薛 屏，谷耀華，張立根，馬 原，李 鵬

（寧夏大學(xué) 省部共建天然氣轉(zhuǎn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏 銀川 750021）

精細(xì)化工

磁性固定化青霉素?；复呋鸱郑≧，S）- 2-氯苯甘氨酸甲酯

薛 屏，谷耀華，張立根，馬 原，李 鵬

（寧夏大學(xué) 省部共建天然氣轉(zhuǎn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏 銀川 750021）

將青霉素酰化酶（PGA）固定于飽和磁化率為6.5 emu/g、富含環(huán)氧基的大孔磁性聚合物微球（GM）上，所得磁性固定化酶PGA/GM用于在水相中催化（R，S）-2-氯苯甘氨酸甲酯（2-CGM）發(fā)生不對(duì)稱水解反應(yīng)；在20 ℃下反應(yīng)48 h，所得（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的對(duì)映體過(guò)量值分別為98.0%和58.8%，底物總轉(zhuǎn)化率為62.5%。PGA經(jīng)GM固定化后，催化（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)的活性和對(duì)映體選擇性均有顯著提高。PGA/GM具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)的作用下能進(jìn)行快速分離和洗滌，機(jī)械損失小；經(jīng)6次循環(huán)使用，其活性和對(duì)映體選擇性未出現(xiàn)大幅衰減。

磁性固定化青霉素酰化酶；（R，S）-2-氯苯甘氨酸甲酯；不對(duì)稱水解反應(yīng)；酶催化拆分；對(duì)映選擇性

目前全世界開(kāi)發(fā)研究的新藥中手性藥物占90%以上，非天然氨基酸是手性藥物合成的一類重要中間體［1-3］。（S）-2-氯苯甘氨酸是具有生物活性的非天然氨基酸，（S）-2-氯苯甘氨酸甲酯（2-CGM）是治療血栓性疾病新藥氯吡格雷的關(guān)鍵手性結(jié)構(gòu)單元［4-5］。氯吡格雷S-構(gòu)型的分子具有強(qiáng)的血小板凝聚抑制活性，其耐受性是R-構(gòu)型的40倍，且R-構(gòu)型用藥后會(huì)產(chǎn)生抽搐副作用［6-7］，因此氯吡格雷是以S-構(gòu)型作為藥物進(jìn)行銷售的。采用先合成氯吡格雷外消旋體，再利用（S）-樟腦磺酸進(jìn)行對(duì)映體拆分的方法［8-9］，雖能得到（S）-氯吡格雷，但浪費(fèi)了近50%的（R）-氯吡格雷。若以（S）-2-CGM直接合成（S）-氯吡格雷，既省去了手性試劑后拆分過(guò)程，又提高了原料的利用率和產(chǎn)品的質(zhì)量［10-11］。而通過(guò)化學(xué)法利用（S）-酒石酸進(jìn)行（R，S）-2-CGM的拆分［12-14］，需使用大量的手性試劑，過(guò)程繁瑣，生產(chǎn)效率低下。

脂肪酶催化拆分手性醇、酸及其衍生物已有許多研究報(bào)道［15-17］，且取得了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前青霉素?；福≒GA）已能高效表達(dá)和大批量進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)其催化作用的應(yīng)用研究主要集中于催化水解青霉素G鹽制備6-氨基青霉烷酸和催化合成新型β-內(nèi)酰胺類抗生素［18-19］，而用于動(dòng)力學(xué)拆分手性對(duì)映體的研究較少。Fadnavis等［20］利用PGA對(duì)N-苯乙?；缺礁拾彼徇M(jìn)行催化水解，獲得了光學(xué)純（S）-氯苯甘氨酸。而利用PGA催化（R，S）-2-CGM發(fā)生不對(duì)稱水解反應(yīng)，獲得（S）-2-CGM單一對(duì)映體的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本工作將PGA固定于富含環(huán)氧基的大孔磁性聚合物微球（GM）上，獲得磁性固定化酶PGA/ GM，研究了PGA/GM對(duì)（R，S）-2-CGM發(fā)生不對(duì)稱水解反應(yīng)的催化作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 酶與試劑

PGA：380 U/mL，浙江順風(fēng)海德?tīng)柟?；假單胞菌脂肪酶（PSL）：30 U/mg，Amano公司；柱狀假絲酵母脂肪酶（CCL）：4.01 U/mg，F(xiàn)luka公司；南極假絲酵母脂肪酶（CAL-B）：10.8 U/mg，F(xiàn)luka公司；（R，S）-2-氯苯甘氨酸：化學(xué)純，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；甲基丙烯酸縮水甘油酯：化學(xué)純，F(xiàn)luka公司；N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、偶氮二異丁腈：化學(xué)純，天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O：分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠；Span 60、硬脂酸鈣、二氯亞砜：化學(xué)純，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 Fe3O4磁粉的制備

Fe3O4磁粉的制備采用共沉淀法：將摩爾比1∶2的FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O溶于去離子水中，攪拌下滴入濃氨水至pH為8.5，于60 ℃下熟化30 min后過(guò)濾，固體用去離子水洗滌4次后于60 ℃下真空干燥，得到黑色Fe3O4磁粉。

1.3 GM的制備和表征

1.3.1 GM的制備

在裝有溫度計(jì)、恒速攪拌器、回流管及導(dǎo)氣管的四頸瓶中加入110 mL正庚烷和40 mL四氯乙烯，攪拌下加入硬脂酸鈣和Span 60復(fù)合表面活性劑（二者質(zhì)量比20∶1），混合均勻。在甲酰胺分散0.6 g Fe3O4磁粉的體系中加入2.5 mL甲基丙烯酸縮水甘油酯和4.0 g N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，混合均勻后轉(zhuǎn)移至四口燒瓶中。在60 ℃水浴加熱、氮?dú)獗Ｗo(hù)及偶氮二異丁腈引發(fā)下反應(yīng)5 h。停止反應(yīng)后在磁場(chǎng)中沉降分離出小球。小球用丙酮洗滌后，室溫真空干燥至恒重，得到GM。

1.3.2 GM的表征

SEM表征采用JEOL公司JSM-6360LV型掃描電子顯微鏡，測(cè)試前試樣進(jìn)行噴金處理；TEM表征采用JEOL 公司JME-2010型透射電子顯微鏡，測(cè)試前試樣在聚乙烯醇水溶液中超聲波振蕩分散處理后，取液滴于噴有炭膜的銅網(wǎng)上并進(jìn)行干燥；比表面積、平均孔徑和孔體積的測(cè)定采用Micromeritics公司ASAP-2010型自動(dòng)物理吸附分析儀，N2吸附質(zhì)，測(cè)定前試樣在50 ℃下真空脫氣10 h；磁化曲線采用Lake Shore 公司7304型振動(dòng)試樣磁強(qiáng)計(jì)（VSM）測(cè)定，磁場(chǎng)強(qiáng)度范圍（-1.6～1.6）×106A/ m；表面環(huán)氧基團(tuán)的含量采用硫代硫酸鈉滴定法［21］測(cè)定。

1.4 PGA/GM的制備

稱取0.1 g GM，用去離子水潤(rùn)濕、溶脹、吸去表面水后，依次加入2.0 mL pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液和0.2 mL PGA溶液，于轉(zhuǎn)速100 r/min的水浴搖床中30 ℃下反應(yīng)72 h，制備PGA/GM。在磁場(chǎng)中分離出PGA/GM并用去離子水洗至分離液中檢不出蛋白質(zhì)，然后將PGA/GM浸泡于pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液中儲(chǔ)于冰箱（4 ℃）中備用。

1.5 （R，S）-2-CGM的合成與水解反應(yīng)

1.5.1 （R，S）-2-CGM的制備

在裝有攪拌器、溫度計(jì)和恒壓滴液漏斗的三口燒瓶中加入100 mL甲醇和18.5 g （R，S）-2-氯苯甘氨酸，攪拌下冰水浴冷卻至0 ℃，滴加13 mL的二氯亞砜，緩慢加熱至50 ℃，攪拌下恒溫反應(yīng)6 h；減壓蒸餾出過(guò)量的甲醇和二氯亞砜，剩余物用甲醇-乙醚二元溶劑進(jìn)行重結(jié)晶得到（R，S）-2-氯苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽白色晶體，在晶體中加入適量的飽和碳酸氫鈉水溶液至pH=8，靜置2 h后分液，用二氯甲烷溶劑萃取后減壓蒸餾得到淺黃色液體（R，S）-2-CGM。

采用Bruker公司Advance Ⅲ型核磁共振儀（400 MHz）對(duì)制備的（R，S）-2-CGM進(jìn)行NMR分析確認(rèn)。1H NMR（CDCl3）分析結(jié)果：化學(xué)位移δ=7.39～7.24（4H，m，ArH），5.01（1H，s，CH），3.72（3H，s，CH3），1.98（2H，s，NH2）；13C NMR（CDCl3）分析結(jié)果：δ=173.9，138.1，133.3，129.9，129.2，128.5，127.4，56.1，52.3。

1.5.2 （R，S）-2-CGM的水解反應(yīng)

在50 mL反應(yīng)器中依次加入0.1 g （R，S）-2-CGM、10 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L，pH=7.8）和0.1 g PGA/GM，置于一定溫度的水浴搖床中在轉(zhuǎn)速120 r/min下進(jìn)行反應(yīng)，一定時(shí)間后在磁場(chǎng)中分離出PGA/GM結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)液由裝有進(jìn)口手性柱Daicel CrownpackCR（+）的FL-2200-2型高效液相色譜儀（浙江福立分析儀器有限公司）進(jìn)行分析，波長(zhǎng)220 nm。

（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的對(duì)映體過(guò)量值分別用ees和eep表示，計(jì)算方法見(jiàn)式（1）和式（2）：式中，cSS和cRS分別為（S）-2-CGM和（R）-2-CGM的濃度，mol/L；cRP和cSP分別為（R）-2-氯苯甘氨酸和（S）-2-氯苯甘氨酸的濃度，mol/L。

底物總轉(zhuǎn)化率（X）和對(duì)映選擇性參數(shù)（E）值分別按式（3）和式（4）計(jì)算［22］：

2 結(jié)果與討論

2.1 GM的特性

在GM的形成過(guò)程中，單體甲基丙烯酸縮水甘油酯的雙鍵發(fā)生聚合反應(yīng)，絕大多數(shù)的環(huán)氧基團(tuán)保留在GM表面和體相［23］，利用硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定GM表面環(huán)氧基團(tuán)含量為0.61 mmol/g。經(jīng)低溫N2吸附法測(cè)定，GM具有多孔結(jié)構(gòu)，比表面積為136 m2/g，平均孔徑和孔體積分別為28.2 nm和0.50 m3/g。

GM的SEM和TEM照片見(jiàn)圖1。由圖1a可知，制備的GM呈很好的球形，微球之間不粘連且分布較均勻，球徑主要在100～200 μm內(nèi)。由圖1b可看出，GM中Fe3O4顆粒大小在10 nm左右，其周圍包裹著聚合物層。

圖1 GM的SEM（a）和TEM（b）照片F(xiàn)ig.1 SEM（a） and TEM（b） images of GM.

VSM測(cè)定結(jié)果表明，GM具有超順磁性，飽和磁化率為6.43 emu/g。由于GM中的Fe3O4顆粒被分散包埋在甲基丙烯酸縮水甘油酯與N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)聚合的網(wǎng)絡(luò)中，削弱了Fe3O4顆粒之間的磁相互作用力，致使GM用作酶固定化載體以及制備的PGA/GM在使用過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)磁聚集現(xiàn)象。

2.2 不同酶催化性能的比較

脂肪酶和PGA均屬于水解酶，二者對(duì)酯類的水解反應(yīng)均具有活性。在相同的反應(yīng)條件下，對(duì)PGA和幾種脂肪酶水解（R，S）-2-CGM的催化性能進(jìn)行了對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

水解產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，來(lái)自不同菌種的脂肪酶PSL，CCL，CAL-B，在20 ℃時(shí)均能催化（R，S）-2-CGM發(fā)生水解反應(yīng)。反應(yīng)48 h時(shí)，90%以上的（R，S）-2-CGM發(fā)生了水解反應(yīng)轉(zhuǎn)化為（R，S）-2-氯苯甘氨酸，其中，底物（S）-2-CGM優(yōu)先水解，但生成的S-構(gòu)型與R-構(gòu)型的2-氯苯甘氨酸的數(shù)量相差很?。ㄇ罢呗远嘤诤笳撸?，剩余底物（R，S）-2-CGM中S-構(gòu)型與R-構(gòu)型的含量十分接近。這意味著PSL，CCL，CAL-B這3種脂肪酶雖均能催化（R，S）-2-CGM發(fā)生水解反應(yīng)，但對(duì)（R）-2-CGM和（S）-2-CGM的識(shí)別性很低，導(dǎo)致S-構(gòu)型與R-構(gòu)型的底物均發(fā)生了反應(yīng)，水解反應(yīng)的對(duì)映選擇性低。由表1可看出，（S）-2-CGM的ees和（R）-2-氯苯甘氨酸的eep均呈負(fù)值，且絕對(duì)值均低于3%。

表1 幾種酶對(duì)（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)的催化性能Table 1 Catalytic performances of several enzymes for the hydrolysis of （R，S）-2-chlorophenyl glycine methyl ester（2-CGM）

由表1還可看出，與脂肪酶不同，PGA優(yōu)先催化底物中的（R）-2-CGM發(fā)生水解，且對(duì)兩種構(gòu)型2-CGM底物的對(duì)映體選擇性遠(yuǎn)高于脂肪酶。游離酶PGA在20 ℃下催化水解反應(yīng)48 h時(shí)，（S）-2-CGM的ees為50.4%，（R）-2-氯苯甘氨酸的eep為23.5%，這說(shuō)明PGA能很好地識(shí)別不同構(gòu)型的2-CGM底物，主要是優(yōu)先選擇性地催化（R）-2-CGM發(fā)生水解反應(yīng)。PGA經(jīng)GM固定化后，其水解活性和對(duì)映體選擇性均得到大幅提高，在相同的反應(yīng)條件下，PGA/GM催化（R，S）-2-CGM發(fā)生水解反應(yīng)，（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的ees和eep分別為98.0%和58.8%，E值為9.4，底物總轉(zhuǎn)化率為62.5%。

2.3 水解反應(yīng)條件的優(yōu)化

在不同溫度下進(jìn)行水解反應(yīng)，測(cè)定不同時(shí)間內(nèi)PGA/GM催化（R，S）-2-CGM發(fā)生水解反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率以及生成（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的ees和eep，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，升高水解溫度或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，（R）-2-氯苯甘氨酸的eep均呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明PGA/GM對(duì)兩種構(gòu)型2-CGM底物的識(shí)別性隨反應(yīng)溫度的升高或反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱，其原因可能是在相對(duì)較高的溫度或較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，酶的剛性結(jié)構(gòu)變得柔韌，導(dǎo)致其對(duì)映體選擇性下降［24］。

表2 反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)PGA/GM催化（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)的影響Table 2 Effects of reaction temperature and time on enantioselectivity of the asymmetric hydrolysis of （R，S）-2-CGM with the PGA/GM catalyst

從目標(biāo)產(chǎn)物（S）-2-CGM的ees變化可看出，控制反應(yīng)時(shí)間在36 h以內(nèi)時(shí)，反應(yīng)溫度由10 ℃升至30 ℃，（S）-2-CGM的ees逐漸增大。這是由于升高反應(yīng)溫度提高了PGA/GM催化（R）-2-CGM水解反應(yīng)的速率。但在30 ℃下反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（36 h以上）時(shí)，PGA/GM的對(duì)映體選擇性下降，導(dǎo)致（S）-2-CGM的ees下降，反而不利于（S）-2-CGM光學(xué)純度的提高。綜合考慮反應(yīng)溫度和時(shí)間等因素，利用PGA/GM催化（R，S）-2-CGM發(fā)生不對(duì)稱水解反應(yīng)的適宜條件為20 ℃和48 h時(shí)，在此條件下可獲得ees為98.0%的（S）-2-CGM。

2.4 PGA/GM的穩(wěn)定性

在優(yōu)化的反應(yīng)時(shí)間和溫度下，將PGA/GM重復(fù)用于（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)，每次反應(yīng)后在磁場(chǎng)中分離出PGA/GM，用0.1 mol/L、pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次后，再次用于（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)，重復(fù)使用6次（使用間歇時(shí)可在4 ℃下儲(chǔ)存），考察PGA/GM的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，PGA/GM重復(fù)使用6次后所得（S）-2-CGM的ees仍達(dá)93.2%，呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。這是由于Fe3O4磁性粒子分散包埋于GM中，使PGA/GM在使用中不存在磁性物質(zhì)普遍存在的自聚現(xiàn)象。GM表面存在大量的環(huán)氧基團(tuán)和強(qiáng)親水性的酰胺基團(tuán)，它們?yōu)镻GA/GM催化水解反應(yīng)的活性和對(duì)映體選擇性的發(fā)揮提供了適宜的微環(huán)境。GM借助自身的活性環(huán)氧基團(tuán)共價(jià)結(jié)合固定PGA，使PGA與載體結(jié)合相對(duì)牢固，在磁場(chǎng)作用下PGA/GM快速沉降，經(jīng)多次使用并經(jīng)分離洗滌幾乎沒(méi)有機(jī)械操作損失。由此可見(jiàn)，PGA經(jīng)GM固定化后，不僅活性和對(duì)映體選擇性得到了提高，同時(shí)具備很好的穩(wěn)定性，可重復(fù)用于（R，S）-2-CGM的水解反應(yīng)。

圖2 PGA/GM的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of PGA/GM.

3 結(jié)論

1） PGA催化（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)時(shí)，優(yōu)先催化底物中的（R）-2-CGM發(fā)生水解反應(yīng)；PGA經(jīng)GM固定化后，其活性和對(duì)映體選擇性均得到大幅提高。

2）利用PGA/GM催化（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)，是一種環(huán)境友好的制備氯吡格雷關(guān)鍵手性中間體（S）-2-CGM的新方法，在20 ℃下反應(yīng)48 h，所得（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的ees和eep分別為98.0%和58.8%，底物總轉(zhuǎn)化率達(dá)62.5%。

3）PGA/GM重復(fù)用于（R，S）-2-CGM水解反應(yīng)，在磁場(chǎng)作用下分離和洗滌后循環(huán)使用6次，所得（S）-2-CGM的ees仍達(dá)93.2%，呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，具有工業(yè)化應(yīng)用前景。

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（編輯 安 靜）

Enzymatic Resolution of (R,S)-2-Chlorophenyl Glycine
Methyl Ester with Magnetically Immobilized Penicillin G Acylase

Xue Ping，Gu Yaohua，Zhang Ligen，Ma Yuan，Li Peng
（State Key Laboratory Cultivation Base of Natural Gas Conversion，Ning Xia University，Yinchuan Ningxia 750021，China）

Penicillin G acylase(PGA) was immobilized on self-made magnetic polymer microspheres(GM) with epoxy groups，macropores and saturation magnetization of 6.5 emu/g to prepare the PGA/GM magnetic immobilized enzyme. The kinetic resolution of racemic (R，S)-2-chlorophenyl glycine methyl ester(2-CGM) through the hydrolysis catalyzed by PGA/GM were investigated. The enantiomeric excess values of (S)-2-CGM and (R)-2-chlorophenyl glycine were 98.0% and 58.8% respectively，and the conversion of (R，S)-2-CGM were 62.5% in the enzymatic hydrolysis under the conditions of 20 ℃ and 48 h. It was observed that the activity and enantioselectivity of PGA for the asymmetric hydrolysis of (R，S)-2-CGM were improved signif cantly by the immobilization. The immobilized enzyme could be recovered easily without mechanical loss and considerably kept its initial activity and enantioselectivity after it was reused six times.

magnetically immobilized Penicillin G acylase；(R，S)-2-chlorophenyl glycine methyl ester； asymmetric hydrolysis； enzymatic resolution； enantioselectivity

1000 - 8144（2014）11 - 1284 - 06

TQ 426.97

A

2014 - 05 - 21；［修改稿日期］ 2014 - 07 - 23。

薛屏（1962—），女，內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林浩特市人，博士，教授，電話 0951 - 2062835，電郵 ping@nxu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21263020）；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃前期研究專項(xiàng)項(xiàng)目（2012CB723106）。