費愛華，陳 淼，潘曙明

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院，上海200092)

心力衰竭是各種病因?qū)е滦募p害的最終歸宿，是急診的常見病和多發(fā)病，對人類健康產(chǎn)生嚴重危害。在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中，一個非常重要的病理生理因素是心臟重構(gòu)。而在心肌重構(gòu)過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF－β)發(fā)揮至關重要的作用。丹參作為活血化瘀的傳統(tǒng)中藥之一，在臨床上被廣泛應用于心臟病、腦動脈硬化、老年性癡呆和糖尿病性微血管疾病等的防治[1]。丹參的主要作用成分為水溶性酚酸類物質(zhì)，其主要的活性成分是丹酚酸B。丹參多酚酸鹽可能通過其抗氧化作用，抑制TGF－β信號通路的活化，從而減輕心肌重構(gòu)。本研究在H2O2誘導培養(yǎng)的氧化損傷大鼠心肌細胞模型上，檢測丹參多酚酸鹽處理前后心肌細胞TGF－β通路相關蛋白的表達情況，為進一步研究丹參多酚酸鹽抗氧化損傷防治心肌細胞重構(gòu)的作用提供理論依據(jù)，為心力衰竭的預防提供新思路。

1 實驗資料

1.1 原代心肌細胞的培養(yǎng) 選用1～3 d齡SD大鼠，用2%碘酊和75%乙醇按照順序消毒胸部、腹部皮膚，用無菌手術(shù)包中的剪子沿劍突下胸骨中線剪開胸骨至鎖骨，用彎眼科鉗將暴露良好的心臟夾出，放置DMEM培養(yǎng)液中。將夾出的心臟放在超凈工作臺內(nèi)，心室剪成兩瓣，心肌反復3次洗滌后移入青霉素瓶中，加入D－Hanks液1 mL，用彎眼鉗將心尖部剪成約1 mm3大小，然后將剪碎后的心肌組織用吸管移入帶刻度的離心管(5 mL)，棄上清后再洗滌1次后加入25%胰蛋白酶溶液5 mL，放置在37℃水浴中消化5 min，在消化液加入DMEM培養(yǎng)液稀釋，用吸管吸取細胞消化液至加入濃度為10%左右的新生小牛血清的培養(yǎng)瓶中，終止消化;經(jīng)過12次左右的反復消化，可將組織基本消化完。將細胞液收集離心，接種于培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁分離法將培養(yǎng)瓶中的單細胞懸液孵育1.5～2h。將未貼壁的心肌細胞懸液吸出，將細胞混懸于5－溴脫氧尿嘧啶終濃度為0.1 mmol/L的含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細胞計數(shù)，接種密度為106，接種于不同細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)在培養(yǎng)箱。24 h后細胞貼壁，48 h后心肌細胞同步性的搏動，倒置相差顯微鏡觀察心肌細胞活動狀態(tài)(見圖1 )，心肌細胞搏動的頻率各不相同(23～207次/min)，以60～90次/min居多。2d后更換為10%胎牛血清的培養(yǎng)液。48 h后換無血清培養(yǎng)液，之后根據(jù)細胞代謝狀況每2d換無血清培養(yǎng)液1次。

圖1 培養(yǎng)2d的單個心肌細胞

1.2 心肌細胞分離、純化 將原代心肌細胞培養(yǎng)液裝入離心管中，1000 r/min離心5 min，用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇1×105制成細胞懸液，將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入96孔細胞板中，每孔100 μL，使其均勻分布，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天加藥處理。

1.3 Alamar Blue法測定細胞活力 在V型96孔中加入196 μL無FBS/PS的培養(yǎng)基。建立氧化損傷模型，分為對照組、H2O2損傷組、丹參多酚酸鹽組和抑制劑組，在V型96孔板中分別加入 H2O2(100 μmol/L)，H2O2(100 μmol/L)+ 丹參多酚酸鹽(上海綠谷制藥有限公司，0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L)，抑制劑10 μmol/L。在96孔細胞板中加入藥物10 μL/孔，處理72h后檢測。

1.4 Western blot法檢測TGF－β和Smad2/3蛋白表達情況①蛋白質(zhì)抽提:將細胞培養(yǎng)在60 mm培養(yǎng)皿中，收集培養(yǎng)液中的死細胞和貼壁的活細胞于制備好的裂解液浸提。將浸提好的樣本，于4℃、10000 r/min條件下離心5 min。將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。②采用Bradford方法進行蛋白質(zhì)濃度的測定:標準曲線制作后，向加入考馬斯亮藍溶液的各離心管中加入99 μL 0.15 mol/L NaCl溶液和蛋白質(zhì)抽提液，混勻放置5 min，將溶液倒入比色杯中，在做好標準曲線的程序下按sample測樣品，每測定完一個樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5 mL)，再用無菌水洗1次，然后測定下一個樣品，測定完畢，得到樣品的蛋白質(zhì)濃度數(shù)據(jù)。③實驗:首先制作分離膠和濃縮膠，將配置好的膠組裝入垂直板電泳槽中，將樣品按比例混合上樣緩沖液，蛋白質(zhì)分子量指示劑為預染標記。接著電泳操作，直至溴酚藍電泳到達膠底部，關閉電源，電泳操作完成。在轉(zhuǎn)印槽中轉(zhuǎn)膜，放入組裝好的夾心設備，接通電源，根據(jù)目的蛋白分子量大小轉(zhuǎn)印，30～45 min后，轉(zhuǎn)印完成。取下轉(zhuǎn)印好的PVDF膜，放于5%的脫脂牛奶中，輕輕搖動，封閉1 h。一抗孵育和二抗孵育后，顯影、定影，對晾干后的膠片進行圖像掃描、分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計處理。結(jié)果以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用Duncan法進行單因素方差分析，用LSD－t檢驗進行兩個參數(shù)比較，采用相關分析進行兩個變量間的關系分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細胞活性比較 對照組、H2O2損傷組、丹參多酚酸鹽0.05 g/L組、丹參多酚酸鹽0.10 g/L組、丹參多酚酸鹽0.50 g/L組和抑制劑組細胞活性分別為(100.00±8.50)%，(99.44 ±1.69)%，(116.16 ± 4.22)%，(146.67 ±5.05)%，(74.49 ±0.09)%，(81.70 ± 8.83)%。H2O2損傷組細胞活力與對照組比較差異不顯著;丹參多酚酸鹽0.05 g/L組和0.1 g/L組細胞活力明顯高于對照組(P均＜0.01)，而丹參多酚酸鹽0.5 g/L組和抑制劑組細胞活力明顯低于對照組(P均 ＜0.01)。

2.2 TGF－β受體和Smad2/3蛋白表達 與TGF－βR1相比，Smad2/3蛋白含量對H2O2處理后丹參多酚的處理濃度相對滯后，由此可推測，在信號通路中Smad2/3蛋白位于TGF－βR1的下游。見圖2。

2.3 Western blot檢測TGF－β受體和Smad2/3蛋白表達量H2O2損傷組TGF－βR1和Smad2/3含量高于對照組;丹參多酚酸鹽0.05 g/L組和0.1g/L組TGF－βR1和 Smad2/3含量均明顯低于H2O2損傷組(P均＜0.05)。丹參多酚酸鹽0.5 g/L組TGF－βR1和Smad2/3含量明顯高于H2O2損傷組。抑制劑組TGF－βR1和Smad2/3含量明顯低于H2O2損傷組(P均 ＜0.05)。見表1。

圖2 TGF－β1受體和Smad2/3蛋白表達情況

表1 各組TGF－β受體和Smad2/3蛋白表達量(±s)

表1 各組TGF－β受體和Smad2/3蛋白表達量(±s)

組別 TGF－β受體Smad2/3對照組0.26 ±0.030.37 ±0.14 H2O2 損傷組 0.64 ±0.230.70 ±0.36丹參多酚酸鹽0.05 g/L 組 0.37 ±0.090.41 ±0.28丹參多酚酸鹽0.1 g/L 組 0.50 ±0.180.35 ±0.16丹參多酚酸鹽0.5 g/L 組 0.82±0.241.42±0.52抑制劑組0.06 ±0.010.21 ±0.01

3 討論

心臟疾病一直是醫(yī)學界研究的熱點和難點。心肌細胞是心臟的基本構(gòu)成單位。離體培養(yǎng)的原代心肌細胞作為一種重要的研究模型，可保存心肌細胞體內(nèi)大部分形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時保持功能上的某些特點，可進行各種心肌細胞生理、病理、代謝、藥理、生長發(fā)育等基礎研究[2]，為探索心肌細胞在非血流動力學因素下作用機制提供了良好的實驗工具，已被廣泛應用于心血管疾病的研究。

心肌細胞增殖分化和心肌細胞肥大是心肌細胞生長的2種形式，引起心肌收縮能力減弱，從而使心臟的血液排出量減少，逐漸惡化的心功能導致心力衰竭。心力衰竭是各種病因?qū)е滦呐K損害的最終歸宿，可嚴重影響患者的生活質(zhì)量，對人類健康產(chǎn)生嚴重危害。在心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中，心臟重構(gòu)是一個重要病理生理過程，包括細胞膠原纖維網(wǎng)的重構(gòu)、心肌細胞的重構(gòu)、細胞外基質(zhì)的重構(gòu)。TGF－β是一種多肽類生長因子，廣泛存在于多種組織和細胞中，具有多種功能，能促進細胞增殖、分化和細胞外基質(zhì)分泌，從而參與調(diào)控生物體免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、血管形成等生理過程[3]。TGF－β是心肌重構(gòu)過程中一條重要的信號通路，在心肌重構(gòu)過程中發(fā)揮至關重要的作用。

TGF－β 有 TGF－β1～5亞單位[4]，哺乳動物有 β1、β2、β33種亞單位，其中TGF－β1在體細胞中所占比例最高、活性最強、分布廣泛。TGF－β1最初是以無活性的前體蛋白形式出現(xiàn)，經(jīng)酶解后形成有活性的TGF－β1[5]。在心肌肥大過程中TGF－β1發(fā)揮作用。壓力刺激及AngⅡ等各種因素刺激下，心肌局部以自分泌和旁分泌方式分泌 TGF－β1，后者在心肌肥大、心力衰竭中發(fā)揮著重要作用[6]。

丹參是一種傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，在臨床上廣泛用于治療心血管疾病。我國目前生產(chǎn)的丹參及其復方制劑品種繁多，有效成分不明確是丹參及其復方制劑等產(chǎn)品存在的普遍現(xiàn)象，結(jié)果是引起臨床療效不夠穩(wěn)定。通過對丹參有效成分進行研究發(fā)現(xiàn)，丹參活血化瘀作用的最有效活性成是丹酚酸B，丹酚酸B具有抗血小板、抗氧化、拮抗鈣離子內(nèi)流、抗再灌注損傷、抗神經(jīng)退行性變等作用[7]。注射用丹參多酚酸鹽是由中藥丹參經(jīng)提取精制的多酚酸鹽類化合物制備而成，丹酚酸B鎂含量超過80%。丹酚酸B在心血管系統(tǒng)方面具有廣泛的藥理作用，對脂質(zhì)過氧化引起的細胞膜損傷有明顯的保護作用[8]。近年來研究顯示丹酚酸鹽有保護內(nèi)皮細胞、改善內(nèi)皮功能，抗動脈粥樣硬化、抑制血小板聚集和抗血栓形成作用，對心肌具有保護作用[9]。

首先，丹酚酸B有保護心肌作用。武駿等[10]研究顯示，丹酚酸B可能通過降低心率及增加冠脈血流量，從而改善病變心肌供氧和耗氧平衡，發(fā)揮保護心肌的作用。其次，丹酚酸B對冠狀動脈粥樣硬化有預防作用。1989年初發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子/血管通透因子(VEGF)是一種高度特異的、多功能的血管內(nèi)皮促分裂因子和血管生成因子。它的作用沒有種屬特異性，在已知的生長因子中，只有VEGF可誘導蛋白外滲和血管通透性增加。張黎等[11]報道，丹酚酸B通過抑制內(nèi)皮細胞中血管內(nèi)皮生長因子蛋白及血管內(nèi)皮生長因子的表達，發(fā)揮預防和治療冠狀動脈粥樣硬化的作用。另外，丹酚酸B有抑制血小板聚集和抗血栓作用。韓紀舉等[12]研究結(jié)果顯示，丹酚酸B通過抑制血小板釋放各種遞質(zhì)和/或阻止血小板上膠原受體與相關表面的膠原蛋白結(jié)合，表明丹酚酸B具有明顯的抗血小板黏附聚集作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞活力與丹參多酚酸鹽處理之間有一定的濃度效應，濃度為0.05 g/L和0.1 g/L丹參多酚酸鹽處理使細胞活力明顯上升。Western實驗結(jié)果顯示，H2O2處理使細胞TGF－βR1含量上升，0.05 g/L和0.1 g/L丹參多酚酸鹽處理可明顯抑制由于H2O2處理引起的TGF－βR1和SMAD2/3含量上升，而抑制劑可明顯地抑制TGF－βR1和SMAD2/3表達，使含量極明顯地下降。研究還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的丹參多酚酸鹽組Smads蛋白表達水平不一致，說明在不同濃度下可能有不同的抗氧化機制，以濃度為0.1 g/L抗氧化損傷作用最強。另外，信號通路中Smad2/3蛋白位于TGF－βR1的下游，這一點符合了就可以解釋TGF－b/smad信號通路激活。

總之，TGF－β是心肌重構(gòu)過程中的一條重要信號通路，氧化應激對該通路具有活化作用，丹參多酚酸鹽對氧化損傷后心肌細胞中TGF－β信號通路具有抑制作用，從而減輕心肌重構(gòu)。本研究為丹參多酚酸鹽抗氧化損傷防治心肌細胞重構(gòu)的作用提供了理論依據(jù)，為心力衰竭的預防提供了新思路。

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