宋明艷，李 娜，姜 彥，于龍剛

(1青島大學醫(yī)學院，山東青島266071;2青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院)

近年來，隨著組織工程學、細胞及基因治療技術的衍生和發(fā)展，骨髓間充質干細胞(BMSCs)因具有來源廣泛、取材方便、可多向分化、易于分離培養(yǎng)及純化等優(yōu)點，被視為理想的種子細胞，受到越來越多的關注［1］。BMSCs的工程需求量較大，但它在骨髓中數(shù)量卻極少，僅占單核細胞的0.001% ～0.01%，需要體外分離純化和大量增殖，這也是推廣組織工程學應用的重要前提［2］。因此如何高效獲取并鑒定BMSCs成為研究的重要任務。2013年8～12月，我們采用全骨髓貼壁法從兔骨髓中分離出BMSCs進行培養(yǎng)，過程中檢測細胞活性，鑒定細胞多向分化能力，對所獲取的細胞進行綜合評價，探討此方法分離培養(yǎng)BMSCs的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 純種新西蘭大耳白兔，4周齡，雌雄不限，體質量約1.0 kg，由青島市實驗動物中心提供。實驗所有過程中對兔的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、吲哚美辛，堿性磷酸酶檢測及脂肪細胞油紅O染色試劑盒。

1.2 兔BMSCs的分離和原代培養(yǎng) 用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉兔子，刮除其雙下肢毛發(fā)，用1%的碘伏消毒術區(qū)，鋪無菌洞巾，解剖出雙側股骨，剔凈肌肉及骨膜，75%乙醇浸泡5 min后轉移到超凈工作臺。PBS緩沖液沖洗3遍股骨，剪去兩側部分干骺端，用加有肝素的DMEM/F12培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集骨髓混合液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為10%的胎牛血清)制成單細胞懸液。將細胞以2×105/cm2的密度接種于底面積25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱內孵育。24 h后首次半量換液，棄去未貼壁的細胞，此后平均每48 h換液1次，嚴格無菌操作，光鏡下觀察培養(yǎng)結果。

1.3 兔BMSCs的傳代培養(yǎng) 原代細胞達到90%融合度后，開始進行傳代。吸除原培養(yǎng)廢液，PBS緩沖液洗滌細胞3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，當光鏡下細胞由梭形變?yōu)閳A形時，提示細胞已完全分離，立即加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，并反復輕輕吹打瓶底貼壁細胞，制成單細胞懸液，并按照1∶3的比例進行傳代。原代細胞標記為P0，第一代標記為P1，以此類推，鏡下觀察細胞的形態(tài)及生長情況。

1.4 兔BMSCs的鑒定

1.4.1 貼壁率檢測 取P3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，加入DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，以5×107/孔的密度接種到12孔培養(yǎng)板中，每2 h棄去2孔細胞培養(yǎng)液，再次消化貼壁細胞，進行細胞計數(shù)，并取平均值，計算各個時間點的貼壁率后繪制曲線。貼壁率(%)=已貼壁細胞數(shù)/接種細胞總數(shù)×100%。

1.4.2 細胞增殖檢測及生長曲線的繪制 取P3代細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，加入DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按1×107/L的密度接種到24孔培養(yǎng)板中，每天取3孔細胞消化后計數(shù)，取平均值，連續(xù)計數(shù)8 d，以培養(yǎng)時間為橫軸、細胞平均值為縱軸，繪制細胞生長曲線。

1.5 兔BMSCs分化能力檢測

1.5.1 兔BMSCs成脂誘導分化 取P3代細胞，當細胞達到90%融合后，加入脂肪細胞誘導劑(含LDMEM培養(yǎng)基、體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素、1 μmol/L地塞米松、200 μmol/L 吲哚美辛及 0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤)，每3 d換液1次，10 d后行油紅O染色，鏡下觀察結果。

1.5.2 兔BMSCs成骨誘導分化 取P3代細胞，當細胞達到90%融合后，加入成骨細胞誘導劑進行誘導分化(含L-DMEM培養(yǎng)基、體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/L 青霉素、100 U/L 鏈霉素、10 mmol/L β-磷酸甘油、10－8mol/L地塞米松，50 mg/L抗壞血酸)，每3天換液1次，21 d后行堿性磷酸酶定性染色，鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 兔BMSCs形態(tài)學變化 原代BMSCs接種24 h，可見較多懸浮雜質細胞，貼壁細胞較少且分散，細胞較小，近似圓形或短梭形。3 d后貼壁細胞增多，出現(xiàn)放射狀集落式生長，6 d后細胞集落生長明顯，呈旋渦狀或輻射狀，此時細胞以長梭形為主，還可見三角形、扁平形和其他不規(guī)則形。多次傳代后雜質被棄去，純度不斷提高，細胞生長活躍，形態(tài)較均一，維持長梭狀。

2.2 兔BMSCs的貼壁率曲線 此貼壁率曲線顯示，細胞培養(yǎng)2 h貼壁30%以上，4 h貼壁60%，8 h貼壁70%以上，12 h貼壁90%，充分反映了BMSCs旺盛的活力和快速增殖能力(見圖1)。

2.3 兔BMSCs的生長曲線 P3代細胞的生長曲線大體呈S形，細胞培養(yǎng)至第2天時，細胞數(shù)目無明顯增加，為細胞的適應期;3 d后細胞數(shù)迅速增加，大量細胞快速增殖，為對數(shù)生長期;6 d左右細胞數(shù)達到頂點，逐漸進入平臺期，此時細胞增殖明顯減慢(見圖2)。

圖1 P3代骨髓間充質干細胞的貼壁率

圖2 P3代骨髓間充質干細胞的生長曲線

2.4 兔BMSCs成脂誘導分化情況 第6天光鏡下初見細胞胞質內有黃色圓形脂滴沉著，細胞呈圓形，隨著誘導時間的延長，脂肪細胞的比例逐漸增高。培養(yǎng)到21 d時，脂滴明顯增大，胞核偏向細胞一側，經油紅O染色后，胞核呈現(xiàn)藍色，脂滴呈現(xiàn)橙紅色(見圖3)。

圖3 兔BMSCs來源的成脂細胞油紅O染色(×100)

2.5 兔BMSCs成骨誘導分化情況 BMSCs向成骨誘導6 d時，細胞開始由梭形變?yōu)殚L方形或多角形，21 d時行堿性磷酸酶定性染色，細胞核呈紫色，胞質出現(xiàn)紅棕色或褐色顆粒(見圖4)。

圖4 兔BMSCs來源的成骨細胞堿性磷酸酶染色(×100)

3 討論

20世紀70年代，F(xiàn)riedenstein等［3］利用全骨髓貼壁法最先從骨髓中分離培養(yǎng)出了間充質干細胞，這是一種來源于中胚層的成體干細胞，具有較強的自我更新能力，在不同的誘導條件下，可向中胚層和外胚層組織分化，如向成骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、軟骨細胞、肌肉組織及支持造血的基質細胞等分化。間充質干細胞可以從骨髓、脂肪、臍帶、羊膜或牙髓等眾多組織中獲取，其中骨髓一直是其主要來源。BMSCs取材相對方便、培養(yǎng)周期短、增殖能力強、呈貼壁式生長，具有一定的免疫調節(jié)功能，避免了發(fā)生免疫排斥反應，且多次傳代后仍保持旺盛生命力，因此被組織工程學選為種子細胞和基因載體細胞，用于多種動物實驗、臨床及基因研究［4］。組織治療技術是利用干細胞的黏附性及分化更新特性，將干細胞與特定生物材料相結合，并將材料移植到受損組織處，用以修復或替代機體受損組織，目前此技術已經取得較大的成功，如對骨組織、心肌及外周神經損傷后的修復等［5］。所以BMSCs在組織工程學中起著關鍵作用，細胞的分離培養(yǎng)至關重要。

目前，BMSCs常用的分離培養(yǎng)方法有四種，即密度梯度離心法、全骨髓貼壁法、免疫磁珠及流式細胞儀分離法［6，7］。后兩種方法因為實驗要求多，費用高，對細胞活性有很大影響而較少使用。密度梯度離心法雖可在最初獲得較高純度的單核細胞，但因操作復雜，過程中的反復離心影響細胞的活性，又使得大量細胞及生物因子流失，故不作為首選方法。全骨髓貼壁法主要利用細胞的貼壁特性對全骨髓進行分離，雖然在原代細胞中混雜有一定數(shù)量的造血干細胞或成纖維細胞等雜質，但這些懸浮未貼壁的細胞可在換液及傳代的過程中被去除，而BMSCs則黏附于培養(yǎng)瓶底得以純化，最后仍可獲得較高純化率。部分研究［8］表明，細胞培養(yǎng)早期殘留的造血干細胞和其他雜細胞，有利于保持BMSCs的生長微環(huán)境，且骨髓中殘留的血小板和巨核細胞可通過分泌相關細胞生長因子，促進集落形成和細胞增殖。全骨髓貼壁法簡單易操作，分離時間短，細胞很少受到分離導致的損傷，獲得的BMSCs活性強、純度高，故是目前應用最多的分離方法。

BMSCs的鑒定目前沒有統(tǒng)一標準，尚未發(fā)現(xiàn)其特異性表面標記物［9，10］。研究者多從細胞形態(tài)、細胞表型或細胞功能三個方面著手鑒定干細胞［11］。干細胞表面抗原的檢測，僅僅用于判斷所得細胞的均一性或純度，或初步判斷其是否為一種非造血干細胞［12］。而檢測細胞的多向分化潛能才是鑒定BMSCs的金標準［13］。細胞形態(tài)方面如細胞呈類似成纖維細胞的梭形、貼壁式生長、克隆成集落快速增殖等均符合干細胞的形態(tài)學特征。在成骨及脂肪誘導劑作用下，向成骨及脂肪細胞轉化，充分顯示了干細胞的多向分化潛能以及自我更新的能力，符合干細胞的生物特性。S形生長曲線提示干細胞經歷了潛伏期、增殖期及平臺期，符合細胞的生長特性及增殖規(guī)律。細胞短時間內出現(xiàn)貼壁，培養(yǎng)12 h后貼壁率高達90%，反映出細胞超強的生存能力和活力［14］。

總之，全骨髓貼壁法可以比較簡便的分離培養(yǎng)出BMSCs，同時保證干細胞的純度及增殖活性，可適應組織工程對大量細胞的需求，對于提供充足高質量的種子細胞具有重大意義。

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