jié)果顯示樣品累積釋放度在96 h后出現(xiàn)不同程度的下降，可能是因為有部分的紫杉醇降解。

4 結(jié)論

以PLGA為載體材料，以乳化溶劑揮發(fā)法制備了紫杉醇的生物可降解給藥系統(tǒng)PTX-PLGA-NPs。為獲得具有理想粒徑的PTX-PLGA-NPs，本文對納米粒的處方及制備工藝進行了篩選優(yōu)化。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計優(yōu)化處方，得到最優(yōu)處方。以最優(yōu)處方制得的PTX-PLGA-NPs平均粒徑為(211.3±1.4) nm，zeta電位為(-4.42±0.70) mV，平均包封率為(91.4±3.2)%，平均載藥量為(4.35±0.15)%。對其進行形態(tài)學(xué)、體外穩(wěn)定性、體外釋藥特征分析，PTX-PLGA-NPS表面圓整光滑，理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的藥物緩釋性能，為抗腫瘤緩釋制劑的開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。在本研究基礎(chǔ)上，后續(xù)工作將進一步探索PTX-PLGA-NPs的體內(nèi)藥動學(xué)規(guī)律，為其臨床應(yīng)用提供相應(yīng)的實驗基礎(chǔ)。

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Preparation and in vitroevaluation of paclitaxelloaded PLGA nanoparticles by emulsion-solvent evaporation method

KOU Long-fa, GAO Li-fang, YAO Qing, LI Dong-po, SUN Jin*
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo evaluate the paclitaxel (PTX) loaded poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles prepared by emulsion-solvent evaporation method. Methods The preparation and formulation of the nanoparticles were optimized with single factor tests and an orthogonal design. ThePTX-PLGA nanoparticles were characterized with respect to particle size, zeta potential, entrapment efficiency, drug loading, shape, stability and release behavior. Results The mean particle size measured by dynamic light scattering (DLS) was (211.3±1.4) nm, and the zeta potential was (-4.42±0.70) mV. The entrapment efficiency and the drug loading of PTX-NPs were (91.4±3.2)% and (4.35±0.15)%, respectively. The images of TEM show that the nanoparticles were spherical and uniform. In vitro, the PTX-PLGA nanoparticles present good stability and sustained-release behavior. Conclusions The resultant nanoparticles have uniform particle size, high drug loading and good stability. These results are the experimental basis in vitro for the further in vivo pharmacokinetic research of PTX-PLGA nanoparticles.

Pharmaceutics; PLGA nanoparticles; emulsion-solvent evaporation method; orthogonal design; paclitaxel

R 94

A

（2014）02–0033–10

(本篇責(zé)任編輯：馬麗麗)

2013–12–31

寇龍發(fā)（1988-），男（漢族），河南偃師人，碩士研究生，E-mail klf.666666@163.com；*通訊作者：孫進（1975-），男（漢族），安徽金寨人，教授，博士，主要從事藥劑學(xué)研究，Tel. 024-23986325，E-mail sunjin0529@aliyun.com。