王素芳，包永波，施淼江，鄭丹妮，楊婷婷，林志華

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315100）

泥蚶血紅蛋白的制備及其抗菌活性研究

王素芳1，2，包永波2*，施淼江2，鄭丹妮2，楊婷婷1，2，林志華2

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315100）

利用凝膠層析技術(shù)從泥蚶血細(xì)胞裂解物中分離純化得到兩種血紅蛋白，回收率為74.3%，并通過(guò)Tricine-SDS-PAGE和質(zhì)譜技術(shù)鑒定為T(mén)g-HbⅠ（同源二聚體）和Tg-HbⅡ（異源四聚體）。分別通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法和分光光度法測(cè)其抗菌活性和過(guò)氧化物酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種Tg-Hb對(duì)大腸桿菌和惡臭假單胞桿菌均有抗菌活性，Tg-HbⅡ?qū)τ趷撼艏賳伟痛竽c桿菌的MIC值分別為0.063 mg／mL和0.13 mg／m L，Tg-HbⅠ對(duì)兩種菌的MIC均為0.048 mg／m L；兩種Tg-Hb均具有過(guò)氧化物酶活性，能催化愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、苯酚、左旋多巴等多種酚類(lèi)物質(zhì)。在Tg-Hb中添加GSH后，兩種Tg-Hb均不再對(duì)惡臭假單胞桿菌具有抗菌活性?？梢?jiàn)，兩種Tg-Hb對(duì)惡臭假單胞桿菌等的抗菌活性均是通過(guò)其過(guò)氧化物酶活性發(fā)揮作用的。

泥蚶；血紅蛋白；抗菌活性；過(guò)氧化物酶活性

1 引言

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是生物界分布最廣的一類(lèi)呼吸蛋白，主要在脊椎動(dòng)物和部分無(wú)脊椎動(dòng)物中存在［1］。近十多年的研究發(fā)現(xiàn)，Hb除了具有運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧氣的功能外，還具有調(diào)節(jié)p H值、控制體內(nèi)一氧化氮水平、參與免疫反應(yīng)、運(yùn)輸硫化物、類(lèi)卵黃蛋白原以及調(diào)節(jié)浮力等多種生物學(xué)功能［2—3］。盡管Hb是研究最多的一類(lèi)呼吸蛋白，但以往的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)與攜氧功能方面。直到近幾年，受血藍(lán)蛋白抗菌活性研究的啟發(fā)，一些科學(xué)家才開(kāi)始關(guān)注Hb的抗菌活性，Neajar-Arroume等［4—6］幾位科學(xué)家先后報(bào)道了脊椎動(dòng)物Hb及其多肽片段的抗菌活性，關(guān)于無(wú)脊椎動(dòng)物Hb的抗菌活性的研究就更少。

泥蚶Tegillarca granosa隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)瓣鰓綱，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，同時(shí)又是一類(lèi)較特殊的含有Hb的雙殼貝類(lèi)。因其沒(méi)有T細(xì)胞，缺乏真正意義上的抗體、沒(méi)有類(lèi)似脊椎動(dòng)物的特異性免疫系統(tǒng)，因而只能依靠血細(xì)胞及體液因子的先天免疫反應(yīng)來(lái)抵御外界環(huán)境中病原微生物的入侵。因此，進(jìn)行泥蚶血紅蛋白（Tg-Hb）的抗菌活性研究不僅有利于提高其自身的抗病能力，對(duì)于無(wú)脊椎動(dòng)物免疫學(xué)的發(fā)展也具有重要的理論與實(shí)踐意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

泥蚶購(gòu)自寧波市鄞州區(qū)東裕菜市場(chǎng)。金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌ATCC35218、惡臭假單胞菌CGMCC1.0593、副溶血弧菌和哈維氏弧菌為浙江萬(wàn)里學(xué)院微生物與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。還原型谷胱甘肽（GSH）為Sigma公司產(chǎn)品，血紅蛋白濃度測(cè)定試劑盒為北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.1.2 主要儀器

AKTA蛋白層析系統(tǒng)（Explore100，GE公司），均質(zhì)機(jī)（SH-2A，IKA公司），紫外分光光度計(jì)（3300 pro，美國(guó)Amershaw），二維納升級(jí)超高效液相質(zhì)譜串聯(lián)儀（Nano Acquity UPLC／Synapt G2 MS，Waters）凝膠排阻色譜柱Sephacryl S-100 HR（HiPrep26／60，GE公司），CM-Sepharose Fast Flow（GE公司），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-100SⅡ，上海迅博實(shí)業(yè)有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162，上?；厶﹥x器制造有限公司）。

2.2 泥蚶血紅蛋白的分離純化

將新鮮的泥蚶洗凈后，在潔凈的海水中吐沙4 h。撬開(kāi)貝殼后，采集血液，置于含有檸檬酸抗凝劑的離心管中，2 000 r／min離心10 min，得血細(xì)胞。用0.9%NaCl溶液多次洗滌至上層溶液無(wú)色透明，用PBS緩沖液懸浮，勻漿破碎，以12 000 r／min的轉(zhuǎn)速4℃離心30 min，上清為泥蚶血紅蛋白粗品。

將上述的血紅蛋白粗品上Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱，用PBS緩沖液以0.3 m L／min的流速洗脫，以2 mL／管收集洗脫液，用280 nm和415 nm兩種波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫液。

2.3 泥蚶血紅蛋白濃度測(cè)定

采用血紅蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定。測(cè)濃度分別為0、25、50、75、100 g Hb／L的氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液540 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A），以A為橫坐標(biāo)Hb濃度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求斜率K值，

取5μL樣品液加入含1 mL B1溶液的比色皿中，混勻用B1做空白，在595 nm下測(cè)吸光度（C），

2.4 Tricine-SDS-PAGE

Tricine-SDS-PAGE參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，其中濃縮膠聚丙烯酰胺濃度為4%，分離膠濃度為16%。電泳結(jié)束后，以考馬斯亮藍(lán)染色。

2.5 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)抑菌活性

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用無(wú)菌生理鹽水配制成105cfu／m L的菌懸液，取200μL均勻涂布在制好的培養(yǎng)基上，放置牛津杯后依次加入200μL生理鹽水、HbⅠ（1.5 mg／mL）和HbⅡ（2 mg／m L）。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和惡臭假單孢桿菌置37℃生化箱培養(yǎng)24 h，哈維式弧菌和副溶血弧菌則置28℃生化箱培養(yǎng)24 h，取出觀察拍照。

2.6 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法。將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加Tg-Hb，每孔100μL，第12孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照。將濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1∶1 000稀釋后，向每孔中加20μL，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16～20 h判斷結(jié)果。

2.7 過(guò)氧化物酶活性測(cè)定

取1 mL 50 mmol／L磷酸鹽緩沖液（4 mmol／L愈創(chuàng)木酚2 mmol／L H2O2）于一次性比色皿中，加入血紅蛋白，在25℃470 nm波長(zhǎng)處，用動(dòng)力學(xué)模式，測(cè)其30 s內(nèi)的A470的變化。

2.8 米氏常數(shù)的測(cè)定

分別用鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、苯酚、3-羥基-L-酪氨酸（L-DOPA）L-酪氨酸和對(duì)甲酚等代替愈創(chuàng)木酚反應(yīng)，在25℃測(cè)其30 s內(nèi)的A470的變化。以1／ΔA為縱坐標(biāo)，以1／［S］橫坐標(biāo)做雙倒數(shù)圖，求各酚類(lèi)物質(zhì)的米氏常數(shù)。

2.9 泥蚶血紅蛋白的質(zhì)譜鑒定

將收集的峰2、峰3樣品，胰蛋白酶消化后用二維納升級(jí)超高效液相質(zhì)譜串聯(lián)儀分析。將得到的數(shù)據(jù)用Mascot檢索引擎在Swiss Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 泥蚶血紅蛋白的分離純化

血紅蛋白粗品經(jīng)凝膠層析后，洗脫圖譜見(jiàn)圖1。根據(jù)280 nm和415 nm（Tg-Hb在415 nm處有特征性的高吸光度）兩種波長(zhǎng)下的檢測(cè)圖譜，可初步判斷峰1主要為雜蛋白，峰2、峰3為T(mén)g-Hb的洗脫峰。已有文獻(xiàn)報(bào)道［8］，貝類(lèi)血紅蛋白含有同源二聚體（HbⅠ）和異源四聚體（HbⅡ）兩種形式，其同源二聚體含有兩個(gè)相同或相似的亞基，每個(gè)亞基的分子質(zhì)量約為15～16 kD；而異源四聚體則具有α2β2結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量約為60～70 k D?？梢?jiàn)，峰2為泥蚶血紅蛋白Ⅱ（Tg-HbⅡ），峰3為泥蚶血紅蛋白Ⅰ（Tg-HbⅠ）。Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示，峰1成分非常復(fù)雜，含多種大分子量的蛋白條帶，峰2樣品有兩個(gè)蛋白條帶，峰3樣品為單一條帶。Tricine-SDSPAGE中，峰2、峰3樣品均未出現(xiàn)雜蛋白條帶，說(shuō)明均達(dá)到了較高的純度（圖2），由于分離過(guò)程簡(jiǎn)單，Tg-Hb的回收率比較高，達(dá)74.3%（表1）。

圖1 泥蚶血紅蛋白的凝膠層析圖Fig.1 Gel chromatography of Tg-Hb

圖2 洗脫峰的Tricine-SDS-PAGE 1為峰1；2為峰2；3為峰3；M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Fig.2 Tricine-SDS-PAGE analysis of elution peak Lanes 1 to 3 indicate samples of peak 1，peak 2 and peak 3，M indicate marker

表1 泥蚶血紅蛋白的回收率Tab.1 Recovery of Tg-Hb from the blood of Tegillarca granosa

3.2 泥蚶血紅蛋白的質(zhì)譜鑒定

為了進(jìn)一步確定峰2、峰3組分是泥蚶血紅蛋白，對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定（圖3、4）。結(jié)果顯示，峰2的一條鏈與不等殼毛蚶Scapharca inaequivalvisHbⅡ-A最相似；一條鏈與梯形毛蚶Anadara trapezia血紅蛋白的β鏈最相似；峰3與不等殼毛蚶的HbⅠ（同源二聚體）最相似。最終，峰2鑒定為T(mén)g-HbⅡ（異源四聚體），峰3鑒定為T(mén)g-HbⅠ（同源二聚體），與3.1中的推斷一致。

圖3 凝膠層析峰2的質(zhì)譜圖Fig.3 MSspectrum for peak 2 of gel chromatography

圖4 凝膠層析峰3的質(zhì)譜圖Fig.4 MSspectrum for peak 3 of gel chromatography

3.3 泥蚶血紅蛋白的抗菌活性

瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)了Tg-Hb對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、惡臭假單胞菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌等菌的抗菌活性。結(jié)果表明，兩種Tg-Hb對(duì)大腸桿菌、惡臭假單胞菌這兩種革蘭氏陰性菌均有抗菌效果，有明顯的抑菌圈，而未檢測(cè)到Tg-Hb對(duì)其他幾種菌的抑菌圈（見(jiàn)表2），可見(jiàn)兩種Tg-Hb的抗菌活性都有選擇性。Tg-HbⅡ?qū)Υ竽c桿菌和惡臭假單胞菌的MIC分別為0.13 mg／mL和0.063 mg／mL（見(jiàn)表3），Tg-HbⅠ對(duì)兩種菌的MIC均為0.048 mg／mL（見(jiàn)表4）。

表2 泥蚶血紅蛋白對(duì)6種菌的抗菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of Tg-Hb against bacteria

表3 不同濃度Tg-HbⅠ的抗菌效果Tab.3 Antibacterial activities of Tg-HbⅠat different concentration

表4 不同濃度Tg-HbⅡ的抗菌效果Tab.4 Antibacterial activities of Tg-HbⅡat different concentration

3.4 泥蚶血紅蛋白的抗菌機(jī)制

酶活性研究結(jié)果表明，兩種Tg-Hb均具有過(guò)氧化物酶活性（見(jiàn)圖5），能催化多種酚類(lèi)物質(zhì)（見(jiàn)表5）。一般認(rèn)為，過(guò)氧化物酶可催化酚類(lèi)物質(zhì)生成醌及其后續(xù)一系列的產(chǎn)物，在此過(guò)程中產(chǎn)生活性氧（ROS），從而起到抗菌作用。本研究證實(shí)了這一點(diǎn)，在添加40 mmol／ L還原型谷胱甘肽（GSH，活性氧清除劑）的實(shí)驗(yàn)組，Tg-Hb的抗菌能力喪失（見(jiàn)圖6）。因此判斷，Tg-Hb的抗菌活性與其過(guò)氧化物酶活性相關(guān)，通過(guò)過(guò)氧化物酶活性產(chǎn)生的活性氧發(fā)揮抗菌作用，當(dāng)產(chǎn)生的ROS被GSH清除后，便不能發(fā)揮抗菌作用。但為什么Tg-Hb的抗菌作用有選擇性，這需要進(jìn)一步深入研究。

圖5 Tg-Hb的過(guò)氧化物酶活性Fig.5 Peroxidase activity of Tg-Hb

表5 Tg-Hb的底物特異性Tab.5 Substrate specificity of Tg-Hb

圖6 GSH對(duì)泥蚶血紅蛋白抗菌活性的影響Fig.6 Effect of GSH on the antibacterial activity of Tg-Hb

4 討論

4.1 泥蚶血紅蛋白的分離純化

開(kāi)展Tg-Hb免疫學(xué)研究的前提是得到純化的Tg-Hb，但直到目前為止，仍未見(jiàn)到有關(guān)Tg-Hb高效分離純化的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在既往的研究中，已經(jīng)克隆到Tg-Hb 3個(gè)亞基的基因Tg-HbⅠ、Tg-HbⅡA和Tg-HbⅡB［9］，并用軟件預(yù)測(cè)其分子量分別為16.04 k Da、16.23 kDa和17.23 k Da，等電點(diǎn)分別為9.144、8.836和5.745，因此進(jìn)一步推斷Tg-HbⅠ、Tg-HbⅡ的分子量分別約為32 kDa和67 k Da，等電點(diǎn)可能分別在9和7.3附近。根據(jù)兩種Tg-Hb等電點(diǎn)和分子量的差異，選擇了陽(yáng)離子交換層析和凝膠層析兩種層析技術(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子交換層析并不適合Tg-Hb的純化。在上樣緩沖液p H6.0條件下，陽(yáng)離子交換層析僅能吸附Tg-HbⅠ，不吸附Tg-HbⅡ，因此不能實(shí)現(xiàn)兩種Tg-Hb的同時(shí)純化。此外，在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)Tg-Hb在偏離p H7.2的環(huán)境下易解聚，在p H6.0的條件下過(guò)夜就有一部分Tg-HbⅠ解聚成單體，因此采用進(jìn)一步降低上樣緩沖液p H的方法更不可行。凝膠層析技術(shù)能實(shí)現(xiàn)兩種高純度Tg-Hb的同時(shí)分離，回收率高達(dá)74.3%（見(jiàn)圖1～3），而且凝膠層析采用的是p H7.2的PBS緩沖液，兩種Tg-Hb在p H7.2的PBS緩沖液中穩(wěn)定性都較好。此外，本研究采用280 nm和415 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫峰，實(shí)現(xiàn)了Tg-Hb峰方便快速判斷，為其他物種血紅蛋白的分離純化提供了參考。

4.2 泥蚶血紅蛋白的抗菌活性

近些年，呼吸蛋白的抗菌作用已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，已有多位科學(xué)家證實(shí)了部分呼吸蛋白的抗菌作用。Fang等［5—6］發(fā)現(xiàn)人血紅蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌的抗菌作用；荊昭［3］發(fā)現(xiàn)毛蚶Scapharca kagoshimensis血紅蛋白對(duì)枯草桿菌和四聯(lián)球菌等菌具有抗菌作用；Jiang等［6］的研究表明鱟血藍(lán)蛋白就具有抗金黃色葡萄球菌等菌的作用；Deloffre等［10］發(fā)現(xiàn)沙蠶Nereis diversicolor血紫蛋白也具有抗細(xì)菌活性。本研究則證實(shí)Tg-Hb對(duì)大腸桿菌和惡臭芽孢桿菌等部分革蘭氏陰性菌的抗菌作用。

呼吸蛋白的酶活性方面，關(guān)于血藍(lán)蛋白的酚氧化酶活性的報(bào)道較多。多位科學(xué)家［11—15］已證明血藍(lán)蛋白能被SDS、胰蛋白酶和入侵微生物等因子激活，具有酚氧化物酶活性，產(chǎn)生ROS，發(fā)揮抗菌作用。血藍(lán)蛋白為什么具有酚氧化酶活性，一些科學(xué)家從結(jié)構(gòu)方面找到了答案。血藍(lán)蛋白與酚氧化物酶同屬于Ⅲ型銅蛋白，都具有兩個(gè)銅離子，在活性位點(diǎn)的基因序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均具有高度的相似性［16］。Hb雖然是研究最廣泛和深入的呼吸蛋白，但長(zhǎng)期以來(lái)，關(guān)于Hb結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究都集中在它如何與O2結(jié)合、分離和運(yùn)輸O2等方面，Hb的類(lèi)酶催化活性方面研究不多。2002年，Kawano等［17］發(fā)現(xiàn)人血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性，但其后大家的目光均集中在人血紅蛋白的過(guò)氧化物酶活性對(duì)機(jī)體的傷害［18］及作為過(guò)氧化物酶替代品的可行性研究方面［19—20］，并沒(méi)有意識(shí)到Hb具有抗菌活性，更沒(méi)有意識(shí)到Hb可利用其過(guò)氧化物酶活性發(fā)揮抗菌作用。受血藍(lán)蛋白抗菌及酚氧化酶研究的啟發(fā)，一些科學(xué)家也開(kāi)始關(guān)注Hb的抗菌作用及其與過(guò)氧化物酶活性的關(guān)系。Fang［5］的研究表明，當(dāng)有細(xì)菌侵入機(jī)體時(shí)人血紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白會(huì)釋放出ROS，迅速殺死致病微生物。Jiang等［6］研究得出人血紅蛋白在入侵病菌毒力因子的刺激下獲得了一種過(guò)氧化物酶的活性，催化產(chǎn)生ROS，進(jìn)而產(chǎn)生有毒衍生物，起到殺菌作用。

本研究進(jìn)一步證實(shí)了Tg-Hb對(duì)大腸桿菌和惡臭芽孢桿菌等部分革蘭氏陰性菌也有抗菌作用，也檢測(cè)到了其過(guò)氧化物酶活性，并且證明Tg-Hb的抗菌活性與其過(guò)氧化物酶活性有關(guān)（見(jiàn)圖5、6）。此外，Tg-Hb的抗菌作用具有選擇性，如對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌等菌并沒(méi)有抗菌作用，這又說(shuō)明其本身的過(guò)氧化物酶活性可能偏低，不足以抗菌。分析其抗菌機(jī)理，很可能是敏感菌分泌物或組分進(jìn)一步激活了它的過(guò)氧化物酶活性，產(chǎn)生了大量的ROS，從而發(fā)揮抗菌作用。這些發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步闡明Hb的抗菌機(jī)制提供了新的思路。

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Purification and antibacterial activity of hemoglobin from Tegillarca granosa

Wang Sufang1，2，Bao Yongbo2，Shi Miaojiang2，Zheng Danni2，Yang Tingting1，2，Lin Zhihua2

（1.School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

Two kinds of hemoglobins were purified by gel chromatography with a recovery 74.3%.They were identified as Tg-HbⅠ（homodimer）and Tg-HbⅡ（heterogeneous tetramer）by Tricine-SDS-PAGE and mass spectrometer.The agar diffusion method and spectrophotometric method were used to detect their antibacterial activity and peroxidase activity，respectively.Results showed that both hemoglobins exhibited antibacterial activities againstEschetichia coliandPseudomonas putida.The MIC values of Tg-HbⅡtowardsE.coliandP.putidawere 0.063 mg／mL and 0.13 mg／m L，while corresponding data of Tg-HbⅠwere 0.048 mg／m L.Both hemoglobins showed peroxidase activities，which could catalyze various of phenolic substances，such as guaiacol，pyrocatechol，hydroquinone，phenol，L-DOPA，etc.Both hemoglobins lost their antibacterial activities againstP.putidain the presence of GSH，indicating that they played the antibacterial abilities through their peroxidase activities.

Tegillarca granosa；hemoglobin；antibacterial activity；peroxidase activity

S944.4+4

A

0253-4193（2014）12-0067-07

王素芳，包永波，施淼江，等.泥蚶血紅蛋白的制備及其抗菌活性研究［J］.海洋學(xué)報(bào)，2014，36（12）：67—73，

10.3969／j.issn. 0253-4193.2014.12.006

Wang Sufang，Bao Yongbo，Shi Miaojiang，et al.Purification and antibacterial activity of hemoglobin fromTegillarca granosa［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（12）：67—73，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.12.006

2014-01-15；

2014-03-27。

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA10A410）；寧波市自然基金項(xiàng)目（2013A610161）；浙江省教育廳高?？蒲许?xiàng)目（Y201225951）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310876018）；寧波市海洋貝類(lèi)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2011B82017）；水產(chǎn)科學(xué)浙江省重中之重學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目。

王素芳（1977—），女，山東省單縣人，博士，主要研究水產(chǎn)資源的開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：24274414＠qq.com

*通信作者：包永波，主要從事貝類(lèi)功能基因和蛋白組研究。E-mail：bobbao2001＠gmail.com