杜凡，周佰林，張紅征，李煥斌，文正偉，王玲，張琦

（溫州醫(yī)科大學(xué) 核醫(yī)學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

隨著DNA重組和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的逐步成熟，鈉/碘轉(zhuǎn)運體（sodium/iodide symporter，NIS）作為人類腫瘤的一種治療基因，被廣泛地轉(zhuǎn)染到多種腫瘤細(xì)胞中，如甲狀腺髓樣癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等[1-4]，并成功地使轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞具有攝碘功能。擴展碘131（131I）在非甲狀腺癌中的治療是NIS最具前景的研究領(lǐng)域之一。我們設(shè)想將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與放射性核素治療相結(jié)合，將人鈉/碘轉(zhuǎn)運體（hNIS）基因轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中，使SW480細(xì)胞獲取攝131I能力，然后利用131I的輻射生物效應(yīng)，達到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，即研究131I應(yīng)用于結(jié)腸癌治療的可能性，為下一步的動物體內(nèi)實驗提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞： SW480細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫；已轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒（pcDNA3.1+）的SW480細(xì)胞和已轉(zhuǎn)染hNIS基因（pcDNA3.1+-hNIS）的SW480細(xì)胞，由溫州醫(yī)科大學(xué)核醫(yī)學(xué)教研室轉(zhuǎn)染并檢測[5]。

1.1.2 主要試劑：131I購于中國原子高科有限公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將細(xì)胞分為重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染組）、空白質(zhì)粒（pcDNA3.1+）轉(zhuǎn)染組（空白質(zhì)粒組）和空白對照組。以10%血清1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長滿培養(yǎng)瓶85%～90%時傳代。

1.2.2 體外攝131I實驗：①用λ計數(shù)器測各組細(xì)胞本身的cpm值，即本底值。②6孔板培養(yǎng)各組SW480細(xì)胞24 h，每孔加含有15μCi131I的培養(yǎng)基1 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測24 h的瞬時攝131I率。③6孔板培養(yǎng)各組SW480細(xì)胞，分別于4、8、16、24、36、48 h用胰酶消化提取細(xì)胞測cpm值。④同時保留一管含有15μCi培養(yǎng)液1 mL，λ計數(shù)器測它不同時段的cpm值。測不同時段攝131I能力變化。

1.2.3 高氯酸鹽抑制實驗：各組SW480細(xì)胞均勻接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長至約80%融合時，其中3個孔加入20μL的l mmol/mL NaClO4，另3個孔不加NaClO4，每孔加入含有15μCi131I的10%血清1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h時，消化提取細(xì)胞，測cpm值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況：各組SW480細(xì)胞均勻接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長至約80%融合時，換新培養(yǎng)基，每1 mL含100μCi的131I。各組細(xì)胞8、16和24 h用不含EDTA的胰酶消化收集1×105細(xì)胞，加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加5μL Annexin V-FITC/PI混勻后加入5μL Propidum Iodide，混勻。室溫下避光反應(yīng)5～15 mim。流式細(xì)胞儀檢測觀察131I誘導(dǎo)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。各組實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞24 h攝131I能力 轉(zhuǎn)染組比空白質(zhì)粒組與空白對照組攝131I能力增加約8倍（P＜0.05），而空白質(zhì)粒組與空白對照組攝131I能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞各時段攝131I能力曲線轉(zhuǎn)染組細(xì)胞4～24 h攝131I能力呈增高趨勢，24 h攝131I達高峰，24～48 h攝131I能力緩慢遞減。而空白對照組與空白質(zhì)粒組各時段攝131I能力未見顯著變化。見圖1。

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后24 h攝131I能力（±s，cpm）

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后24 h攝131I能力（±s，cpm）

與空白對照組比：aP＜0.05；與空白質(zhì)粒組比：bP＜0.05

組別 每分鐘放射性計數(shù)轉(zhuǎn)染組 2 915.34±972.91ab空白質(zhì)粒組 348.44±92.79空白對照組 333.0±100.86

圖1 SW480細(xì)胞不同時段攝131I能力曲線圖

2.3 測定穩(wěn)定表達hNIS-SW480細(xì)胞NaClO4抑制情況 未加NaClO4轉(zhuǎn)染組攝131I能力明顯增加，加NaClO4轉(zhuǎn)染組攝131I能力明顯受抑制，攝131I能力降低為前者的1/10左右（P＜0.05）。而空白質(zhì)粒組與空白對照組加與未加NaClO4攝131I能力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系NaClO4抑制實驗（±s，cpm）

表2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系NaClO4抑制實驗（±s，cpm）

與同組加NaClO4比：aP＜0.05

組別 加NaClO4 未加NaClO4轉(zhuǎn)染組 315.70±66.30 3 304.60±340.60a空白質(zhì)粒組 336.80±50.60 309.95±33.14空白對照組 310.70±32.05 339.35±51.28

2.4 流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡情況 使用Annexin V-FITC/PI雙染行流式細(xì)胞儀檢測分析100 μCi131I殺傷下各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組16 h出現(xiàn)明顯的早期凋亡，凋亡率達14.7%；而24 h晚期凋亡顯著增加，凋亡率達32.9%，轉(zhuǎn)染組凋亡率顯著高于空白質(zhì)粒組與空白對照組。見圖2。

3 討論

擴展放射性碘在非甲狀腺癌中的治療是NIS最具前景的研究領(lǐng)域。hNIS作為一種腫瘤治療基因，研究其靶向特異性并作為精確調(diào)控的基因載體治療腫瘤具有一定優(yōu)勢，即為腫瘤治療開辟新途徑。已有研究報道將hNIS基因轉(zhuǎn)染至非甲狀腺腫瘤細(xì)胞使其成功表達hNIS獲得攝取131I的能力，利用131I的放射性生物殺傷作用達到殺傷腫瘤細(xì)胞的療效[6-7]。

本實驗檢測了hNIS-SW480細(xì)胞的攝131I能力和殺傷作用，結(jié)果顯示篩選穩(wěn)定hNIS-SW480細(xì)胞后其24 h攝131I能力比空白對照組與空白質(zhì)粒組增高約8倍（P＜0.05），而空白質(zhì)粒組與空白對照組攝131I能力未見明顯變化（P＞0.05），表明轉(zhuǎn)染入hNIS基因的SW480細(xì)胞具有高度濃聚碘的能力。高氯酸鹽和碘離子均易被hNIS轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，而前者更易被攝取，故給予細(xì)胞高氯酸鹽能競爭性地將碘離子排出細(xì)胞外。但在正常甲狀腺細(xì)胞中碘離子在碘化酶的作用下與甲狀腺球蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)化成碘化甲狀腺球蛋白，則不會自細(xì)胞被釋放。本實驗中hNIS-SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染了hNIS基因，僅能攝取131I而沒有碘化酶基因的作用，所以當(dāng)高氯酸鹽存在時，碘離子會被排出細(xì)胞。高氯酸鹽抑制實驗結(jié)果表明hNIS-SW480細(xì)胞攝131I能力為hNIS基因的功能；未加NaClO4轉(zhuǎn)染組攝131I能力明顯增加，加NaClO4轉(zhuǎn)染組攝131I能力明顯受抑制，攝131I能力降低為前者的1/10左右（P＜0.05），而空白質(zhì)粒組與空白對照組加與未加NaClO4比攝131I能力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），進一步證明NIS的功能是濃聚碘。Annexin V-FITC/PI雙染行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，在100μCi131I殺傷作用下，轉(zhuǎn)染組16 h出現(xiàn)明顯的早期凋亡，凋亡率達14.7%；而24 h晚期凋亡顯著增加，凋亡率達32.9%，轉(zhuǎn)染組凋亡率顯著高于空白質(zhì)粒組與空白對照組。

綜上所述，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染hNIS具有顯著的攝131I功能，且131I對轉(zhuǎn)染入hNIS基因的SW480細(xì)胞具有顯著殺傷效果。盡管關(guān)于NIS的研究已經(jīng)取得顯著成果，但NIS的靶向作用、表達程度、在腫瘤細(xì)胞中的分布等一系列問題還需進一步探索。

圖2 3組在100μCi 131I作用下不同時間凋亡率（Q1：壞死細(xì)胞；Q2：晚期凋亡細(xì)胞；Q3：存活細(xì)胞；Q4：早期凋亡細(xì)胞）

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[2]周泉波, 陳汝福, 李志花, 等. 重組pDC316-MCMV/hNIS真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及在腫瘤細(xì)胞的功能[J]. 中山大學(xué)學(xué)報, 2007, 28(4): 383-386, 407

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[5]周佰林, 張琦, 張紅征, 等. 人鈉/碘轉(zhuǎn)運體基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞及相關(guān)蛋白表達的檢測[J]. 浙江醫(yī)學(xué), 2013,35(12): 1120-1122, 1126.

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