王虹蛟等

近年來(lái)，我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期失控是細(xì)胞增殖失控而導(dǎo)致癌變的重要原因。而細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）是近年來(lái)提出的重要的原癌基因，在細(xì)胞周期的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。為了探討細(xì)胞周期蛋白D1基因與肺癌的關(guān)系，本文進(jìn)行了肺癌不同組織類(lèi)型灰度值的比較研究。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象

收集肺癌住院病人并經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的肺癌石蠟包埋組織108例。本實(shí)驗(yàn)組男75例、女33例，其中包括鱗癌59例、腺癌33例、小細(xì)胞未分化癌16例。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)用組織均經(jīng)10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。并且，每批實(shí)驗(yàn)都嚴(yán)格控制在相同條件下設(shè)免疫組化實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。

免疫組化染色步驟：（1）石蠟組織5μm連續(xù)切片，每塊切3片。（2）切片經(jīng)逐級(jí)脫蠟至水洗。（3）3% H2O2室溫孵育5～10分鐘。（4）蒸餾水沖洗。（5）高壓抗原修復(fù)（修復(fù)液為檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液）。（6）蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘。（7）10%正常山羊血清（PBS稀釋?zhuān)┓忾]，37℃孵育10分鐘。（8）傾去血清，滴加1∶100稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。（9）PBS沖洗，3次，每次5分鐘。（10）滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液（1∶200），室溫30分鐘。（11）PBS沖洗3次，每次5分鐘。（12）滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，室溫30分鐘。（13）PBS沖洗3次，每次5分鐘。（14）滴加DAB顯色液。（15）自來(lái)水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，封片。

圖像分析儀測(cè)定：將每例免疫組化標(biāo)本隨機(jī)取一片，每片取3個(gè)視野。應(yīng)用圖像分析儀，分別測(cè)定所測(cè)區(qū)域的灰度值。

1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

圖像分析儀測(cè)定：以每片標(biāo)本隨機(jī)取3個(gè)視野，分別測(cè)定每個(gè)視野所測(cè)區(qū)域的灰度值，其灰度值計(jì)算公式Y(jié)=0.299R+0.587G+0.114B，最后取每例標(biāo)本3個(gè)視野的灰度值的平均值為該標(biāo)本的灰度值來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。此外在測(cè)定時(shí)，在相同的光度條件下，使用的玻片相同，標(biāo)本切片厚度相同，經(jīng)隨機(jī)抽檢20個(gè)樣本的空白區(qū)域灰度值，其結(jié)果基本相等?？瞻讌^(qū)域灰度值變化小，實(shí)驗(yàn)誤差很小，對(duì)所測(cè)樣本無(wú)明顯影響，可考慮不計(jì)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖像分析儀所測(cè)得cyclin D1灰度值采用兩組資料的秩和檢驗(yàn)方法。

2結(jié)果

2.1肺癌與正常肺組織灰度值比較

測(cè)定結(jié)果顯示：所測(cè)肺癌組織的灰度值明顯高于正常肺組織的灰度值，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異（P<0.01）。

2.2不同類(lèi)型肺癌與正常肺組織灰度值比較

經(jīng)測(cè)定NSCLC的灰度值明顯高于正常肺組織，差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明cyclin D1在肺鱗癌及腺癌中均過(guò)表達(dá)，而SCLC及正常肺組織中的灰度值明顯降低，尤以后者為著，但二者之間差異無(wú)顯著性（P>0.05）。

2.3不同分化程度鱗癌與正常肺組織灰度值比較

所測(cè)標(biāo)本灰度值隨著組織分化程度的增高而增大，在高分化中最高，低分化次之，在正常肺組織中最低。正常肺組織、未分化癌、低分化癌三者與高分化癌相比均差異極顯著（P<0.01），未分化癌與低分化癌之間差異不顯著。

2.4不同分化程度腺癌與正常肺組織灰度值比較

同鱗癌測(cè)定的結(jié)果基本相同，在腺癌中其灰度值隨著組織分化程度的增高而升高，高分化癌最高，未分化癌最低，而正常肺組織均低于各不同分化程度的腺癌。高分化癌與未分化癌、低分化癌及正常肺組織之間有極顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果表明：在腺癌中其灰度值與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)。因?qū)嶒?yàn)組中所選小細(xì)胞癌病例均為未分化型，故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3討論

近年來(lái)研究提示，細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞分裂過(guò)程中的作用機(jī)制如下：cyclin D1依據(jù)CDKS的激活，二者形成復(fù)合物，促使pRb絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，釋放出EZF、ELF等轉(zhuǎn)錄因子。EZF等轉(zhuǎn)錄因子又與多種基因的啟動(dòng)子結(jié)合，導(dǎo)致DNA復(fù)制，細(xì)胞呈現(xiàn)有絲分裂。cyclin D1基因是作用于G1期的主要周期蛋白，對(duì)細(xì)胞分裂有啟動(dòng)作用。有證據(jù)表明，cyclin D1基因轉(zhuǎn)染入3T3細(xì)胞能導(dǎo)致細(xì)胞向腫瘤方向分化。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多階段的演進(jìn)過(guò)程，與多抑癌基因的滅活和癌基因的激活有關(guān)。

為了探討cyclin D1基因在肺癌中的表達(dá)情況及其與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系，力求在進(jìn)一步闡明肺癌的確切發(fā)病機(jī)理、早期診斷、臨床病理參數(shù)及預(yù)防和治療方面取得一些成果。本實(shí)驗(yàn)研究了108例肺癌石蠟包埋組織及10例正常肺組織中cyclin D1的表達(dá)，其結(jié)果表明，cyclin D1在肺癌中表達(dá)，而在正常肺組織中不表達(dá)。二者之間差異極顯著（P<0.01）。提示cyclin D1只有在腫瘤組織中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，并且以往的cyclin D1的幾種免疫組化研究已經(jīng)在病理檔案中石蠟包埋的癌組織中進(jìn)行過(guò)，其結(jié)果也顯示只有腫瘤細(xì)胞的cyclin D1表現(xiàn)出活性，因此說(shuō)cyclin D1在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的作用。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明cyclin D1做為癌基因是毫無(wú)疑問(wèn)的，它在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。雖然有人將cyclinD1抗體微注射于正在分裂的細(xì)胞，則使它們停留在G1期，但是，cyclin D1抗體能否用于腫瘤治療還有待于進(jìn)一步研究，如果成功，則對(duì)于腫瘤的治療將是一個(gè)重大的突破。

（編輯 鳳池）