劉振專 蔡常輝 黃 貞 陳述文

（中山市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 中山 528447）

探討3種痰TB-DNA提取方法在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值

劉振專 蔡常輝 黃 貞 陳述文

（中山市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 中山 528447）

目的優(yōu)選肺結(jié)核診斷中理想的痰TB-DNA提取方法。方法選擇我院肺科門診肺結(jié)核患者185例，提取其痰液樣本，應(yīng)用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進(jìn)口離心柱法進(jìn)行分析，對(duì)比實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果。結(jié)果進(jìn)口離心柱法下TB-DNA陽(yáng)性檢出率為81.08%（150/185），明顯高于煮沸裂解法以及酚/氯仿法，P＜0.05。結(jié)論在對(duì)疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)中，可優(yōu)先選擇進(jìn)口離心柱法作為TB-DNA的有效提取方法。

肺結(jié)核；診斷；TB-DNA

臨床疑似肺結(jié)核患者實(shí)驗(yàn)室診斷的關(guān)鍵在于對(duì)痰液標(biāo)本中的TB復(fù)合體進(jìn)行檢測(cè)與分析[1]。由于TB結(jié)核分歧桿菌具有耐酸耐酶的特點(diǎn)，故而對(duì)DNA提取來(lái)說(shuō)有一定特殊性，不同提取機(jī)制以及提取步驟干預(yù)下，會(huì)造成PCR擴(kuò)增效果出現(xiàn)差異[2,3]。為合理優(yōu)選在肺結(jié)核診斷中理想的痰TB-DNA提取方法，本文以185例肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，分別應(yīng)用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進(jìn)口離心柱法以上3種方法進(jìn)行干預(yù)，取得了確切結(jié)論，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇我院自2013年7月至2013年12月期間，肺科門診疑似肺結(jié)核患者共計(jì)185例作為研究對(duì)象，提取其痰液樣本進(jìn)行研究，對(duì)臨床資料展開回顧分析。185例患者均最終確診為肺結(jié)核。其中，男性患者為120例，女性患者為65例，患者年齡在40～70周歲范圍內(nèi)，平均年齡為（56.1±2.5）歲。

1.2 方法：在對(duì)185例患者痰液標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理后，分別使用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進(jìn)口離心柱法對(duì)痰液標(biāo)本中DNA進(jìn)行提取，具體操作方法如下。

1.2.1 煮沸裂解法：使用TB核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測(cè)試劑盒中所自帶的DNA提取液進(jìn)行DNA提取工作。提取液主要成分為Tris鹽酸緩沖液以及去污液。將患者痰液標(biāo)本在經(jīng)過(guò)預(yù)處理環(huán)節(jié)操作后所得到的沉淀每管加入劑量為50.0 μL的DNA提取液，充分混合均勻，在100.0 ℃溫度條件下進(jìn)行持續(xù)加熱（加熱時(shí)間為10.0 min），完成加熱后將其轉(zhuǎn)至室溫狀態(tài)進(jìn)行離心處理（離心條件為13000 r/min，持續(xù)5.0 min），完成離心處理后在-30.0 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酚/氯仿法：自行配置細(xì)胞裂解液（配置方法為：10.0 mmol/L劑量Tris鹽酸緩沖液、乙二胺四乙酸、生理鹽水，以及十二烷基硫酸鈉與1.0 mmol/L劑量氫氧化鈉充分混合）。將患者痰液標(biāo)本在經(jīng)過(guò)預(yù)處理環(huán)節(jié)操作后所得到的沉淀每管加入劑量為300.0 μL的細(xì)胞裂解液，充分混合均勻，在100.0 ℃條件下進(jìn)行加熱，持續(xù)時(shí)間為15.0 min。采取酚/氯仿法對(duì)DNA進(jìn)行純化，加入等體積氯仿/異戊醇（標(biāo)準(zhǔn)比例為24/1），離心處理（離心條件為10000 r/min，持續(xù)5.0 min），取上層清液，將其轉(zhuǎn)移至等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（標(biāo)準(zhǔn)比例為25/24/1）試管中，離心處理（離心條件為10000 r/min，持續(xù)5.0 min），再次將上層清液轉(zhuǎn)移至新試管，加入等體積異丙醇，顛倒混合，離心處理（離心條件為10000 r/min，持續(xù)5.0 min）。棄置上層清野后，加入1000.0 μL劑量無(wú)水乙醇進(jìn)行洗滌并離心（離心條件為10000 r/min，持續(xù)1.0 min），棄置上層清液，最后將沉淀DNA溶解于50.0 μL劑量雙蒸水中，完成處理后在-30.0 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 進(jìn)口離心柱法：將患者痰液標(biāo)本在經(jīng)過(guò)預(yù)處理環(huán)節(jié)操作后所得到的沉淀加入劑量為100.0 μL的試劑盒緩沖液ATL（試劑盒選擇為QIAamp DNA mini kit），充分振蕩并使其產(chǎn)生懸浮。后進(jìn)行點(diǎn)動(dòng)離心處理，加入20.0 μL計(jì)量的蛋白酶K，溫箱培育（溫度為56.0 ℃，持續(xù)30.0 min），并點(diǎn)動(dòng)離心處理，后加入200.0 μL劑量緩沖液AL，振蕩15 s并充分混合，溫箱培育（溫度為70.0 ℃，持續(xù) 10.0 min），并點(diǎn)動(dòng)離心處理，后加入200.0 μL劑量無(wú)水乙醇，振蕩15 s并充分混合，點(diǎn)動(dòng)離心后將溶液轉(zhuǎn)移至離心過(guò)濾柱中進(jìn)行離心處理（離心條件為8000 r/min，持續(xù)1.0 min），棄濾過(guò)夜，將離心過(guò)濾柱轉(zhuǎn)移至新收集管內(nèi)。進(jìn)一步加入500.0 μL劑量緩沖液AW1，同等條件離心后將離心過(guò)濾柱再次轉(zhuǎn)移至新收集管，加入500.0 μL劑量緩沖液AW2，13000 r/min離心，持續(xù)3.0 min，棄置濾過(guò)液，再次將離心過(guò)濾柱轉(zhuǎn)移至新收集管并做1.0 min離心處理，最后將200.0 μL劑量洗脫緩沖液AE通過(guò)懸空的方式向吸附膜中間位置加入，室溫條件下靜置2.0 min，8000 r/min條件做2.0 min離心處理，最后收集離心管內(nèi)液體并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo)：在FQ-PCR儀器（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的DA-7600）支持下，完成對(duì)樣本的TB核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測(cè)工作。根據(jù)熒光曲線形態(tài)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，評(píng)價(jià)3種痰TB-DNA提取方法的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果并進(jìn)行對(duì)比。

1.4 數(shù)據(jù)處理：使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，以χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

進(jìn)口離心柱法下TB-DNA陽(yáng)性檢出率為81.08%（150/185），明顯高于煮沸裂解法以及酚/氯仿法下TB-DNA陽(yáng)性檢出率，數(shù)據(jù)對(duì)比存在顯著差異，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 3種痰TB-DNA提取方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比表

3 討 論

痰液標(biāo)本在提取DNA中最主要的難點(diǎn)在于：標(biāo)本中有大量的干擾物以及雜志，DNA抽提期間容易出現(xiàn)抑制物共純化的問題，導(dǎo)致下游PCR擴(kuò)增受到影響。本次研究中發(fā)現(xiàn)：煮沸裂解法雖應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單，但提取TB-DNA中純度較低，無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，改進(jìn)后的酚/氯仿法雖然能夠?qū)μ狄褐卸喽嗵且约吧爻煞诌M(jìn)行去除，但操作復(fù)雜要求較高，可行性不足，而進(jìn)口離心柱法有效避免了以上問題，且PCR效果良好，質(zhì)量穩(wěn)定，擴(kuò)增效果確切，能夠在實(shí)驗(yàn)室診斷中加以推廣，值得重視。

綜上所述，在對(duì)疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)中，可優(yōu)先選擇進(jìn)口離心柱法作為TB-DNA的有效提取方法。

[1] 李素華,陳莉,王歡,等.腦脊液中TB-DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的臨床應(yīng)用價(jià)值評(píng)價(jià)[J].西南國(guó)防醫(yī)藥,2010,20(6):641-642.

[2] 周華,楊春,杜煦,等.胸水ADA、TB-DNA聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷運(yùn)用[J].臨床肺科雜志,2012,17(6):1066-1067.

[3] 張玉平,丁顯平,張麗媛,等.T-SPOT.TB、痰涂片和TB-DNA檢測(cè)在肺結(jié)核診斷中的比較研究[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,8(1):49-51.

Application Value of Study on Extracting Method of Three Kinds of TB-DNA in Sputumin the Diagnosis of Pulmonarytuberculosis

LIU Zhen-zhuan, CAI Chang-hui, HUANG Zhen, CHEN Shu-wen
(Department of Laboratory, the Second People's Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528447, China)

ObjectiveTo select ideal in tuberculosis diagnosis sputum TB-DNA extraction method.Method185 cases with pulmonary outpatient tuberculosis patients choose our hospital, extract sputum samples, the application of boiling pyrolysis method, phenol/chloroform method, column and import the centrifugal method were analyzed, and compared the real-time fl uorescent PCR results.ResultsUnder import centrifugal column method TB-DNA positive detection rate was 81.08%(150/185), signif i cantly higher than the boiling cracking method and phenol/chloroform method, P<0.05.ConclusionsIn patients with suspected pulmonary tuberculosis in sputum specimens for testing, can choose imported centrifugal column priority method as effective TBDNA extraction method.

Tuberculosis; Diagnosis; TB-DNA

R521

B

1671-8194（2014）36-0016-02