管玉成 李靜

金刷把為松蘿科植物金絲刷Lethariella cladonioides（Nyl.）Krog的枝狀體，苦，平；鎮(zhèn)靜，消炎，止痛。主治癲癇、精神分裂、神經(jīng)衰弱、頭目眩暈等癥；主產(chǎn)于陜西、四川、安徽、西藏、云南、河南等省，著生于海拔3000米以上枯木上。是陜西民間常用中草藥[1]，臨床應(yīng)用廣泛，歷史悠久。

金刷把作為地衣類藥材，含有地衣酸、地衣多糖及多種微量元素等。其中地衣多糖和異地衣多糖作為地衣菌絲細胞壁的主要成分是所有地衣都含有的化學(xué)成分[2]。從20世紀(jì)70年代以來對地衣多糖的抗腫瘤活性研究實驗證明，絕大多數(shù)地衣種類中所含的地衣多糖均具有極高的抗癌活性，特別值得重視的是地衣多糖的抗癌機理，不是直接殺傷細胞來抑制癌細胞的病態(tài)增殖，而是通過增強宿主的免疫防御系統(tǒng)來發(fā)揮作用的[3-9]。它可以激活機體內(nèi)的巨噬細胞，被激活的巨噬細胞不損傷健康細胞，只溶解、破裂或吞噬癌細胞。因而克服了在化療中健康細胞受損的嚴重副作用，既所謂的“中間宿主免疫性”[10-11]。金刷把具有藥物及食品保健的開發(fā)潛力，但以往由于缺乏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其臨床應(yīng)用受到很大限制，因此本實驗建立了一種分光光度法測定金刷把多糖含量的測定方法，為制定金刷把藥材標(biāo)準(zhǔn)和進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 AR1140型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），科偉恒溫水浴鍋（余姚長豐儀表廠）；雙光束紫外分光光度計UV-2550型（日本島津）；離心機Z200A型（德國Laboriechnik公司）；SHZ-3型循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市英峪儀器廠）；SB 3200 DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；乙醇、濃硫酸、蒽酮等均為分析純；無水葡萄糖對照品（38075-200709）；藥材采自陜西省寶雞市太白山，由西安市藥檢所鑒定。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品溶液 精確稱取于105 ℃干燥至恒重的無水葡萄對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并稀釋至刻度，再精密吸取10 mL置100 mL量瓶中稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

1.2.2 硫酸-蒽酮溶液的制備 精密稱取蒽酮0.10 g，放入100 mL棕色容量瓶中，逐漸加入濃硫酸溶液至刻度，搖勻使溶解完全，冷卻至室溫備用，注意避光保存。

1.2.3 供試品溶液的制備 稱取破碎后的金刷把1 g，放置于500 mL圓底燒瓶中，加50倍量水，置沸水浴中回流提取3次，每次提取1.5 h，趁熱用布氏漏斗抽濾，合并濾液。濾液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取10 mL，加95%乙醇60 mL，搖勻，放置于4 ℃下靜置24 h，離心，傾去上層液體，沉淀加水充分溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容搖勻。精密量取2.5 mL置25 mL容量瓶中，定容搖勻作為待測溶液。

2 方法及結(jié)果

2.1 測定波長的選擇 分別精確吸取2 mL葡萄糖對照品溶液和試品溶液分別置2只具塞試管中，并加入蒽酮-硫酸試劑6 mL，充分振搖后靜置10 min，再放入冰水浴中冷卻10 min，取出。另以未加葡萄糖的溶液為空白液，于400~700 nm波長范圍掃描。測得對照品和樣品的最大吸收波長均為630 nm，故選擇630 nm波長測定。

2.2 硫酸用量的選擇 精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL，分別置于具塞試管中，并加入蒽酮-硫酸試劑4.0、6.0、8.0 mL，充分振搖后靜置10 min，再放入冰水浴中冷卻10 min，取出。在分光光度儀上630 nm處測定吸光度值。結(jié)果表明：濃硫酸用量為6.0 mL時，反應(yīng)即可完全，見表1。

表1 濃硫酸用量實驗結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0 mL于具塞試管中，各準(zhǔn)確加入蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，再加硫酸蒽酮試劑8 mL，搖勻后靜置10 min，冰水浴中冷卻10 min，取出。于630 nm處測定吸光度值。以吸光度（Y）對葡萄糖濃度（x）得出回歸方程Y=0.9707x+0.0089，R2=0.9993。在范圍20~100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性實驗 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液各1 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下方法，依法測定吸光度，自冰水浴中取出后，每隔0.5小時測定一次，連續(xù)3 h測定吸光度考察其穩(wěn)定性，計算得RSD=1.98%，表明樣品溶液至少在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 精密度實驗 取對照品溶液1 mL，按供試品測定項下操作測吸光度，平行測定6份。計算得RSD=1.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 精密稱取樣品粉末6份，每份約1 g，按供試品測定項下操作測吸光度，考察操作方法的重現(xiàn)性，計算得RSD=0.75%（n=6）。

2.7 加樣回收率實驗 精密稱取3份樣品溶液0.4 mL置于具塞試管中，依次加入0.1 mg/mL的葡萄糖溶液0.36、0.30、0.24 mL，并加入蒸餾水使總體積為1 mL，每個梯度各3份，空白對照為蒸餾水1.0 mL。按供試品溶液制備項下方法制備溶液，依法測定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出含量，計算得平均加樣回收率97.6%，RSD=1.44%。

2.8 樣品含量測定 精密稱取5份金刷把樣品，每份1 g，按照“1.2.3”項下所述方法制備供試品溶液，吸取待測液各2 mL置于具塞試管中，按照“2.3”項下所述方法測定吸光度，由回歸方程計算，結(jié)果見表2。最后計算樣品中多糖的平均含量為37.98 mg/L。

表2 樣品含量試驗測定數(shù)據(jù) mg/L

3 討論

多糖是由10個以上的單糖基通過苷鍵連接而成的極性大分子化合物，常用的提取方法有水浸提法、酸堿浸提法、酶法、鹽析法，微波提取法等，而植物多糖提取，以水浸提法最為普遍。多糖提取之后，還有許多雜質(zhì)要除去，一般利用多糖難溶于有機溶劑的特性，用乙醇或丙酮進行反復(fù)沉淀洗滌。因為首次對金刷把多糖進行研究，故選用最普遍簡單的水提醇沉法制備金刷把多糖。下一步研究可針對浸提溫度、時間、乙醇濃度、醇沉?xí)r間、醇沉次數(shù)等條件進行多糖制備工藝優(yōu)化。

多糖檢測方法也有很多，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法、地衣酚法、Feling滴定法、間接碘量滴定法等，本實驗所用蒽酮-硫酸比色法是最常用的多糖測定方法之一，基本原理是多糖在濃硫酸的作用下，水解成單糖，然后脫水形成呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的糠醛衍生物，糠醛衍生物可以和許多芳胺、酚類以及具有活性次甲基的化合物縮合生成有色的化合物，在一定范圍內(nèi)顏色深淺與糖濃度成正比，從而可比色測定其含量。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等，所以用蒽酮-硫酸法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在金刷把多糖初步研究中，用蒽酮-硫酸法可以一次測出多糖總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價值。糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為630 nm，故在此波長下進行比色。本實驗反應(yīng)過程中顏色穩(wěn)定，在波長630 nm處和一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與樣品中多糖含量成正比，符合朗伯-比爾定律。實驗簡便準(zhǔn)確，而且通過精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率等試驗來驗證了這一方法的準(zhǔn)確可靠性。

在測定過程中，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘渣加入反應(yīng)液中，不然會因為細胞壁中的纖維素、半纖維素等與意酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。同時在實驗中發(fā)現(xiàn)蒽酮硫酸試劑一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，一次配夠量，配制時硫酸試劑要用同一批號，加入顯色試劑后需充分搖勻，冰水冷卻時間嚴格把握，否則操作過程中的這些差異均會影響測定結(jié)果。

多糖作為地衣類藥材的主要成分之一，已被發(fā)現(xiàn)地衣多糖具有多種生物活性，如免疫促進、抗腫瘤等[11-13]。而目前對地衣多糖的研究還在不斷深入，所以建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確的多糖含量測定方法對于金刷把的質(zhì)量評價和開發(fā)利用具有重要的意義。對金刷把多糖含量進行了初步研究后發(fā)現(xiàn)金刷把中總多糖含量為37.98%，金刷把中地衣多糖含量如此之高，可能跟其生長環(huán)境有關(guān)，地衣生長速度極其緩慢，在體內(nèi)會產(chǎn)生積累大量具有生物活性的代謝產(chǎn)物，可以看出金刷把是一種非常有潛力的藥物資源，在新型藥物研究中具有廣遠前景和重要意義，有望被開發(fā)成為新型藥物。本實驗為金刷把進一步的質(zhì)量研究和開發(fā)利用提供了方法和依據(jù)。

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