陳德準(zhǔn)，吳漪皓，陸圣月，林素，黃曉燕，楊德業(yè)，2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 杭州 310015）

Smad蛋白家族是近年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白，能夠直接參與轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族成員的信號傳導(dǎo)。在對果蠅和Caenorhabditiseleg的研究中發(fā)現(xiàn)Mad蛋白和Smad蛋白作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體。特異型的Smad蛋白一過性地與受體直接進(jìn)行配體結(jié)合，接受磷酸化后即與受體分離并與Smad4形成復(fù)合體，從而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄協(xié)同子和抑制子共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1-2]。

TGF-β超家族成員骨形態(tài)形成蛋白受體IA（bone morphogeneticprotein receptor IA，BMPR-IA），又名ALK-3，在心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞分化中起重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)ALK-3基因敲除小鼠出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致先天性心臟病，而其下游基因Pax-8在小鼠心臟發(fā)育過程中起著重要作用。Smad1/5/8蛋白在ALK-3、Pax-8低表達(dá)引起的心肌細(xì)胞凋亡中的作用尚未知曉。本研究通過體外研究實驗來探索Smad蛋白在基因ALK-3、Pax-8下調(diào)中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌細(xì)胞株購買自中科院上海細(xì)胞庫，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。FBS、0.05%胰酶/EDTA、DMEM/F12、Hanks balanced salt solution購自Gibco；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、實時定量引物、Trizol試劑、DEPC水（RNase-free and DNase-free）購自美國Invitrogen公司；小鼠抗大鼠β-actin、抗大鼠p-Smad1/5/8抗體、HRP偶聯(lián)兔抗小鼠IgG抗體購自英國Abcam公司；PCR試劑盒（SYBRGreen Real-time PCR Master Mix）、96孔板及封板膜購自ABI公司；PMSF、RIPA、HRP偶聯(lián)山羊抗兔抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）購自江蘇海門碧云天試劑公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒、PVDF膜購自美國Millipore公司；RT試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司。酶標(biāo)儀ECX800購自Bio-TEX；流式細(xì)胞儀購自BD公司。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 siRNA的合成 大鼠ALK-3 siRNA針對ALK-3的mRNA（GenBank Accession No：NM_030849.1）序列上1741-1750位點，經(jīng)BLAST分析該序列與大鼠其他基因無明顯同源性。正義鏈：5’-CAGGGAGAAA CCACGUUAATT-3’，反義鏈：5’-UUAACGUGGUUUCUCCCU GTT-3’。大鼠Pax-8 siRNA針對Pax-8的mRNA（GenBank Accession No：NM_031141）序列上1375-1393位點，經(jīng)BLAST分析該序列與大鼠其他基因無明顯同源性。正義鏈：5’-GGAAGUGAGUAUUCUGGCATT-3’，反義鏈：5’-UGCCAGAAUACUCACUUCCTG-3’。NC siRNA為隨機合成，正義鏈：5’-UACUCCGAACGUCCACGUTT-3’，反義鏈：5’-UGUACACGACGGAGCAGTT-3’，與大鼠基因組各基因均無顯著同源性；均由上海吉瑪公司合成。

1.3 轉(zhuǎn)染條件的選擇 以不同劑量熒光標(biāo)記（由上海吉瑪公司標(biāo)記）NC siRNA，按如下分組轉(zhuǎn)染H9C2（2-1）細(xì)胞：空白對照組（僅含5.0μL Lipofectamine 2000）；5.0μL/5.0μL組（將NC siRNA與Lipofcetamin 2000各5.0μL混合）；5.0μL/7.5μL組（將7.5μL NC siRNA與5.0μL Lipofcetamin 2000混合）；7.5μL/7.5μL組（將7.5μL NC siRNA與7.5μL Lipofcetamin 2000混合）。按照以上分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后換成含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后采用倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，選擇轉(zhuǎn)染效率最高且細(xì)胞毒作用較小的組合進(jìn)行后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡拍照，計數(shù)發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)及相同視野下細(xì)胞總數(shù)，轉(zhuǎn)染效率=（綠色熒光細(xì)胞數(shù)/相同視野普通光鏡下細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.4 實驗分組及處理 轉(zhuǎn)染前1 d，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)后以1×105/孔接種至6孔板。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)50%～60%融合，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將實驗分成4組：①空白對照組；②陰性對照（NC siRNA）組；③Pax-8 siRNA組；④ALK-3 siRNA組。其中NC siRNA組、Pax-8 siRNA組及ALK-3 siRNA組分別給予相應(yīng)siRNA和Lipofectamine 2000制成的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液（比例按照上述1.3所測的最優(yōu)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行配制），空白對照組給予常規(guī)的培養(yǎng)液，未做其他處理。在37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 實時光定量PCR檢測ALK-3 mRNA、Pax-8 mRNA的表達(dá) 取上述1.4分組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并經(jīng)Dase I消化以去除基因組DNA污染。然后應(yīng)用Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以上述cDNA為模板進(jìn)行熒光實時定量PCR。熒光實時定量PCR引物，Pax-8：上游：5’-CGGCAACGCATTGTGGA-3’，下游：5’-GT CCTGGGCTCAGAGATTTGG-3’，ALK-3：上游：5’-GCTACG CAGGACAATAGAAT-3’，下游：5’-ATCTGTTTGGCAATAGTT CG-3’，GAPDH：上游：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。再利用ABI 7900 FAST型熒光實時定量PCR儀進(jìn)行定量檢測。PCR條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行歸一化，各組生物學(xué)重復(fù)三次。數(shù)據(jù)分析利用美國Biosystems公司的Sequence Detec-tionsystem（SDS）2.4軟件進(jìn)行。樣本目的基因的相對表達(dá)率（relativeexpression，RQ）采用△△CT方法計算，RQ=2-△△CT（CT表示PCR擴增過程中熒光信號強度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)），△CTsample=CTsample-CT/GAPDHsample，△CTcontrol=CTcontrol-CT/GAPDHcontrol，△△CT=△CTsample-△CTcontrol。

1.6 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后p-Smad1/5/8和Caspase-3蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用RIPA裂解細(xì)胞并提取總蛋白，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度，各組上樣蛋白質(zhì)50μg，然后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。一抗（p-Smad1/5/8 antibody 1:1 000，Caspase-3 antibody 1:1 000），4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，每次5～10 min。室溫下加入IgG抗體（1:1 000）孵育1.5 h，洗膜3次，每次5～10 min，應(yīng)用ECL發(fā)光并用DNR進(jìn)行條帶掃描，以β-actin作為內(nèi)參標(biāo)化p-Smad1/5/8和Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)，各組技術(shù)、生物學(xué)各重復(fù)3次。用QuantityOne凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過方差齊性檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，獨立的兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染NC siRNA，通過檢測發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)與同一視野下普通光鏡細(xì)胞總數(shù)的比率，測定轉(zhuǎn)染效率平均約為70%。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下細(xì)胞圖（×100）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 空白對照組為0.25%，5.0μL/5.0μL組為67.05%，5.0μL/7.5 μL組為67.60%，7.5μL/7.5μL組為69.20%。在顯微鏡下觀察細(xì)胞，獲得貼壁多、漂浮少的組別。綜合2.1結(jié)果及流式細(xì)胞計量術(shù)的結(jié)果，最后選擇siRNA5.0μL和Lipofectamine 2000 5.0μL（即5.0μL/5.0μL組）作為最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件。見圖2。

2.3 qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染Pax-8 siRNA、ALK-3 siRNA表達(dá)靶基因的表達(dá)情況 與空白對照組（1.00±0.00）相比，Pax-8 siRNA組（0.46±0.06）Pax-8 mRNA表達(dá)下調(diào)54%（P＜0.05），ALK-3 siRNA組（0.47±0.07）ALK-3 mRNA表達(dá)下調(diào)53%（P＜0.05）；與NC siRNA組（0.96±0.12）相比，Pax-8 siRNA組（0.46±0.06）Pax-8 mRNA表達(dá)下調(diào)50%（P＜0.05），ALK-3 siRNA組（0.47±0.07）ALK-3 mRNA表達(dá)下調(diào)49%（P＜0.05）；而空白對照組和NC siRNA組mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 Western blot法檢測p-Smad1/5/8蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)水平 ALK-3 siRNA組（0.45±0.05）與空白對照組（1.00±0.00）、NC siRNA組（1.03±0.16）相比，p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)（P＜0.05）；Pax-8 siRNA組（1.04±0.15）與空白對照組（1.00±0.00）、NC siRNA組（1.03±0.16）相比，p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）；而空白對照組和NC siRNA組相比，p-Smad1/5/8的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Pax-8 siRNA組（1.81±0.14）與空白對照組（1.00±0.00）、NC siRNA組（1.05±0.10）相比，Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.05）；ALK-3 siRNA組（2.4±0.17）與空白對照組（1.00±0.00）、NC siRNA組（1.05±0.10）相比，Caspase-3的蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.05）；而空白對照組和NC siRNA組相比，Caspase-3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4-5。

圖2 流式細(xì)胞計量術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率

圖3 實時定量檢測siRNA干擾效率

圖4 siRNA干擾后對p-Smad1/5/8表達(dá)的影響

圖5 siRNA干擾后對Caspase-3表達(dá)的影響

3 討論

根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可以將Smad蛋白家族分3類：第1類R-Smads（R-activated Smads），又稱為受體調(diào)節(jié)的Smad，其中包括Smad1、2、3、5、8，第2類Co-Smads（common mediator Smads），又稱為協(xié)同Smad，哺乳動物中為Smad4，第3類I-Smad（Inhibitory Smads），又稱為抑制性Smad，包括Smad6、7。Smad1/5/8蛋白與被激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，通過其MH2結(jié)構(gòu)域，與共同介導(dǎo)的Smad4相互作用，形成異聚體，然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，直接與目的基因啟動子相結(jié)合，最后影響基因表達(dá)[3-4]。Smad蛋白是唯一知道的能接受TGF-β信號受體絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白底物[5]，又稱為通路特異型信號蛋白。另外，除了C-末端的磷酸化位點外，Smad蛋白還有一個區(qū)域連接MH1和MH2，包含有4個保守的MAPK磷酸化位點，可被MAPK家族中的ERK、p38、JNK等識別[6]。近期研究表明，TGF-β可以誘導(dǎo)Smad1/5/8的信號，即骨形成蛋白可以激活Smad1/5/8，使之發(fā)生磷酸化[7-8]。

TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡，在細(xì)胞發(fā)展過程中起重要的作用[9]。TGF-β超家族成員BMPR-IA（ALK-3），在心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞分化中起重要作用[10-12]。本課題組發(fā)現(xiàn)ALK-3基因在調(diào)控心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞凋亡中起著重要作用，特異性敲除ALK-3基因可引起心肌細(xì)胞凋亡增多，從而出現(xiàn)室間隔缺損。倪秋明等[13]利用心臟特異性ALK-3敲除純合子小鼠篩選出ALK-3下游基因轉(zhuǎn)錄因子Pax-8，發(fā)現(xiàn)Pax-8在敲除基因ALK-3的純合子小鼠胚胎心臟中下調(diào)了7.1倍，并特異地表達(dá)在純合子小鼠胚胎心臟中。高瞻等[14]在大鼠心肌細(xì)胞中利用siRNA對基因Pax-8進(jìn)行干擾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞增殖受抑制。但基因ALK-3通過何種途徑對基因Pax-8進(jìn)行調(diào)控，R-Smad蛋白在其中起何種角色，以及特異性敲除ALK-3后發(fā)生細(xì)胞凋亡增多的機制尚不明確。本實驗通過建立H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌細(xì)胞株基因ALK-3和基因Pax-8干擾模型，通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)確定轉(zhuǎn)染效率，利用qRT-PCR分別檢測其mRNA表達(dá)，確定干擾效率。通過Western blot法對p-Smad1/5/8蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對基因ALK-3進(jìn)行干擾后，與空白對照組、NC siRNA組相比，出現(xiàn)p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)升高，而在對基因Pax-8進(jìn)行干擾后，與空白對照組、NC siRNA組相比，同樣出現(xiàn)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)升高，但p-Smad1/5/8蛋白表達(dá)改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上所述，特異性干擾基因ALK-3、Pax-8的表達(dá)后可以引起大鼠心肌中細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3增多，并且在基因ALK-3干擾組出現(xiàn)明顯的Smad1/5/8蛋白磷酸化減少，而同樣對基因Pax-8進(jìn)行干擾后卻未出現(xiàn)Caspase-3表達(dá)增多，提示Smad1/5/8是基因ALK-3對其下游基因Pax-8進(jìn)行調(diào)控的重要蛋白，表明Smad1/5/8蛋白在接受ALK-3基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其功能表達(dá)中起重要作用。

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