郭 梅，肖 林，王士磊，曾 健

(解放軍第254醫(yī)院，天津300142)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，在世界范圍內，每年新發(fā)病例58萬人，27萬人死于宮頸癌，其中大約88%的患者處于發(fā)展中國家[1]。臨床和流行病學研究結果表明，宮頸癌的發(fā)生可能與某些病毒感染相關，其中人乳頭瘤病毒(HPV)感染被認為是宮頸癌發(fā)生的早期事件之一[2]。目前HPV高危亞型的持續(xù)感染可導致宮頸上皮內瘤變和宮頸癌發(fā)生的論斷已被世界范圍內公認。筆者利用DNA雜交技術檢測1145例婦科門診患者宮頸脫落細胞的HPV感染情況，分析HPV及其高危亞型的感染與宮頸癌病變的關系，建立一種適合本地區(qū)的快速、準確、適于推廣的宮頸癌病變的篩查方法，為臨床提供有效的輔助診斷及早期治療依據(jù)。現(xiàn)介紹如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2010年4月—2011年6月于我院婦科門診就診患者共1145例，年齡18～68歲，均未行子宮切除手術，就診時處于非妊娠狀態(tài)?；颊咄瑫r進行宮頸薄層細胞液基細胞學檢查(TCT)和HPV檢查，檢查前24 h內無性行為，月經干凈后3 d檢查，且停止陰道沖洗和用藥3 d。對2種檢查方法同時發(fā)現(xiàn)異常的患者進行陰道鏡檢查并活檢。

1.2 試劑 人乳頭瘤病毒核酸擴增檢測試劑盒由廣東凱普生物科技有限公司提供?？梢淮涡钥焖贆z測中國人群HPV95%的21種亞型，即13種高危險型(HR－HPV)包括HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，5 種低危險型(HPV 6，11，42，43，44)和 3 種未分高低危亞型(HPV 53、HPV66、CP8304)。

1.3 方法

1.3.1 取材 HPV－DNA標本:暴露宮頸，并拭去宮頸表面分泌物，用專用宮頸刷伸入宮頸外口輕壓并依順時針方向旋轉3～4周后，將獲取的足量宮頸脫落上皮細胞浸入保存液中－20℃保存，1周內檢測。

1.3.2 DNA的提取 將宮頸細胞保存液充分震蕩混勻，取800 μL保存液以14000 r/min離心5 min，棄上清液，用 DNA提取試劑盒按說明書取標本DNA。

1.3.3 PCR擴增 取1 μL樣品做PCR擴增，采用HPV通用引物，引物序列5’端標記生物素做標記，PCR反應體系:將23.5 μL PCR － MIX、0.75 μL Taq 酶和 1 μL DNA 模板混勻，設置陰、陽性對照。反應條件如下:50℃ 10 min，95℃ 9 min;95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72℃ 30 s，共40 個循環(huán);72℃ 5 min。

1.3.4 雜交和顯色 將擴增產物進行95℃ 5 min，快速放入冰浴3 min，取0.5 μL 加入500 μL 雜交液中，在雜交膜上反應10 min，加封阻液反應5 min，用酶標液洗2次，加顯色劑顯色。

1.3.5 結果判斷 肉眼觀察檢測結果，陽性為藍紫色圓點，根據(jù)雜交膜探針分布的位置，判斷陽性點為何種HPV亞型，多個圓點即為多重感染，每次雜交試驗均設陰性、陽性對照。

1.3.6 TCT檢查 采用TCT新柏式技術，薄層細胞片利用ThinPrep 2000系統(tǒng)制作。陰性結果為未見上皮內瘤變或惡性病變(NILM)，陽性結果報告包括鱗狀上皮細胞低度病變(LSIL)、鱗狀上皮細胞高度病變(HSIL)和宮頸鱗癌(SCC)。

1.4 病理活檢報告 分為宮頸炎、上皮內瘤樣病變(CIN)(CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ)、宮頸鱗癌(SCC)，在本研究中CINⅡ、Ⅲ歸為一組。根據(jù)宮頸有無病變及病變程度分4組:①NILM;②LSIL，包括 CINⅠ;③HSIL，包括 CINⅡ、Ⅲ;④SCC。

1.5 統(tǒng)計學處理 用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0進行處理，采用卡方檢驗對計數(shù)資料進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HPV感染與年齡的關系 1145例中檢出HPV陽性357例，陽性率為31.2%;分成5個年齡組，其中18～28歲年齡組152例，HPV陽性68例(44.7%);＞28～38歲年齡組325例，HPV陽性110例(33.8%);＞38～48歲年齡組368例，HPV陽性119例(32.3%);＞48～58歲年齡組232例，HPV陽性47例(20.2%);＞58～68歲年齡組68例，HPV陽性13例(19.1%)。其中18～28歲年齡組HPV陽性率最高。

2.2 TCT檢查各級病變中HPV檢測的結果 在HPV檢測陽性的 357例患者中，TCT檢查陽性 187例，符合率為52.4%，表明在宮頸病變中，HPV檢測的敏感性高于TCT。隨著TCT檢查中宮頸病變程度的增高，HPV和高危型HPV的檢出率也隨之升高，符合程度越來越好。TCT檢查陽性組(包括LSIL、HSIL、SCC)和NILM組相比，HPV和高危型HPV檢出率的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 TCT檢查各級病變中HPV檢測情況 例(%)

2.3 HPV不同亞型感染與宮頸活檢中不同級別宮頸病變的關系 HPV檢測與TCT檢查同時陽性的187例標本，再進行宮頸病理活檢。高危型HPV在各級別宮頸病變中與低危型HPV感染相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時，單一HPV亞型感染在宮頸病變中隨著級別的提高而呈上升趨勢，與多種HPV亞型感染相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 病理活檢報告與HPV感染類型的關系 例(%)

2.4 TCT陽性與病理活檢結果比較 TCT檢查陽性患者187例，與最終組織活檢對照，TCT檢查LSIL診斷符合率74.1%(83/112)，HSIL及SCC的符合率為80.6%(58/72)和100%(3/3)。表明在TCT檢查陽性結果的基礎上進行病理活檢的最后定性，聯(lián)合應用，能夠明顯提高宮頸疾病篩查效率和準確性。見表3。

表3 TCT陽性與病理活檢結果比較 例

3 討論

我國宮頸癌患病率和病死率均約占世界的1/3，每年新增宮頸癌患者13.15萬，約有5萬例死于宮頸癌。自1995年世界衛(wèi)生組織宣布HPV是引起宮頸癌病變的首要因素以來，HPV檢測作為篩查宮頸癌的手段受到了人們的重視。筆者利用DNA雜交分型技術對本院就診的女性進行HPV感染亞型檢查，可見HPV 16，52，58等高危亞型明顯較其他亞型檢出率高，結果與文獻[3]報道相同。此結果可為今后本地區(qū)控制HPV感染及對宮頸病變的早期防治提供依據(jù)。

本研究各年齡段的陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義，提示HPV陽性檢出率和年齡有關系，在18～28歲組最高。隨著年齡的增加，陽性檢出率在逐步降低，這說明HPV感染有年輕化的傾向，主要可能是由于年輕女性性生活頻繁，易受HPV感染，提示對宮頸病變的防治應從年輕女性做起。但大部分HPV感染在性活躍期的年輕女性是暫時的，而35歲以上女性持續(xù)感染高危型HPV是導致這個年齡段女性成為宮頸癌高發(fā)人群的重要原因，子宮頸的CIN到癌是一個相對較長時間的過程，即宮頸感染HPV到最后發(fā)展為宮頸癌，要經歷10 a左右時間。因此加大對35歲以上女性HPV感染監(jiān)測以及宮頸涂片的普查力度，可以進一步減少宮頸癌的發(fā)生。

宮頸癌的發(fā)生與高危型HPV的持續(xù)感染及高病毒載量密切相關[4－5]。本研究結果顯示，在宮頸病變的各個階段，從NILM、LSIL、HSIL到SCC患者中高危型HPV感染率明顯高于低危型HPV，可見高危型HPV的定期篩查可以確定是否有高危型HPV持續(xù)感染，對識別和監(jiān)測HPV感染的高危人群、預防宮頸癌的發(fā)生、治療癌前病變以及復發(fā)監(jiān)測都具有重要的臨床意義。

TCT是一種高效率、高質量的現(xiàn)代新技術制作的單層細胞涂片，效果清晰、閱片容易，采用TBS系統(tǒng)報告方式，簡單明了，使臨床醫(yī)生與病理醫(yī)生有共同語言，可以進行書面交流。TCT與病理活檢相比較，LSIL、HSIL和SCC診斷符合率分別為74.1%，80.6%，100%。TCT檢測結果與病理組織學結果有一定相關性，在病變程度高時TCT檢查與病理活檢符合率高。盡管TCT能提高宮頸細胞學的敏感度及減少假陰性，但由于脫落細胞與活體細胞的特征不完全相同，無組織結構，故脫落細胞不能作為最后的診斷依據(jù)，所以，Hesselink等[6]認為單獨細胞學篩查宮頸病變是不夠的。同樣，單一的HPV－DNA檢測顯然有不足之處。

高危型HPV可導致宮頸癌，但并非所有高危型HPV感染陽性者均會患宮頸癌，即并非所有的宮頸癌患者高危型HPV檢測均呈陽性。因此，檢測高危型HPV并不可能完全取代宮頸涂片、TCT、宮頸活檢等檢查，但是高危型HPV檢測可以作為細胞學檢測的重要補充，在婦女宮頸癌風險評估中起重要作用。進行高危型HPV檢測聯(lián)合細胞學檢查對預防宮頸癌的發(fā)生更有意義，因此，采用TCT標本進行HPV檢測，適用于HPV感染任何時期的診斷，且可避免患者依從性差和標本間的誤差。HPV－DNA分型檢測聯(lián)合TCT，可以最大限度地發(fā)現(xiàn)宮頸異常細胞的同時，及時發(fā)現(xiàn)宮頸癌的誘因，不僅可以分辨出現(xiàn)嚴重病變的婦女，還可以辨別出將來有可能患病的婦女，使針對該病的高危婦女隨訪成為可能。這樣，可以減少HPV陰性女性的就診率，在細胞學正常及不典型增生人群中，對預警宮頸細胞癌變傾向，及時發(fā)現(xiàn)和預防、治療早期宮頸癌均有較大意義。HPV－DNA分型檢測聯(lián)合TCT是篩查早期宮頸病變的最佳選擇，值得在臨床廣泛推廣應用。

綜上所述，在人群的普查中，HPV檢測是一種高效、便捷的排查方法;在高危人群的篩查中，高危型HPV聯(lián)合TCT檢測，所用樣本為宮頸脫落細胞，取樣方便，是一種較好的無創(chuàng)檢查方法，與宮頸活檢的陽性結果符合度高，適用于宮頸癌前病變的篩查;組織活檢可在篩查出的重點對象中使用，確定疾病性質，及早治療。3種檢測手段有機結合使用，能夠最大限度地彌補各種單一篩查方法的缺陷，對于判斷人群中宮頸病變的發(fā)展趨勢、預防宮頸癌發(fā)生并早期治療具有重要作用。

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