章顯寶,汪瑛,王震,孔紅兵,汪節(jié),江六順,郭曉利,肖偉

(安徽中醫(yī)學院附屬針灸醫(yī)院,合肥 230061)

項叢刺針法對缺血性腦卒中后遺癥大鼠BDNF、NGF以及神經(jīng)行為學的影響

章顯寶,汪瑛,王震,孔紅兵,汪節(jié),江六順,郭曉利,肖偉

(安徽中醫(yī)學院附屬針灸醫(yī)院,合肥 230061)

目的觀察項叢刺針法對缺血性腦卒中后遺癥大鼠海馬區(qū)BDNF、 NGF以及神經(jīng)行為學的影響。方法80只雄性青年清潔健康級Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、治療組、西藥組,每組20只。除假手術組外,其他動物均采用線栓法阻斷大腦中動脈制備大鼠腦缺血模型。療程結束后,觀察大鼠神經(jīng)行為評分的變化,采用免疫組織化學染色方法檢測各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF的表達。結果與假手術組比較,模型組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF的表達顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,治療組與西藥組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF的表達均顯著升高(P＜0.01);與西藥組相比,治療組效果顯著(P＜0.05);與假手術組相比,模型組大鼠神經(jīng)行為學評分顯著增高(P＜0.01);與模型組相比,治療組與西藥組大鼠神經(jīng)行為學評分顯著降低(P＜0.01);與西藥組相比,治療組效果顯著(P＜0.05)。結論項叢刺針法對缺血性腦卒中后遺癥大鼠腦組織有神經(jīng)保護和修復作用,療效優(yōu)于西藥,其作用機制可能涉及有效上調大鼠BDNF、NGF蛋白的表達。

針刺;項叢刺針法;中風后遺癥;BDNF;NGF;神經(jīng)行為學;大鼠;穴位,頭頸部

缺血性腦卒中因具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點而一直倍受關注,如何積極有效地促進缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能恢復是目前的研究熱點。隨著神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象在成年個體神經(jīng)組織中的發(fā)現(xiàn)以及對其研究的不斷深入,為修復神經(jīng)組織治療方法的實現(xiàn)提供了可能,并因此而受到了國內外學者的廣泛關注[1-2]。有研究表明,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neuro t rophic factor,BDNF)和神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)可以明顯促進缺血后神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育并能夠防止他們受損死亡,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進受損神經(jīng)元再生及分化成熟,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復中具有重要的作用[3]。針刺對缺血性腦卒中的治療已被國內外公認[4-5],我們的前期工作也證實,針刺治療能明顯改善缺血性腦卒中后遺癥患者的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,改善患者生活質量及預后[6-7]。臨床上對于缺血性腦病患者的治療是長期的,尤其針刺療法是治療缺血性腦血管疾病后遺癥的有效方法之一,但對其作用機制,如促進大腦可塑性形成等方面缺乏深入探討。因此,我們選擇應用項叢刺針法觀察針刺對缺血性腦卒中大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達及其神經(jīng)行為學的影響,并探討其可能的作用機制,為臨床針刺治療缺血性腦卒中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雄性青年清潔健康級Wistar大鼠80只,體重(300±20)g,月齡為9個月,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供(動物合格證號為皖醫(yī)實動準第01號)。實驗前觀察飼養(yǎng)1星期,標準化環(huán)境飼養(yǎng)。隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、治療組、西藥組,每組20只。

1.2 試劑

兔抗大鼠BDNF(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品);抗體兔抗大鼠NGF抗體(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品);生物素標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品)。

1.3 模型制備

采用改良線栓法制作大鼠右側MCAO局灶性腦缺血模型。假手術組大鼠麻醉后,僅暴露頸內外動脈分叉,不閉塞大腦中動脈。術中用肛表-電熱毯反饋裝置保持肛溫在(37±0.5)℃。術后腹腔內注射0.2萬U青霉素以預防感染,回籠后常規(guī)喂養(yǎng)。術后至處死前若有大鼠死亡,則補以同批次相似體質量大鼠。模型成功的標志是動物麻醉清醒后出現(xiàn)左前肢無力向左側方爬行,或者朝左側轉圈爬行,且無煩躁不安。

1.4 實驗干預方法

造模成功5星期后開始行針刺治療,根據(jù)“大鼠穴位圖譜”(江蘇省中醫(yī)藥研究所華興邦研究員等用模擬骨度法繪制而成),項叢刺取穴共9個穴點。①腦后正中線上取風府、啞門、下腦戶(枕骨粗隆下方約風府穴上1寸處)。②分別以兩風池與風府沿顱底作一連線,左右各分成3等份,每1等份為1個穴位。針刺時將大鼠輕輕放在特制的固定器內,大鼠保持清醒安靜狀態(tài)。穴位皮膚常規(guī)消毒后,選用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)的華佗牌不銹鋼毫針,規(guī)格為直徑0.20 mm,針身長25～50 mm,毫針與穴位皮膚呈垂直方向刺入2 mm,并采用平補平瀉的捻轉手法,捻轉角度60°左右,留針15 min,留針期間各行針1～2次,每日1次,最長療程為15 d。西藥組給予尼莫地平片12 mg/kg溶入生理鹽水進行灌胃,每日1次,最長療程為15 d。模型組、假手術組大鼠在實驗開始后常規(guī)飼養(yǎng),不作任何治療。

1.5 神經(jīng)行為學評分

模型復制后4 d,進行初次神經(jīng)行為學評分,測試假手術組和已造模的大鼠;針刺組和西藥組在末次治療結束后分別進行神經(jīng)行為學評分;模型組和假手術組的神經(jīng)行為學評分與針刺組平行進行。評分標準按Longa等[8]制定的5級評分法,0分為無功能障礙;1分為不能伸展前肢;2分為向一側旋轉;3分為向一側傾倒;4分為無自主活動伴意識抑制(取評分為1、2、3分者進入實驗)。

1.6 標本采集及處理

療程結束后,大鼠經(jīng)神經(jīng)行為學評分完成后進行腦組織的取材。以10%水合氯醛麻醉大鼠,開胸暴露心臟,將灌注針頭從心尖部插入升主動脈,同時迅速剪開右心耳,依次迅速灌注20℃生理鹽水200 mL、4℃4%多聚甲醛200 mL,迅速取腦,置于4℃4%多聚甲醛固定液中過夜。每組大鼠取同部位進行切片,參照《大鼠腦立體定位圖譜》[9]取海馬區(qū),常規(guī)上行脫水、二甲苯透明后石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚20 μm,然后在溫水中充分展開,貼片。每份組織取不相鄰切片3張備用。

1.7 免疫組織化學染色

切片經(jīng)二甲苯脫蠟,脫蠟后在清水中沖洗一段時間,加入3%H2O2泡10 min,從而除去內源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗2次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3 min(中火),冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫;將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5 min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,滴加正常山羊血清,使一些非特異性的位點封閉起來,然后放入37℃溫箱中30 min;滴加適當稀釋的一抗(1：100),4℃冰箱過夜;將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干組織周圍的PBS后加上生物素標記二抗,然后置于37℃溫箱中30 min;將載玻片從溫箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC,然后置于37℃溫箱中30 min;將載玻片從溫箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5 min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑;將顯色后的載玻片用清水沖洗一段時間后,浸泡于蘇木精中染色30 s;將復染后的載玻片置于水中沖洗后,進梯度乙醇脫水。最后浸泡在二甲苯中,搬到通風柜中。用中性樹膠滴在組織旁邊,封好片子晾干。對照試驗以正常血清和PBS代替一抗,同步進行上述免疫組織化學染色,結果為陰性。

1.8 細胞計數(shù)及統(tǒng)計

將已染好的切片在顯微鏡下放大400倍,每只大鼠取3張相同海馬區(qū)域腦片,每張腦片在海馬隨機選取10個視野,計數(shù)此區(qū)域內免疫組化染色陽性細胞數(shù),求其平均值。實驗測得各組數(shù)據(jù)采用均值±標準差表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗,多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計結果用Spssforwindows11.0軟件分析。P＜0.05認為有顯著性差異,P ＜0.01有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF陽性細胞數(shù)的表達

BDNF、NGF陽性細胞在光鏡下呈藍色與棕色相疊的點狀、三角狀、索狀或片狀表達痕跡。其免疫陽性顆粒主要分布在胞漿和細胞膜表面、主干樹突和近細胞膜的胞漿處,染色較深,而包體中央細胞核處呈淡藍色。經(jīng)過1個療程治療后,假手術組大鼠在與模型組、針刺組、西藥組相應區(qū)域相比僅見少量BDNF和NGF的表達,而模型組、針刺組、西藥組海馬區(qū)BDNF和NGF陽性細胞數(shù)比假手術顯著增多(見圖1、圖2)(P＜0.01);針刺組、西藥組海馬區(qū)BDNF和NGF陽性細胞數(shù)較模型組增多(見圖1、圖2)(P＜0.01);而與西藥組比,針刺組海馬區(qū)BDNF、NGF陽性細胞數(shù)的表達較多(見圖1、圖2)(P ＜0.05)。各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果見表1。

表1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF陽性細胞數(shù)表達的比較(±s)

表1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF陽性細胞數(shù)表達的比較(±s)

注：與假手術組比1)P＜0.01;與模型組比2)P＜0.01;與西藥組比3)P＜0.05

組別 n BDNF NGF假手術組 20 3.60±1.31 4.45±1.39模型組 20 24.85±3.541)24.15±2.831)針刺組 20 33.35±3.101)2)3)34.25±2.381)2)3)西藥組 20 31.40±2.991)2)32.80±2.171)2)

圖1 各組大鼠海馬區(qū)BDNF陽性細胞的表達(×400)

圖2 各組大鼠海馬區(qū)NGF陽性細胞的表達(×400)

2.2 各組大鼠神經(jīng)行為學評分結果

療程結束后,對各組大鼠進行神經(jīng)行為學評分,結果見表2。與假手術組比較,模型組大鼠神經(jīng)行為學評分顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,針刺組與西藥組大鼠神經(jīng)行為學評分顯著降低(P＜0.01);與西藥組比較,針刺組在降低大鼠神經(jīng)行為學評分效果更佳(P ＜0.05)。

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學評分結果的比較 (±s,分)

表2 各組大鼠神經(jīng)行為學評分結果的比較 (±s,分)

注：與假手術比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01;與西藥組比較3)P ＜0.05

組別 n 神經(jīng)行為學評分假手術組 20 0.00±0.00模型組 20 2.56±0.851)針刺組 20 1.00±0.562)3)西藥組 20 1.65±0.722)

3 討論

3.1 項叢刺針法對缺血性腦卒中后遺癥大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達的影響

BDNF和NGF同屬神經(jīng)生長因子家族,又稱神經(jīng)營養(yǎng)素(Neurot rophins,NTs),是近年來在神經(jīng)再生、損傷修復領域內的研究熱點。BDNF和NGF由神經(jīng)元和神經(jīng)元支配的靶器官或星形膠質細胞產(chǎn)生,具有多種生物活性。BDNF及NGF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要作用,同時維持成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的正常功能[10]。BDNF可支持和促進紋狀體多巴胺能神經(jīng)元、前腦膽堿能神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、顱腦和脊髓的運動神經(jīng)元的存活和生長,而在胚胎發(fā)育的早期,NGF也能明顯促進神經(jīng)前體細胞的增殖并促進其分化。有研究表明,BDNF、NGF對缺血性腦損傷的神經(jīng)元有保護作用,能阻斷腦缺血時神經(jīng)元凋亡的發(fā)生[11-12]。腦缺血后,腦神經(jīng)細胞的損傷程度與BDNF和NGF的表達水平密切相關,BDNF及其受體TrkB表達、NGF均增加,兩者水平增高能夠提高神經(jīng)元的抗損傷能力[13-14]。因此,腦缺血后增加的BDNF、NGF對缺血性腦損傷具有保護作用。

本實驗顯示,在大鼠造模后5星期、治療15 d后,模型組、針刺組、西藥組大鼠海馬區(qū)BDNF和NGF表達與假手術組大鼠的表達均有顯著性差異。表明腦組織發(fā)生缺血后,腦組織BDNF、NGF表達均增加。有研究顯示[15],在神經(jīng)損傷3 d后BDNF mRNA開始緩慢增加,3～4星期達到最高峰。Hsu等[16]研究發(fā)現(xiàn),將大鼠右側大腦中動脈閉塞30rain再開放,4 h后缺血側皮質NGF表達增加,1～3 d表達明顯受抑制,但1～2星期出現(xiàn)第2次高峰。本實驗時間點由于選取在大鼠造模后5星期開始治療,故尚無法觀察BDNF、NGF在腦缺血損傷后的變化規(guī)律。但針刺組、西藥組大鼠海馬區(qū)BDNF和NGF表達與模型組大鼠的表達均有顯著性差異,說明針刺和藥物均可以提高大鼠BDNF、NGF在腦內的表達且保持在較高水平。持續(xù)較高水平的BDNF、NGF可以促進缺血后神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育并能夠防止他們受損死亡,改善神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進受損神經(jīng)元再生及分化成熟,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復起到重要的作用[3]。而針刺組與西藥組相比,大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達更明顯,兩者比較有顯著性差異,表明針刺在提高大鼠BDNF、NGF表達方面效果更優(yōu)于西藥。

3.2 項叢刺針法對缺血性腦卒中后遺癥大鼠神經(jīng)行為學的影響

神經(jīng)功能缺損評分不僅可評價大腦中動脈栓塞(MACO)模型制備是否成功,而且是觀測針刺對MACO大鼠治療作用的評判標準,與BDNF、NGF組織學觀察相結合可反映針刺對受損神經(jīng)的修復及保護作用。

本實驗在療程結束后采用目前常用的神經(jīng)行為學評分法——改良Longa法,對大鼠進行神經(jīng)功能缺損的評分。結果顯示,假手術組的神經(jīng)功能缺損評分為0分,表明該組手術操作沒有造成腦動脈閉塞,因而不會出現(xiàn)腦缺血的癥狀和體征。模型組的神經(jīng)功能缺損評分較高,表明大腦中動脈的閉塞造成了大鼠的神經(jīng)功能缺損,結合模型組大鼠海馬區(qū)BDNF、NGF表達,可以看出在腦缺血后腦內BDNF、NGF表達的增高,未能完全改善大鼠的神經(jīng)功能。而與模型組比較,針刺組、西藥組大鼠神經(jīng)行為學評分顯著降低。表明針刺及藥物的治療有助于大鼠神經(jīng)功能的康復,其作用機制可能是針刺和藥物治療增強了內源性BDNF和NGF的表達,從而有助于減輕腦缺血后神經(jīng)元的損傷程度,保護受損神經(jīng)元。針刺組與藥物組相比,大鼠的神經(jīng)行為學評分更低,表明針刺對大鼠神經(jīng)功能的修復效果優(yōu)于西藥。

綜上所述,項叢刺針法對缺血性腦卒中后遺癥大鼠腦組織有神經(jīng)保護和修復作用,療效優(yōu)于西藥,其作用機制可能涉及有效上調大鼠BDNF、NGF蛋白的表達。當然,針刺對缺血性腦卒中大鼠腦損傷的康復作用可能是一種綜合調整的結果,其作用機理包括許多方面,增強其缺血腦組織的BDNF、NGF表達可能只是其中機制之一。我們將在以后的研究中進一步探索針刺治療缺血性腦卒中的作用機制,為臨床治療缺血性腦卒中提供更多的實驗依據(jù)。

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Effect of Nape Cluster Acupuncture on BDNF, NGF and Neurobehaviors in Rats with Post-ischem ic Stroke Sequelae

ZHANG Xian-bao, WANG Ying, WANG Zhen, KONG Hong-bing, WANG Jie, JIANG Liu-shun, GUO Xiao-li, XIAO Wei. Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230061,China

ObjectiveTo investigate the effect of nape cluster acupuncture on hippocampal BDNF and NGF and neurobehaviors in rats with post-ischem ic stroke sequelae.MethodEighty clean and healthy young male Wistar rats were random ly allocated to sham operation, model, treatment and Western drug groups, 20 rats each. A rat model of cerebral ischem ia was made by thread occlusion of the m iddle cerebral artery in all the groups except the sham operation group. After the end of treatment, rat neurobehaviors were scored and hippocampal BDNF and NGF expressions were exam ined by immunohistochemical staining in every group of rats.ResultCompared with the sham operation group of rats, hippocampal BDNF and NGF expressions increased significantly in the model group (P＜0.01). Compared with the model group of rats, hippocampal BDNF and NGF expressions increased significantly in both the treatment and Western drug groups (P＜0.01). Compared with the Western drug group, the effect was marked in the treatment group (P＜0.05). Compared with the sham operation group of rats, the neurobehavior score increased significantly in the model group (P＜0.01). Compared with the model group of rats, the neurobehavior score decreased significantly in both the treatment and Western drug groups (P＜0.01). Compared with the Western drug group, the effect was marked in the treatment group (P＜0.05).ConclusionNape cluster acupuncture has protecting and repairing effects on brain tissue in rats with post-ischemic stroke sequelae. Its therapeutic effect is superior to that of Western drugs. The mechanism of its action may involve effective up-regulation of rat BDNF and NGF protein expressions.

Acupuncture; Nape cluster acupuncture; Poststroke syndrome; BDNF; NGF; Neuroethology; Points, head & neck

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.02.0181

1005-0957(2014)02-0181-04

2013-06-30

安徽省高等學校省級自然科學研究項目(KJ20011A186)

章顯寶(1984 - ),男,碩士,E-mail：r rzxb@163.com

肖偉(1961 - ),女,主任醫(yī)師,碩士生導師,研究方向為針灸對腦血管病臨床及其作用機制研究,Emai l：xiaowei1216@ gmail.com