張 宏朱政峰李 輝

（1 蘭州軍區(qū)空軍機關醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州軍區(qū)空軍機關醫(yī)院醫(yī)務處，甘肅 蘭州 730000）

帕金森病患者腦脊液中miR-9a的表達及其臨床意義

張 宏1朱政峰2李 輝1

（1 蘭州軍區(qū)空軍機關醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州軍區(qū)空軍機關醫(yī)院醫(yī)務處，甘肅 蘭州 730000）

目的研究miR-9a在帕金森?。≒D）患者腦脊液中的表達，為帕金森病的早期診斷提供臨床檢測指標。方法采用實時熒光定量PCR檢測42例PD患者、24例普通頭痛患者和24例健康人腦脊液中miR-9a表達水平情況。分析腦脊液中miR-9a表達水平與PD相關臨床指標的關系。結果PD組患者腦脊液中miR-9a表達水平明顯高于頭痛組和健康對照組（P<0.05），且PD患者腦脊液中miR-9a表達與帕金森綜合評分量表（UPDRS）分級呈正相關（r=0.70，P<0.05）。ROC曲線確診PD患者的腦脊液miR-9a臨界值為0.667，其診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%。結論腦脊液miR-9a的檢測不僅有助于PD的診斷，也可能作為判斷PD病情的指標之一。

帕金森?。荒X脊液；miR-9a；生物標志物

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是以黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元進行性變性缺失和Lewy小體出現(xiàn)為特異性改變，好發(fā)于中老年人，其病因和發(fā)病機制至今尚未完全明確[1]。流行病學調(diào)查顯示，我國50 歲以上人群中 PD 的患病率約為1%。由于PD患者可出現(xiàn)嚴重的運動功能障礙，如震顫、強直及動作遲緩，嚴重者生活不能自理，給社會和家庭帶來沉重的負擔[2]。目前臨床上對于PD的診斷只能依靠患者臨床癥狀，而當患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時，神經(jīng)元損害往往已經(jīng)達到了不可代償?shù)碾A段。因此，尋找一種可靠的、能早期診斷并跟蹤疾病進展的生物標志物，已成為目前研究PD的熱點。最近的研究表明，人的體液中存在穩(wěn)定表達的miRNAs。且PD患者腦脊液中miRNAs的表達與正常人存在比較明顯的差異[3]。有報道腦組織中miR-9a的表達與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病密切相關。但腦脊液miR-9a能否作為PD診斷及病情評估的標志物尚不清楚。本研究通過檢測PD患者腦脊液中的表達水平，探討miR-9a在PD的臨床診斷中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象：選取2009年10月至2013年10月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院的42例原發(fā)性PD患者為PD組。所有PD 患者的診斷均符合全國錐體外系疾病討論會制定的PD診斷標準，并且排除其他腦變性疾病。UPDRS分級Ⅰ～Ⅲ。其中男性26例，女性16例；年齡57～77歲，平均（64.6 ±7.8）歲；病程2～6年。頭痛組為24例主訴頭痛患者，均排除腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)感染和腫瘤等器質(zhì)性病變。其中男性9例，女性15例，平均年齡（55.4±7.2）歲。健康對照組為24例健康人，其中男性12例，女性12例，平均年齡（50.7±6.4）歲。所有受試者及其家屬均被明確告知且簽署知情同意書。

1.2 主要設備和試劑：Trizol 試劑（Invitrogen公司）；TaqMan MicroRNA Assay和mirVana? miRNA Isolation Kit（Ambion公司）；ABI PRISM 7900 實時熒光定量PCR儀（ABI公司）；NanoDrop? ND-3300微量分光光度儀（ThermoFisher公司）；miR-9a及U6引物序列購于北京天根生物工程有限公司。

1.3 腦脊液采集：所有受試者均采取腰椎穿刺的方式收集腦脊液?；颊呷扰P位，在局麻下行腰椎穿刺，經(jīng)檢測顱內(nèi)壓無升高或降低，椎管無阻塞后。取無色清亮腦脊液約5～6 μL，室溫下1500 rpm/min離心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱待測。

1.4 RT-PCR：①Trizol法提取腦脊液RNA，NanoDrop? ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計測定RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。mirVana? miRNA Isolation Kit總RNA中分離出miRNA。②cDNA合成：按RT-PCR反應試劑盒操作步驟制備10 μLRT反應體系：mirVana5×RT Buffer 2 μL，1×mirVanaRT Primer 1 μL，Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL，25 ng RNA，加無RNA酶水至總體積10 μL。在GeneAmp PCR System 9700進行逆轉錄反應：16 ℃ 30 min， 42 ℃ 30 min，83 ℃ 5 min。反應結束后，冰浴冷卻，-80 ℃保存。③Realtime PCR反應：采用TaqMan MicroRNA Assays，以U6為內(nèi)參基因，建立20 μL反應體系：Product from RT reaction 1.33 μL，Taqman MicroRNA Assay（20×）1 μL，Taqman 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free water 7.67 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s）共40個PCR循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析miR-9a表達相對水平情況。

1.5 統(tǒng)計學處理：應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用采用獨立樣本t檢驗，Sperman等級相關分析評估腦脊液miR-9a表達水平與UPDRS分級之間的相關性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 三組腦脊液miR-9a表達水平比較：健康人腦脊液中miR-9a表達水平較低（0.25±0.04）；頭痛組腦脊液中miR-9a表達水平為（0.26± 0.07），與健康組相比無明顯差異（P>0.05）。PD組患者腦脊液中miR-9a表達水平相對值為（1.38±0.37），明顯高于健康對照組和頭痛組（P<0.05）（圖1）。

圖 1 不同組腦脊液miR-9a表達水平

2.2 腦脊液miR-9a表達情況在診斷PD上的效能評價：以腦脊液中miR-9a表達水平相對值為檢測變量，以分組為狀態(tài)變量，建立ROC曲線。結果顯示，腦脊液miR-9a診斷PD的ROC曲線下面積AUC為0.815。通過計算確定miR-9a診斷PD的最佳臨界值為0.667，在此臨界值下的診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%（圖 2）。

圖 2 ROC曲線

2.3 腦脊液miR-9a與PD組各因素之間的相關性分析：由表1可見，Sperman相關性分析顯示PD患者腦脊液miR-9a水平與年齡、病程無相關性（P>0.05），而與UPDR分級呈正相關（P<0.05）。

表1 miR-9a與PD組各因素相關性分析

3 討 論

PD的發(fā)病機制十分復雜，目前尚不十分清楚，可能主要由于黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路變性和Lewy小體的形成導致DA能神經(jīng)元減少。由于PD發(fā)病隱匿，早期腦組織無明顯影像學改變，待神經(jīng)功能障礙癥狀時病變損害已不可逆轉。因此，早期診斷對于PD的治療具有非常熏要的臨床意義。

目前的研究證實，腦脊液的生化改變能夠反映大腦病理改變，因而在診斷神經(jīng)變性疾病方面較血清學更具敏感性和特異性。且由于受腦組織取材的限制，因此通過檢測腦脊液中PD相關生物學標志物是早期診斷PD的最佳途徑[4]。近年來，腦脊液中PD相關生物學標志物的研究已取得較大的進展。如黃嘌呤、尿酸、β2苯乙胺、α-Synuclein蛋白、超氧化物歧化酶等腦脊液分子生物學指標都被證實與PD的發(fā)生有關，且有成為PD生物標志物的潛能[5]。但是，以上標志物在診斷PD的敏感度和特異度上尚存在不足。

miR-9a是近年來發(fā)現(xiàn)的在哺乳動物腦組織中高度表達的miRNA，且其核苷酸100%保守。研究發(fā)現(xiàn)miR-9a在果蠅感覺器官前體細胞（SOP）中表達極其低下而在其臨近上皮細胞中呈高表達。提示miR-9a可能對感覺神經(jīng)元發(fā)育成熟和功能加以調(diào)控。且miR-9a可以通過調(diào)控SOP向感覺神經(jīng)元分化過程中必需的轉錄因子，進而使SOP細胞向感覺神經(jīng)細胞分化[6]。最近Lukiw研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默?。ˋD）患者海馬內(nèi)miR-9表達水平明顯上調(diào)[7]。以上研究提示miR-9a與神經(jīng)系統(tǒng)地發(fā)育和疾病的發(fā)生密切相關。因此，miR-9a在腦脊液的研究可能有利于為我們闡明PD的具體發(fā)病機制，也為早期診斷PD提供了一個潛在的標志物。

本次研究我們采用RT-PCR檢測PD患者、頭痛患者和健康人腦脊液中miR-9a表達水平，發(fā)現(xiàn)PD患者腦脊液中miR-9a表達水平明顯高于頭痛組和健康對照組（P<0.05）。同時，我們利用ROC曲線確定了腦脊液中miR-9a在診斷PD上的效能，發(fā)現(xiàn)腦脊液miR-9a診斷PD的ROC曲線下面積AUC為0.815。通過計算確定miR-9a診斷PD的最佳臨界值為0.667，且在此臨界值下的診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%。提示腦脊液中miR-9a的高表達可以作為PD的診斷指標，且具有較高敏感度和特異度。此外，通過Sperman等級相關分析，PD患者腦脊液中miR-9a表達水平與患者年齡、病程無相關性（P>0.05），而與UPDR分級呈正相關（P<0.05）。提示可以通過檢測PD患者腦脊液中miR-9a表達水平來推測PD損傷程度。

綜上，本次研究結果提示腦脊液miR-9a可能成為新的PD診斷及判斷病情的標志物，其具有較高敏感度和特異度。隨著對miRNA在神經(jīng)疾病領域內(nèi)的研究，miRNA將會成為PD疾病一個新的診斷和治療靶點。

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1671-8194（2014）36-0166-02