潘嘉慧 田 峻 趙亮亮 沈國權(quán) 朱海云

（佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東佛山 528225）

膠體金免疫層析法快速檢測(cè)食品和獸藥中的氯霉素殘留

潘嘉慧 田 峻 趙亮亮 沈國權(quán) 朱海云

（佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東佛山 528225）

1 引言

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗生素，其抗菌效果好，價(jià)格低廉，曾廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病。然而氯霉素具有嚴(yán)重的毒副作用，會(huì)引起動(dòng)物機(jī)體正常菌群失調(diào)，同時(shí)可能引起人的再生障礙性貧血，粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病。

歐盟2377/90/EEC法規(guī)、美國FDA、日本的“肯定列表制度”等均明確規(guī)定氯霉素不能在任何動(dòng)物制食品，以及動(dòng)物的飼料和生長環(huán)境中使用。2002年我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留量》，規(guī)定氯霉素及其鹽、酯（包括：琥珀氯霉素）在所有食品動(dòng)物、所有可食組織中不得檢出。

對(duì)氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法有色譜分析法和免疫檢測(cè)法。色譜分析法需要先進(jìn)檢測(cè)設(shè)備、樣品前處理步驟繁瑣，費(fèi)用高、耗時(shí)長、對(duì)操作人員要求較高。免疫分析法具有快速、靈敏度高、高通量的特點(diǎn)。其中免疫分析方法有酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析技術(shù)等。酶聯(lián)免疫分析法操作相對(duì)繁瑣，對(duì)操作人員的專業(yè)知識(shí)要求較高，相比之下，膠體金免疫層析技術(shù)基于肉眼水平的檢測(cè)，不需任何儀器設(shè)備和試劑，比酶聯(lián)免疫法省略了加顯色劑和終止液的步驟，更簡(jiǎn)化的操作，體積小，易攜帶，幾分鐘就可用肉眼觀察到顏色鮮明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并可保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

近年來已有制備氯霉素膠體金免疫層析試紙條的報(bào)道，但仍存在適用樣品單一、靈敏度不夠等不足，本研究特別從優(yōu)化免疫抗原、包被抗原的結(jié)構(gòu)及優(yōu)化偶聯(lián)技術(shù)角度出發(fā)，提高抗體的特異性、親和力，從而增加檢測(cè)的靈敏度和特異性。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

氯霉素、氯金酸、檸檬酸三鈉、6-氧代己酸、甲基磺酸、二甲基甲酰胺（Nimethylformamide，DMF）、3-磷酰化二苯酯苯并[D]噁唑-2-酮[2（3H）- Benzoxazolone，3-（diphenoxyphosphinyl）-（9CI），DPBO]、苯并噻唑硫酮（Benzothiazolethione，BTT）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）：美國Sigma公司；羊抗鼠IgG、硝酸纖維素膜（NC膜）和金標(biāo)墊，樣品墊，PVC底板，吸水紙：上海杰一生物技術(shù)有限公司。

2.2 儀器與設(shè)備

Avanti 高速冷凍離心機(jī)：美國Beckman公司；UV-2700紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Ultra Genetic超純水系統(tǒng)：英國ELGA公司；JY-EQ08劃膜噴金一體機(jī)：上海杰一生物有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 氯霉素半抗原的合成

圖1 氯霉素（a）及其半抗原（b）、免疫抗原/包被抗原（c）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 氯霉素（a）及其半抗原（b）、免疫抗原/包被抗原（c）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

將200ml的環(huán)己烷加入到250ml裝有分水器的圓底燒瓶中，依次加入氯霉素（32.3g，0.1mol，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1a所示）、6-氧代己酸（15.6g，0.12mol）和甲基磺酸（0.95g，0.01mol），加熱回流，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)生成的水沉在分水器的底部，繼續(xù)加熱回流，直至分水器中沒有新的反應(yīng)水沉降為止，停止加熱。自然冷卻反應(yīng)液至室溫，靜置過夜。抽濾，濾餅用環(huán)己烷洗滌兩次，50℃干燥5h后得到40.4g含有羧基的氯霉素衍生物，即氯霉素半抗原（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1b所示）。反應(yīng)式如圖2所示。

2.3.2 氯霉素免疫抗原和包被抗原的合成

取氯霉素半抗原1.0mmol溶于30mL的DMF中，冷卻至0～4℃，攪拌下加入351mg的DPBO和167mg的BTT，保溫反應(yīng)過夜。加入100mL 10%碳酸氫鈉溶液和100ml水，繼續(xù)攪拌1h，抽濾，濾餅用水洗滌（50mL×2）后用20mL DMF溶解為A液。稱取2.0g BSA 溶于200ml的濃度為1.0mol/L的PBS（pH=8）中，加入5ml DMF，在0～5℃下攪拌溶解為B液，將上述A液緩慢滴加到B液中，保溫反應(yīng)8h，離心取上清液，4℃下用生理鹽水恒溫透析3d，每天更換3次透析液，冷凍干燥后得到免疫抗原。用OVA代替BSA，同樣方法制備包被抗原。

2.3.3 氯霉素單克隆抗體的制備

用氯霉素免疫抗原多次免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）在體外融合形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選，得到陽性雜交瘤細(xì)胞株。將其注入小鼠腹腔獲取腹水，或利用體外細(xì)胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)上清液等方式，制備氯霉素單克隆抗體。用硫酸銨沉淀法純化該抗體，并與等體積甘油混合，低溫保存。

2.3.4 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金：于100ml超純水中加入1ml1%的檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入1ml1%氯金酸溶液，待溶液顏色變?yōu)槌吻寰萍t色時(shí)，繼續(xù)加熱10min，冷卻至室溫后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.5 膠體金標(biāo)記氯霉素單克隆抗體的制備

量取膠體金溶液10ml，將其pH值調(diào)整到9.5，攪拌并緩慢加入氯霉素單克隆抗體0.45mg進(jìn)行標(biāo)記，持續(xù)攪拌30min后，逐滴加入20%的BSA溶液終止反應(yīng)，持續(xù)攪拌1h。4℃下10000 r/mim離心40min，小心棄去上清，取沉淀用金標(biāo)緩沖液溶解至1ml備用。

2.3.6 膠體金免疫層析試紙條的制備和組裝

使用劃膜噴金一體機(jī)將制備好的金標(biāo)抗體均勻噴涂到金標(biāo)墊上，噴金參數(shù)4μl/cm，37℃真空干燥8h備用。將適當(dāng)濃度的包被抗原（氯霉素-OVA偶聯(lián)物）包被到NC膜的檢測(cè)線（T線）位置，羊抗鼠IgG包被到質(zhì)控線（C線）位置，包膜參數(shù)1.0μl/cm，晾干備用。將干燥好的樣品墊，金標(biāo)墊，NC膜，吸水紙，按順序粘貼到PVC底板上，切割成條，組裝成卡，分裝到鋁箔袋，袋內(nèi)裝入干燥劑，密封保存。

2.3.7 樣品前處理、檢測(cè)及判讀

（1）樣品前處理

①蝦、蟹、魚肉組織：取4g已攪碎的待測(cè)樣品于15ml離心管中。加入8ml乙酸乙酯，劇烈震蕩混合2min。以離心機(jī)2300×g（3500rpm）離心5min，取上層有機(jī)相6ml至玻璃管中，于60℃下，利用氮吹儀或電吹風(fēng)將有機(jī)溶劑吹干（注：電吹風(fēng)不要用強(qiáng)熱風(fēng)，以免溫度過高）。加入400μlPBST及600μl正己烷回溶，震蕩混合。以離心機(jī)離心2300×g（3500rpm）10min，吸取最少150μl下層有機(jī)相待測(cè)，或繼續(xù)使用C18固相萃取柱凈化。

②雞、豬肉組織：取5g已攪碎的待測(cè)樣品于50mL離心管中。加入10mL 0.15N（pH值調(diào)整至11.4）的NaOH，震蕩混合均勻2分鐘。以離心機(jī)離心2300×g（3500rpm）10分鐘，取上層液（NaOH）8ml至另一50ml離心管中并加入12ml二氯甲烷，輕搖混合（避免劇烈震蕩）。以離心機(jī)離心2300×g（3500rpm）5分鐘，取下層液（二氯甲烷）7mL至玻璃管中，于60℃ 下，利用氮吹儀或電吹風(fēng)將有機(jī)溶劑吹干（注：電吹風(fēng)不要用強(qiáng)熱風(fēng)，以免溫度過高）。加入300μL PBST 及加入600μL正己烷回溶，震蕩混合。以離心機(jī)離心2300×g（3500rpm）10分鐘，吸取最少150μL下層液待測(cè)，或繼續(xù)使用C18固相萃取柱凈化。

③蜂蜜、牛奶：稱取4g 試樣于15ml 離心管中，加入2ml 蒸餾水振蕩充分溶解。加入8ml 乙酸乙酯，震蕩混合8min，離心或靜置分層，轉(zhuǎn)移 5ml上層有機(jī)相于試管中，氮吹儀或電吹風(fēng)干。加入 160μl PBST溶解管壁殘?jiān)?，再加?1ml 正己烷充分振蕩后靜置分層，吸取下層水相進(jìn)行待檢。

（2）樣品檢測(cè)

撕開鋁箔包裝，取出檢測(cè)卡。取滴兩滴檢體（約75μl）于加樣孔中，等待檢體吸附移動(dòng)至測(cè)試區(qū)中，等待5min后即可判讀結(jié)果。

（3）結(jié)果判讀

①陰性結(jié)果：T線比C線深或一樣深，表示檢品氯霉素濃度低于0.1μg/kg。

②陽性結(jié)果：T線比C線淡或幾乎看不見，表示檢品氯霉素濃度高于或等于0.1μg/kg（包括看不到T線）。

③無效結(jié)果：如果測(cè)試結(jié)果未出現(xiàn)任何色帶或是C線未出現(xiàn)，此時(shí)表示此試劑已失效、過期或操作不當(dāng)，需另做一次測(cè)試。

3 結(jié)果與討論

3.1 氯霉素半抗原、免疫原/包被原的制備

氯霉素的分子較小，分子量為323.14，不具有免疫原性，需要與載體蛋白偶聯(lián)后方能具有免疫原性；然而氯霉素是一個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)上沒有羧基和氨基的半抗原，它本身無法與蛋白偶聯(lián)，而往往需要使用與氯霉素具有相同抗原決定簇的琥珀氯霉素作為半抗原，或合成其他衍生物作為半抗原[1]，然后與載體蛋白偶聯(lián)才能成為全抗原。

當(dāng)前已報(bào)道的氯霉素全抗原的合成方法主要有：通過琥珀氯霉素上的羧基與蛋白偶聯(lián)的混酸酐法[2]、碳二亞胺法[3]；還原苯環(huán)上硝基后偶聯(lián)的重氮化法[4]，羰基二咪唑法和戊二醛法[5]。混合酸酐合成法操作繁雜，中間過程損失較大，且涉及到劇毒藥品氯甲酸乙酯；重氮化法利用的是氯霉素抗原苯環(huán)上的-NO2，影響氯霉素抗原的免疫原性。戊二醛法易造成載體蛋白之間偶聯(lián)；羰基二咪唑法法反應(yīng)體系少水，易導(dǎo)致載體蛋白變性。

本研究特別從半抗原、免疫原/包被原的結(jié)構(gòu)出發(fā)，采用全新的連接臂，優(yōu)化偶聯(lián)技術(shù)和合成路線，同時(shí)保證檢測(cè)特異性和靈敏度。本研究中的氯霉素半抗原保留了氯霉素的抗體識(shí)別部位：對(duì)硝基苯基部分，從遠(yuǎn)離特征結(jié)構(gòu)、免疫原性最弱的羥基端引入間隔臂，提高了半抗原的免疫原性，同時(shí)保留氯霉素的骨架結(jié)構(gòu)，提高特異性，確保半抗原不受蛋白的屏蔽作用；引入的間隔臂具有一定的長度和適當(dāng)?shù)臉O性，將載體蛋白對(duì)小分子的電子排布和空間結(jié)構(gòu)的影響降到最低；合成的半抗原有利于提高半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比，并且能更好地暴露半抗原的抗原決定簇。在免疫分析中，通過對(duì)半抗原連接位點(diǎn)，連接臂長度，結(jié)構(gòu)等進(jìn)行合理選擇與搭配，可以有效地利用可預(yù)測(cè)的交叉反應(yīng)，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)某一族化合物的目的，并且可以抑制不可預(yù)測(cè)的交叉反應(yīng)，提高檢測(cè)的特異性。

3.2 膠體金納米顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

膠體金納米顆粒的粒徑大小與膠體金探針穩(wěn)定性密切相關(guān)。將制備好的膠體金溶液經(jīng)紫外-可見光分光光度計(jì)在400～700nm波長處掃描，測(cè)定吸收?qǐng)D譜，結(jié)果見圖3。由圖3可看出，膠體金溶液在525nm出現(xiàn)最大吸收峰，OD525nm=1.82，顆粒大小約為30nm，符合膠體金免疫層析法中膠體金顆粒大小的要求。

圖3

3.3 抗原包被濃度的優(yōu)化

以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5μg/L進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化調(diào)整抗原的包被濃度。分別選擇包被濃度為0.70，0.75，0.80，0.85mg/ml進(jìn)行測(cè)試選擇。取75μl氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品孔中，溶液沿吸水紙方向移動(dòng)。首先與金標(biāo)墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合，并一同繼續(xù)向吸水紙方向移動(dòng)，到達(dá)T線區(qū)域。在T線處，溶液中的氯霉素與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)抗體，溶液中的氯霉素濃度一定，則包被抗原濃度越大，能夠與包被抗原相結(jié)合的金標(biāo)抗體的量越多，膠體金的顏色（紅色）越深。由圖3可看出，隨著包被濃度的增大，T線顏色越深，到0.80mg/ml達(dá)到最佳濃度，濃度再增加時(shí)顏色基本不變，因此確定最佳膜包被濃度為0.8mg/ml。

3.4 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)氯霉素的檢出限

配制濃度為0.05，0.08，0.1，0.2μg/L氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取75μl標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品墊中，層析結(jié)束后觀察結(jié)果。結(jié)果表明，隨著氯霉素的濃度升高，在C線區(qū)膠體金顏色強(qiáng)度相對(duì)增大，在T線區(qū)膠體金顏色則逐漸變淺，在0.08μg /L時(shí)T線顏色明顯變淺，在0.10μg/L時(shí)T線顏色完全消失。則將T線顏色基本完全消失所對(duì)應(yīng)的濃度定義0.10μg/L為膠體金免疫層析法的檢出限，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法中使用色譜檢測(cè)的測(cè)定低限相當(dāng)，但相比之下膠體金檢測(cè)試紙條的價(jià)格等優(yōu)勢(shì)不言而喻。

3.5 膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)氯霉素的特異性

抗體的特異性是衡量抗體質(zhì)量的重要指標(biāo)。選取了6種氯霉素結(jié)構(gòu)相似物（甲砜霉素、氟甲砜霉素、青霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素）進(jìn)行特異性試驗(yàn)，添加濃度均為10μg/L，T線顯色明顯，即均為陰性，而氯霉素陽性對(duì)照試液只有C線顯色，T線不顯色，顯示為強(qiáng)陽性，表明本試驗(yàn)研制的氯霉素膠體金試紙條特異性表現(xiàn)良好，與測(cè)試的6種類似物均沒有交叉反應(yīng)現(xiàn)象。

3.6 樣品前處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

樣品前處理是指樣品的制備以及對(duì)樣品中氯霉素殘留進(jìn)行提取，凈化以及濃縮富集的過程。目的是消除基質(zhì)影響，提高檢測(cè)方法敏感度以及準(zhǔn)確度。在檢測(cè)過程中樣品的前處理即小分子的充分提取是否得當(dāng)不僅直接影響檢測(cè)結(jié)果，而且前處理方法的改善對(duì)提高試紙條檢測(cè)體系的靈敏度也具有重要意義和直接影響。目前檢測(cè)氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)中均提及用固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理，相應(yīng)產(chǎn)品包括：C18柱，硅膠柱，弗羅里硅土柱，PRS（丙磺酸）交換柱，HLB（混合型強(qiáng)陽離子）柱。本研究針對(duì)各類肉類組織、蜂蜜、牛奶等樣品設(shè)計(jì)出不同的提取方案，并分別用C18固相萃取柱進(jìn)行凈化，以探討固相萃取凈化對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。從下表中可看出：

（1）對(duì)于蝦、蟹、魚肉組織和牛奶樣品，當(dāng)加標(biāo)濃度為0.1μg/kg時(shí)，無論前處理是否經(jīng)過固相萃取柱凈化，試紙條的T線均不顯色；當(dāng)加標(biāo)濃度為0.3μg/kg時(shí)，提取物不經(jīng)過固相萃取柱凈化，試紙條的T線不顯色，提取物經(jīng)過固相萃取柱凈化，試紙條的T線顯色；當(dāng)加標(biāo)濃度為0.5μg/kg時(shí)，無論前處理是否經(jīng)過固相萃取柱凈化，試紙條的T線均顯色。

（2）對(duì)于蜂蜜樣品，當(dāng)加標(biāo)濃度為0.1μg/kg時(shí)，提取物不經(jīng)過固相萃取柱凈化，試紙條的T線隱約可見，經(jīng)過固相萃取柱凈化，試紙條的T線顯色明顯。

樣品蝦、蟹、魚肉組織雞、豬肉組織蜂蜜牛奶0.1不凈化－－±－凈化－－＋－0.3不凈化－－＋－凈化＋＋＋＋0.5不凈化＋＋＋＋凈化＋＋＋＋加標(biāo)濃度（μg/kg）前處理方法4

4 結(jié)論

近年來膠體金免疫層析技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品安全快速診斷領(lǐng)域。本研究通過優(yōu)化偶聯(lián)技術(shù)路線，以達(dá)到結(jié)構(gòu)優(yōu)化，提高抗體質(zhì)量，從而進(jìn)一步增加氯霉素免疫膠體金快速檢測(cè)的靈敏度和特異性的免疫抗原和包被抗原。本實(shí)驗(yàn)成功研制出氯霉素快速檢測(cè)試紙條，靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，除了樣本預(yù)處理外的測(cè)試時(shí)間僅需五分鐘，與ELISA方法相比，快速、簡(jiǎn)便、成本低，可操作性強(qiáng)，為廣大的動(dòng)物源性食品加工企業(yè)、檢測(cè)部分現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等提供了一種有效、便利的方法，值得推廣。

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