林森杰，王路，鄭連明，董云偉，柳淑芳，丁少雄，葉乃好，曹文清，莊志猛

（1.廈門大學(xué)海洋生物多樣性與全球變化研究中心，福建廈門 361005；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266000）

海洋生物DNA條形碼研究現(xiàn)狀與展望

林森杰1，王路1，鄭連明1，董云偉1，柳淑芳2，丁少雄1，葉乃好2，曹文清1，莊志猛2

（1.廈門大學(xué)海洋生物多樣性與全球變化研究中心，福建廈門 361005；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266000）

海洋生物種類多樣，分布廣泛，具有復(fù)雜性、多樣性和趨同性等特點(diǎn)，為了對(duì)物種進(jìn)行更快速、準(zhǔn)確地鑒定，急需在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)上，建立并結(jié)合便捷準(zhǔn)確的分子鑒定手段。DNA條形碼提供了可信息化的分類標(biāo)準(zhǔn)和有效的分類學(xué)手段，已成為近年來(lái)分類學(xué)與生物多樣性研究中重要的技術(shù)依托。本文概述了DNA條形碼當(dāng)前的發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢(shì)，并介紹了DNA條形碼技術(shù)在主要海洋浮游植物（紅藻、褐藻、綠藻、硅藻、甲藻）、無(wú)脊椎動(dòng)物（海綿動(dòng)物、刺胞動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物等）和魚(yú)類中的研究進(jìn)展，以及不同條形碼基因針對(duì)于不同生物類群的有效性和適用性，指出了目前條形碼技術(shù)在各海洋類群中存在的主要問(wèn)題，并對(duì)未來(lái)的相關(guān)工作做了展望，希望為今后我國(guó)的海洋生物DNA條形碼研究提供理論基礎(chǔ)。

DNA條形碼；海洋生物；形態(tài)分類；分子分類進(jìn)化；條形碼基因

1 引言

面對(duì)未來(lái)食品能源短缺和環(huán)境惡化的危機(jī)，廣袤的海洋正在成為我們賴以生存與發(fā)展的“第二疆土”。在海洋資源中，海洋生物是現(xiàn)今和未來(lái)人類所依賴的最主要、最直接的資源，其不僅能夠維持近海生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，同時(shí)也是重要的食物資源、藥源化合物庫(kù)和能源庫(kù)，對(duì)于維護(hù)和諧的生態(tài)環(huán)境及促進(jìn)人類發(fā)展具有重要意義。物種的快速、準(zhǔn)確鑒定是進(jìn)行海洋生物科學(xué)研究和資源保護(hù)及可持續(xù)性利用的基礎(chǔ)。海洋生物門類繁多、分布廣泛，有的門類因個(gè)體小而外部形態(tài)特征不明顯（如浮游植物），有的門類在不同環(huán)境誘導(dǎo)下存在表型可塑性和趨同進(jìn)化（converging evolution）現(xiàn)象，從而導(dǎo)致海洋生物隱存種屬的普遍存在；而對(duì)生物體殘片（如動(dòng)物食道中部分消化的餌料種）、魚(yú)卵仔魚(yú)等也缺乏足夠的可供鑒定的形態(tài)信息，使得傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法在解決這些問(wèn)題方面存在著諸多局限性。此外，傳統(tǒng)形態(tài)分類不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且過(guò)分依賴研究者的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)和觀察手段，且隨著傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)家隊(duì)伍的日益縮減，基于形態(tài)學(xué)特征的傳統(tǒng)生物分類研究已難以對(duì)眾多的海洋生物進(jìn)行準(zhǔn)確分類。目前急需在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)上，建立便捷準(zhǔn)確的分子鑒定手段，形成適合于海洋生物類群的物種鑒定標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范。

DNA條形碼技術(shù)是利用生物共有的、種間差異明顯的一段DNA序列來(lái)鑒定物種［1］，它提供了可信息化的分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的鑒別技術(shù)，成為發(fā)展最快的前沿學(xué)科之一。所用的DNA片段要求長(zhǎng)度較短、易于擴(kuò)增、變異率適度，種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離，以形成相應(yīng)的條型碼間隔（圖1）。目標(biāo)片段還需要具有足夠的數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以便在獲得DNA序列后，進(jìn)行序列比對(duì)和人工矯正，構(gòu)建簡(jiǎn)易的進(jìn)化樹(shù)（鄰接法Neighbor-joining）并計(jì)算遺傳距離來(lái)判斷未知樣品與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知種類的關(guān)系［2］。這一技術(shù)使物種鑒定過(guò)程實(shí)現(xiàn)信息化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破了傳統(tǒng)形態(tài)分類對(duì)鑒定者個(gè)人能力和經(jīng)驗(yàn)的過(guò)度依賴，并可利用有機(jī)體的殘片和組織進(jìn)行快速有效的鑒定，能夠在較短時(shí)間內(nèi)建立易于利用的分類系統(tǒng)。概而言之，通過(guò)DNA條形碼，能夠準(zhǔn)確地鑒定形態(tài)相似種、隱存種以及處于不同生活史階段的物種，為研究海洋物種提供了海量的、穩(wěn)定的和可比較的數(shù)據(jù)，有助于海洋生物在系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳變異、群落動(dòng)態(tài)及相互關(guān)系等方面的研究［3—5］。

近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外很多文章綜述了海洋生物條形碼的研究概況［4，6-8］，但大多聚焦于某一類的海洋生物。為方便參考和比較，本文將整合最近的研究成果，綜述DNA條形碼技術(shù)在海洋浮游植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和魚(yú)類中的研究現(xiàn)狀，并對(duì)DNA條形碼技術(shù)在未來(lái)海洋生物學(xué)研究中的應(yīng)用前景做出展望。

2 DNA條形碼技術(shù)的起源及發(fā)展現(xiàn)狀

圖1 示意DNA片段作為條型碼的條件Fig.1 The qualification of a gene／fragment as the DNA barcode marker

由于動(dòng)物界線粒體（mt）DNA進(jìn)化速率快于細(xì)胞核DNA［9］，包括細(xì)胞色素B（COB）和細(xì)胞色素C氧化酶第一亞基（COⅠ）基因在內(nèi)的mtDNA早已被用于系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)地理學(xué)研究［10］，然而DNA條形碼這一概念2003年才由Hebert等首次提出［1］。Hebert等對(duì)動(dòng)物界中除刺胞動(dòng)物門以外的所有動(dòng)物門，共11個(gè)門13 320個(gè)物種的COⅠ基因序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其序列間的差異能夠很好的區(qū)分所有研究物種，并因此認(rèn)為COⅠ基因適合作為動(dòng)物DNA條形碼基因［11］。此后，越來(lái)越多的研究都表明此技術(shù)可以進(jìn)行準(zhǔn)確的物種鑒定。目前，利用COⅠ基因片段為標(biāo)記，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了部分動(dòng)物類群的條形碼鑒定，如蝴蝶［12—15］、鳥(niǎo)類［16—19］和魚(yú)類［20—23］。然而在兩棲爬行動(dòng)物的某些類群中COⅠ基因種內(nèi)歧化程度高，致使種內(nèi)與種間的遺傳距離發(fā)生部分重疊現(xiàn)象，給此基因作為條型碼標(biāo)記帶來(lái)挑戰(zhàn)［24］。在陸生植物、原生生物（單細(xì)胞生物）中細(xì)胞器基因的遺傳變異較緩慢［9］，COⅠ種間差異較小，不適合作為DNA條型碼，推動(dòng)了尋找合適的條型碼標(biāo)記的研究。陸生植物的條形碼標(biāo)記DNA探索時(shí)間較長(zhǎng)［25—27］，于2009年的第三次國(guó)際DNA條形碼學(xué)術(shù)大會(huì)上才確立了以葉綠體rbcL（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶大亞基）和matK（葉綠體成熟酶K基因）兩個(gè)基因片段作為核心的植物DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼，用葉綠體trnH-psbA（組氨酸t(yī)RNA基因到光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心D1蛋白基因之間）的間隔區(qū)和核內(nèi)核糖體RNA基因間隔區(qū)（ITS；通常包括ITS1、5.8S、ITS2）為植物DNA條形碼的補(bǔ)充條碼，并推動(dòng)了植物條形碼的相關(guān)項(xiàng)目和組織，如Grass-BOL、Tree-BOL、CFTS Plot和基于植物區(qū)系的條形碼研究。

隨著條形碼技術(shù)的逐步推進(jìn)，各類物種傳統(tǒng)分類信息和DNA條形碼數(shù)據(jù)相繼在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)上發(fā)布。截至2013年2月，BOLD（Barcode of Life Data Sys-tems）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.barcodinglife.org／）已收錄的DNA條形碼序列約250萬(wàn)條，其中具有完整DNA條形碼序列（包含準(zhǔn)確的物種信息和條形碼序列信息）的物種有19萬(wàn)個(gè)［28］。很多國(guó)際組織建立了自己的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，如ABBI（All Birds Barcoding Initiative，http：／／www.barcodingbirds.org／），All Leps（http：／／www.lepbarcoding.org／），TBI（Tephritid Barcode Initiative），MBI（Mosquito Barcode Initiative）等。

海洋生物多樣性高，形態(tài)復(fù)雜多變，DNA條型碼技術(shù)至關(guān)重要但其研究相對(duì)落后。截至2014年6月，已確認(rèn)的世界海洋物種數(shù)為213 611（WoRMS；http：／／www.marineSpecies.org），而已被描述形態(tài)學(xué)特征的物種僅23 712個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于曾經(jīng)預(yù)測(cè)的1 000 000個(gè)物種［29］。隨著DNA條形碼技術(shù)的廣泛應(yīng)用，海洋生物相關(guān)的條形碼序列在近幾年迅速增多，與此同時(shí)海洋中的隱存種和新物種也在被不斷地發(fā)現(xiàn)和定義。通過(guò)十年時(shí)間的調(diào)查研究，“國(guó)際海洋生物普查組織”（the Census of Marine Life，CoML）發(fā)現(xiàn)了約1 200個(gè)新海洋物種，另外有超過(guò)5 000個(gè)物種還在被鑒定和描述中（Co ML website，June 2014）。在BOLD與Co ML共同協(xié)作下建立的“海洋生物條形碼組織”（marine barcode of life，MarBOL），已收錄6 199個(gè)海洋物種的37 182個(gè)條形碼信息（MarBOL website，June 2014）。目前該組織正在迅速地壯大發(fā)展，努力實(shí)現(xiàn)收錄5 451個(gè)不同海洋物種條形碼信息的目標(biāo)。另外，還有一些針對(duì)不同生物群體、生態(tài)系統(tǒng)和地理位置的諸多條形碼組織如FISH-BOL，Sponge Barcoding Project，SharkBOL，ReefBOL，Polar Barcode of Life等，也在近年來(lái)不斷的發(fā)展壯大［5］。而海洋藻類（浮游植物和大型藻）、浮游動(dòng)物和底棲動(dòng)物的DNA條型碼研究起步較晚，還未找到國(guó)際普遍認(rèn)可的統(tǒng)一的條形碼基因，屬于目前海洋生物分類學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。

3 海洋生物研究領(lǐng)域常見(jiàn)DNA條形碼基因

細(xì)胞核編碼的條形碼基因主要包括核糖體RNA的18S（the small-subunit r RNA）、28S（the large-subunit rRNA）和ITS（the internal transcribed spacer）。由于核糖體RNA編碼基因相對(duì)保守，不同區(qū)域進(jìn)化速率各異，適宜于不同分類階元，核基因一直是分類鑒定和系統(tǒng)演化關(guān)系分析的主要依據(jù)，其在數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息也較為完善，例如18S的V4和V9區(qū)經(jīng)常被用于新一代高通量測(cè)序。而近年來(lái)隨著ITS在真菌、藻類、陸生植物和某些動(dòng)物類群中的廣泛應(yīng)用，其在數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息也在迅速擴(kuò)增，被認(rèn)為是最具潛力的條形碼之一。

相對(duì)于植物線粒體基因組，動(dòng)物線粒體DNA上的基因排列相對(duì)緊湊，兩個(gè)rRNA（12S rRNA和16S r RNA）相鄰且沒(méi)有內(nèi)含子，22個(gè)tRNA位于rRNA和13個(gè)蛋白編碼基因（細(xì)胞色素C氧化酶COⅠ、COⅡ、COⅢ；ATP酶亞基ATPase6、8；COB；以及NADH的7個(gè)基因ND1-ND6，ND4L）之間?；陂L(zhǎng)度和進(jìn)化速率的考慮，線粒體的13個(gè)編碼基因中只有COⅠ、COB符合要求，其中COⅠ因其5’端（COⅠ-5P）區(qū)域更容易設(shè)計(jì)較保守的通用性引物，且很少出現(xiàn)內(nèi)含子和插入缺失現(xiàn)象，被認(rèn)為是許多鳥(niǎo)類、昆蟲(chóng)和魚(yú)類等的理想DNA條形碼。目前海洋動(dòng)物常用的標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因也以COⅠ為主，且該基因在一些海洋藻類（紅藻、褐藻）中也得到了嘗試和應(yīng)用，但在珊瑚、?？⒑＞d等特殊群體中由于COⅠ的進(jìn)化速率過(guò)慢，仍然需要尋找和評(píng)估其他的條形碼標(biāo)記。

除陸生植物外，葉綠體水平上的條形碼研究主要集中在藻類，常見(jiàn)基因包括rbcL、UPA（universal primer-based amplicon或通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物，是基于葉綠體的核糖體大亞基的RNA基因）、tufA（葉綠體延伸因子）、rbcSp（Plastid Rubisco operon spacer）等。其中rbcL長(zhǎng)約1 400 bp，在紅藻和硅藻中都有研究；UPA片段是葉綠體23S rRNA基因的V結(jié)構(gòu)域，長(zhǎng)約370 bp，由于其具有較高的通用性和分辨力，被認(rèn)為適用于紅藻的條形碼研究；而tufA的高擴(kuò)增率和無(wú)內(nèi)含子被認(rèn)為適合大型綠藻的鑒定分析。

4 海洋藻類DNA條形碼研究進(jìn)展

海洋藻類的DNA條形碼研究主要集中在硅藻、紅藻和褐藻上，目前核基因ITS和28S rDNA的D1-D3區(qū)，葉綠體基因rbcL和UPA［30］，線粒體基因COⅠ和COB等已在硅藻［31—33］、甲藻［34—36］等單細(xì)胞藻類、以及大型藻［33］中先后被應(yīng)用，這些基因在不同的物種中各有優(yōu)勢(shì)，很難找到像動(dòng)物的COⅠ序列那樣可以在物種鑒定中較通用的條形碼，目前尚未發(fā)現(xiàn)適合藻類的統(tǒng)一條型碼基因，現(xiàn)階段的研究以兩個(gè)或兩個(gè)以上的條形碼基因共同使用為主。

4.1 紅藻及褐藻DNA條形碼的研究進(jìn)展

紅藻門是大型藻中種類最豐富的一個(gè)門類，其形態(tài)在種內(nèi)和種間具有高度可變性，且易受環(huán)境影響，生活史和生殖方式都很復(fù)雜，使得形態(tài)學(xué)分類非常困難［37-40］。大型紅藻已研究的DNA條形碼包括COI基因、UPA基因、28S rDNA、rbcL基因等，其中COI和rbcL被認(rèn)為較適合作為紅藻門的條形碼基因［33，41］，而UPA的種間差異度理想，也在很多類群中得到認(rèn)可［31］。Saunders等［37—38，42］利用COI基因成功區(qū)分了形態(tài)上難以分類的三大混合種，并發(fā)現(xiàn)了加拿大地區(qū)的新物種和外來(lái)入侵種，認(rèn)為COⅠ適合作為此類群的條形碼基因。Tan等對(duì)同一群體的不同區(qū)段進(jìn)行比較，也認(rèn)為COⅠ和rbcL更適合作為整個(gè)紅藻門的條形碼基因［43］。但也有數(shù)據(jù)表明rbcL并不適合紅藻門的分類鑒定，Hind和Saunders對(duì)珊瑚藻屬Chiharaea中的3個(gè)種和2個(gè)新變種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)rbcL序列的種間差異性和遺傳變異速率與COⅠ-5P和ITS不同，可能有雜交或基因滲入現(xiàn)象發(fā)生［44］。

褐藻的形態(tài)差異很大，Clayton將褐藻綱Phaeophyceae分為15個(gè)目，從小型的絲狀體到全長(zhǎng)可達(dá)60 m的巨藻［45—46］。目前褐藻的分子系統(tǒng)學(xué)研究主要集中在r RNA基因、COⅠ、rbcL和rbcS（二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶的小亞基）序列分析上。對(duì)于期待值較高的COⅠ基因，已有的研究結(jié)果顯示此基因能夠準(zhǔn)確地區(qū)分墨角藻屬Fucus［47］和昆布科Laminariaceae［48］中的不同物種；Mattio和Payri在針對(duì)馬尾藻屬不同條形碼基因的分析時(shí)，也暗示了線粒體基因mtsp（mitochondrial targeting signal peptide）、COⅠ和COⅢ作為褐藻條形碼基因的可能性［49］。但是在翅藻屬Alaria中，Lane等發(fā)現(xiàn)單一的COⅠ基因在此類群的種間差異不足，而COⅠ-5P、ITS及葉綠體基因rbcSp 3個(gè)基因片段的組合則能更有效地區(qū)分大部分種類，但作者也認(rèn)為在特殊種群中的欠缺，可能不足以影響COⅠ作為褐藻條形碼基因的普遍適用性［50］。Poong等比較了幾個(gè)褐藻屬的rbcL和COⅠ基因，發(fā)現(xiàn)雖然COⅠ相對(duì)于rbcL無(wú)法解決不同類群的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，但仍能用于該類群的物種鑒定，所以兩個(gè)基因相結(jié)合才能準(zhǔn)確的鑒定該類群并反應(yīng)它們的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，相對(duì)于紅藻的DNA條形碼技術(shù)，褐藻相關(guān)方面的研究尚顯薄弱，需要進(jìn)一步的發(fā)展［51］。

4.2 綠藻DNA條形碼的研究進(jìn)展

目前已有的藻類基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，綠藻的序列信息僅占6%左右，已嘗試過(guò)的條形碼包括COⅠ、rbcL、tufA、ITS等。其中tufA在鑒別海洋大型綠藻時(shí)擴(kuò)增效率高（除剛毛藻屬）、種間差異度大、很少存在內(nèi)含子，被認(rèn)為更適合用于綠藻的分類鑒定，而rbcL在部分種群中明顯存在的內(nèi)含子嚴(yán)重阻礙了此基因作為理想條形碼的可能性［52—53］。盡管在某些群體（Pseudomuriella）中COⅠ表現(xiàn)出明顯的種間差異性，卻很難找到合適的通用引物［53］。另外ITS區(qū)域也在綠藻群體中表現(xiàn)出一定潛力，例如5.8S+ITS2區(qū)域能明確地區(qū)分小球藻屬Chlorella的已知種并藉此發(fā)現(xiàn)新種［54］，并成功地鑒定了日本沿海本土和引入的典型綠藻物種［55］。剛毛藻科作為綠藻中的特殊群體，除ITS有一定（較低）的成功率外，其他基因都無(wú)法區(qū)分其不同物種［52］，最近研究也發(fā)現(xiàn)ITS和18S r DNA序列種間差異明顯大于種內(nèi)差異，似乎可以用于作為剛毛藻科物種分類的輔助基因［56］。

4.3 硅藻DNA條形碼的研究進(jìn)展

硅藻是海洋浮游植物中生物量最高的類群之一，承載著大約20%的光合固碳量，在海洋和淡水中分布廣泛，然而對(duì)其多樣性和地理分布情況我們還知之甚少，急需利用簡(jiǎn)單快捷的條形碼技術(shù)對(duì)該群體做更深入的研究。

目前尚未找到合適的、統(tǒng)一的硅藻DNA條形碼基因。盡管早先的研究有認(rèn)為COⅠ的種間差異明顯，適合作為部分硅藻如鞍型藻屬Sellaphora的條形碼標(biāo)簽［57］。但越來(lái)越多的研究表明rbcL、28S和ITS基因更具作為硅藻條形碼基因的潛力［58］，而COⅠ盡管種間差異明顯，但在某些群體中很難獲取和測(cè)序［59］。目前研究認(rèn)為rbcL-3′端（3P）擴(kuò)增測(cè)序效率極高，出現(xiàn)內(nèi)含子的概率較小，適合作為硅藻的首選條形碼［60］，而對(duì)于雙基因（double-gene）條形碼技術(shù)所需要的次選條形碼，較合適的兩個(gè)基因包括ITS區(qū)和28S區(qū)。例如，MacGillivary和Kaczmarska在對(duì)比ITS、18S和rbcL-3P后建議將rbcL-3P與變異率較高的5.8S+ITS2區(qū)域搭配使用［61］；Momiz等發(fā)現(xiàn)ITS區(qū)域能快速準(zhǔn)確地區(qū)分硅藻綱Mediophyceae與Bacillariophyceae等類群的不同種類［61-62］。而Hamsher等在Sellaphora群體中嘗試不同基因后認(rèn)為28S更適合作為次選條形碼基因［63］，且在中心藻綱［64］和骨條藻屬［65］的研究也發(fā)現(xiàn)28S似乎效果最佳。另外，Zimmermann等對(duì)18S的V4區(qū)（約400 bp）進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)此區(qū)域能有效區(qū)分不同種，包括區(qū)分鞍形藻屬Sellaphora中的混合種，反映了高通量測(cè)序中利用18S的V4區(qū)研究硅藻生物多樣性的可靠性［66］。

4.4 甲藻DNA條形碼的研究進(jìn)展

甲藻具有真核生物中最大的核基因組，而因?yàn)榇蟛糠值幕蛩睫D(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)的緣故其線粒體與葉綠素體中卻包含了最少的基因。核基因中存在大量的復(fù)制現(xiàn)象，而不同拷貝之間由于長(zhǎng)期進(jìn)化與復(fù)制的原因一般具有微小的差異［67—69］，由此產(chǎn)生的基因組內(nèi)多態(tài)可能影響條形碼技術(shù)在此類群中的應(yīng)用。針對(duì)甲藻的條形碼研究，起步較晚且相對(duì)復(fù)雜，我們不但要篩選合適的條形碼基因，還要避免某些條形碼基因多態(tài)性對(duì)測(cè)序分析、引物設(shè)計(jì)及多樣性評(píng)估所帶來(lái)的干擾。

目前已被嘗試過(guò)的條形碼基因包括ITS、28S（D1 -D3）、COⅠ和COB等，其中ITS和28S似乎更適合作為此類群的條形碼基因，例如Stern等利用ITS對(duì)甲藻中的78個(gè)物種進(jìn)行了研究，認(rèn)為它可以有效地區(qū)分甲藻中的絕大多數(shù)物種，但研究中普遍存在的基因組內(nèi)多態(tài)會(huì)影響這一標(biāo)記基因在現(xiàn)場(chǎng)樣品中的應(yīng)用，需要同其他條形碼基因輔助使用［36］。此前Litaker等利用ITS區(qū)分析了甲藻14屬不同物種的種內(nèi)種間遺傳距離，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩條ITS序列的遺傳距離（p-value）大于等于一個(gè)臨界值時(shí)（p≥0.04）即可認(rèn)為是不同的種，證明了ITS作為甲藻條形碼基因的巨大潛力［34］。Gu等則利用28S結(jié)合形態(tài)學(xué)特征在中國(guó)沿海發(fā)現(xiàn)并定義了新種Takayama xiamenensissp. nov.［70］，同時(shí)利用28S和ITS成功地分析了黃海海域Gymnodinium中3個(gè)種的進(jìn)化關(guān)系［71］。

近年對(duì)COⅠ和COB的分析結(jié)果也證明了核基因ITS作為條形碼基因的優(yōu)越性。Lin等研究認(rèn)為線粒體COB比COⅠ更適用些，其應(yīng)用發(fā)現(xiàn)美國(guó)長(zhǎng)島灣的甲藻具有很高的多樣性，甚至包括以前只在極地發(fā)現(xiàn)的極冰甲藻Polarella glacialis類群，但COB的種類分辨率尚不理想，且存在引物通用性不強(qiáng)、數(shù)據(jù)庫(kù)序列稀缺等問(wèn)題［35］。Stern等利用COⅠ鑒定了甲藻15個(gè)屬中的不同物種，但仍無(wú)法解決一些分類中常見(jiàn)的問(wèn)題屬，如Alexandrium，Symbiodinium和Protoceratium等［71］。Raho等嘗試?yán)肅OⅠ和COB作為區(qū)分鰭藻屬（Dinophysis）的條形碼基因，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于分辨力較差的核基因和COB而言，COⅠ表現(xiàn)出了更強(qiáng)的種間差異性，但也無(wú)法有效區(qū)分鰭藻屬中的所有物種［72］。

利用不同基因嘗試解決形態(tài)上較難區(qū)分的種屬，近年來(lái)在一些重要甲藻類群中取得了一定成效，例如利用28S、18S和ITS將包含有3個(gè)形態(tài)種的亞歷山大藻塔瑪復(fù)合群（Atama species complex）重新劃分成了遺傳差異顯著的5個(gè)新種［2，73—74］，并提出ITS相對(duì)于18S和28S能更明確地區(qū)分此類群，且普遍存在的多態(tài)型并不會(huì)影響不同種類的準(zhǔn)確鑒定［2］。在珊瑚白化過(guò)程中生態(tài)意義巨大的蟲(chóng)黃藻Symbiodinium也是甲藻分類中典型的問(wèn)題屬，Pochon等發(fā)現(xiàn)除ITS區(qū)外還有3個(gè)基因（COⅠ，rad24，actin）也適合作為蟲(chóng)黃藻屬的輔助條形碼基因［75］；LaJeunesse等也利用ITS、COB、23S r RNA和單拷貝微衛(wèi)星Sym15基因結(jié)合形態(tài)生理學(xué)等數(shù)據(jù)定名了Symbiodinium minutumsp.nov.及S.psygmophilumsp.nov.兩個(gè)新種［76］。

4.5 藻類DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用的初步框架與展望

目前對(duì)于除上述之外的其他門類的微藻研究尚少，但也有一定進(jìn)展［77］。Saunders和McDevit提出了針對(duì)于海洋大型藻類和硅藻的不同條形碼基因和標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并建議用雙條形碼方法對(duì)藻類進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，即在28S D2／D3作為通用輔助條形碼的前提下，COⅠ-5P作為紅藻與褐藻基本條形碼，rbcL-3P和tufA分別作為硅藻和綠藻的基本條形碼［33］。另外，根據(jù)已有研究［2，35，72］和未發(fā)表數(shù)據(jù)我們建議用ITS作為甲藻的首選條形碼，Saunders等建議的藻類通用輔助條形碼28S D2／D3也適用于此群體。

雖然現(xiàn)在涉及藻類的DNA條形碼的研究組織還較少，且初步的應(yīng)用框架并不適用于所有藻類，但相信隨著物種的發(fā)現(xiàn)和條形碼研究的深入，會(huì)有越來(lái)越多的藻類的DNA條形碼信息被錄入數(shù)據(jù)庫(kù)供研究者參考使用，針對(duì)藻類的標(biāo)準(zhǔn)操作流程和應(yīng)用體系也會(huì)被逐步完善。藻類DNA條形碼的研究也將會(huì)成為藻類物種分類鑒定和系統(tǒng)分化研究中的一種發(fā)展趨勢(shì)，為藻類的分類鑒定和新物種的發(fā)現(xiàn)、生物多樣性的評(píng)價(jià)等研究提供準(zhǔn)確、快速的信息，還可以用于對(duì)外來(lái)入侵物種的評(píng)估及外來(lái)物種的識(shí)別等研究［78—80］。

5 海洋無(wú)脊椎動(dòng)物類群的條形碼研究進(jìn)展

5.1 海綿動(dòng)物DNA條形碼研究進(jìn)展

海綿動(dòng)物被認(rèn)為是最原始的后生動(dòng)物類群，在海洋生態(tài)系統(tǒng)和生物化工制藥中具有重要地位［81］。目前已被描述的物種有8 000多個(gè)，而初步預(yù)測(cè)全世界至少有15 000個(gè)種［82］。由于形態(tài)結(jié)構(gòu)（如骨骼、骨針的排列方式）的高度相似性，分類學(xué)家很難進(jìn)行物種鑒定，因此它也是唯一建立全球性條形碼計(jì)劃（Sponge Barcoding Project，http：／／www.spongebarcoding.org）的無(wú)脊椎動(dòng)物類群。然而已有的研究顯示，在較高等的后生動(dòng)物類群中普遍適用的COⅠ-5P區(qū)在海綿動(dòng)物中保守性較高，很難區(qū)分同一屬內(nèi)的不同種，并不適合作為此類群的條形碼標(biāo)記，相反COⅠ下游的I3-M11區(qū)［83］和ITS區(qū)［84—85］被證明更適合作為海綿動(dòng)物的條形碼片段。

5.2 刺胞動(dòng)物DNA條形碼研究進(jìn)展

刺胞動(dòng)物門包括珊瑚綱、水螅綱、缽水母綱、十字水母綱和立方水母綱五大類群。由于珊瑚綱生物（?？⑸汉骱秃ｖw等）的線粒體DNA進(jìn)化速率較低，COⅠ被證明不適合作為物種鑒定的分子標(biāo)記，使得目前刺胞動(dòng)物門DNA條形碼標(biāo)記尚未統(tǒng)一［5，86］。Moura等應(yīng)用16S片段分析了北大西洋6科68種水螅，證實(shí)了其在水螅物種鑒定中的適用性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)16S片段在種以下分類階元及屬、科水平上均具有較好的分辨力［87］。然而最近也有研究結(jié)果顯示，利用COⅠ可以成功地對(duì)浮游水螅類進(jìn)行分類［88］。另外，以COI［89-91］和16S［92］為標(biāo)準(zhǔn)基因進(jìn)行水母類的DNA條形碼研究已獲得廣泛應(yīng)用，并被認(rèn)可為此類群的標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因。

5.3 甲殼動(dòng)物DNA條形碼的研究進(jìn)展

甲殼動(dòng)物是海洋浮游動(dòng)物中最為豐富的類群，其條形碼研究相對(duì)完善，COⅠ片段被認(rèn)為可作為理想的標(biāo)準(zhǔn)基因。Radulovici等擴(kuò)增了加拿大灣端足、十足、磷蝦、等足和糠蝦等5目39科60屬87種507個(gè)個(gè)體的COⅠ序列，發(fā)現(xiàn)95%的序列可對(duì)應(yīng)到已鑒定種類，種間遺傳距離超過(guò)種內(nèi)遺傳距離的25倍，另有4個(gè)種類其種內(nèi)遺傳距離較高（3.78%～13.6%），顯示出隱種存在的可能［93］。在小型甲殼動(dòng)物橈足類中，COⅠ也被證實(shí)適合作為此類群的標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因［88，94—96］，但也有研究在比較了COⅠ和12S srRNA后推測(cè)12S可能更適合作為隆劍水蚤科Oncaeidae的條形碼基因［97］。

磷蝦目約包含90多個(gè)種，分隸于2科11屬，均為海洋浮游種類，其鑒定所依據(jù)的形態(tài)特征比較細(xì)微，尤其是幼蟲(chóng)和幼體的鑒定給多樣性的準(zhǔn)確評(píng)估帶來(lái)困難。COⅠ在此類群的種間差異明顯，通過(guò)遺傳距離的統(tǒng)計(jì)可以有效地研究近緣種的系統(tǒng)關(guān)系，地理遺傳差異及隱存種的預(yù)測(cè)［95，98］。

5.4 軟體動(dòng)物DNA條形碼的研究進(jìn)展

軟體動(dòng)物種類較多，現(xiàn)存約8萬(wàn)多種，為動(dòng)物界第二大門類，DNA條形碼技術(shù)目前已經(jīng)在腹足綱［99—102］、雙殼綱［103—105］、頭足綱［106—108］等的分類中得

到廣泛應(yīng)用，但在單板綱、多板綱、無(wú)板綱及掘足綱等中研究較少。目前在軟體動(dòng)物研究中廣泛使用的DNA條形碼是COⅠ基因，但線粒體基因自身還存在單親遺傳、異質(zhì)性、基因滲入等問(wèn)題，還需要結(jié)合16S和ITS等作為輔助基因。因此，DNA條形碼在此類群的進(jìn)一步研究還需要和形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)等其他特征結(jié)合使用［109—110］。Liu等利用COⅠ和ITS基因?qū)χ袊?guó)沿海的16個(gè)及日本沿海的一個(gè)櫛江珧群體進(jìn)行分析，探討隱存種的存在以及個(gè)體之間是否發(fā)生雜交，通過(guò)COⅠ系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)了6個(gè)明顯分化的支系，而通過(guò)ITS系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)了5個(gè)明顯分化的支系，此外還在同一個(gè)體中發(fā)現(xiàn)多種ITS序列，表明支系間曾發(fā)生過(guò)雜交，此結(jié)果也顯示了DNA條形碼在歷史演化研究中的重要作用［111］。此外借助DNA條形碼還可以發(fā)現(xiàn)一些具有表型差異，但不具有遺傳差異的現(xiàn)象。如Nakano發(fā)現(xiàn)在原有分類方式中命名為N.helmsi（E.A.Smith，1894）及N.virescens（Oliver，1926）的兩個(gè)種均屬于N.elongata（Quoy&Gaimard，1834）［101］；Teske等研究發(fā)現(xiàn)非洲東南部潮間帶4種同時(shí)分布的帽貝Siphonariidae為不同表型的同一種帽貝［112］。

5.5 原生動(dòng)物DNA條形碼的研究進(jìn)展

原生動(dòng)物雖然結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，比較原始，但種類多、數(shù)量大、分布廣，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有相當(dāng)重要的位置。當(dāng)前原生動(dòng)物的分類學(xué)研究多集中于應(yīng)用18S和28S rDNA等片段分析其系統(tǒng)關(guān)系［113—116］。

目前的DNA條形碼研究還僅限于某些類群，例如，COI能準(zhǔn)確區(qū)分纖毛蟲(chóng)屬Tetrahymena中的不同群體，適合作為纖毛蟲(chóng)類標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因［117］。Santoferrara等則比較了18S、28S及18S高變異區(qū)（V4和V9）等4個(gè)片段，結(jié)果顯示28S有效鑒定出了86%的形態(tài)類型，可作為沙殼纖毛蟲(chóng)目Tintinnida的有效條形碼標(biāo)記［118］。結(jié)合形態(tài)特征和基于18S等基因的系統(tǒng)學(xué)分析，已鑒定出了多個(gè)新屬和新種［119—120］，同時(shí)ITS1-5.8S-ITS2片段也成功地用于分析盾纖蟲(chóng)屬Aspidisca的系統(tǒng)關(guān)系［121］。

5.6 櫛水母DNA條形碼的研究進(jìn)展

櫛水母動(dòng)物分布廣，較為常見(jiàn)，目前已發(fā)現(xiàn)160余種，其中瓣水母作為入侵種，在地中海海域曾大規(guī)模聚集，在海洋浮游動(dòng)物中也占有相當(dāng)重要的位置。然而，由于遺傳差異較大，該類群尚未有DNA條形碼的相關(guān)研究。Ortman分析了20種櫛水母的COⅠ、ITS1和28S序列，發(fā)現(xiàn)COⅠ、28S片段進(jìn)化速率較低，而ITS1也缺乏足夠的種間遺傳距離。因此，該類群的條形碼研究工作有待尋找更為適合的條形碼DNA片段［122］。

5.7 毛顎動(dòng)物DNA條形碼的研究進(jìn)展

毛顎動(dòng)物是海洋動(dòng)物中結(jié)構(gòu)特殊、分類位置尚待確定的一個(gè)類群，共鑒定超過(guò)100種，其COⅡ和COⅠ片段均被證明可作為條形碼研究的標(biāo)準(zhǔn)片段，但后者更被廣泛采納。Peijnenburg等利用COⅡ序列將來(lái)自大西洋、地中海和黑海的86個(gè)毛箭蟲(chóng)Sagitta setosa個(gè)體歸類成4個(gè)種群，并推測(cè)可能存在1個(gè)隱種［123］。另外，COⅠ也被成功的用于毛顎動(dòng)物的種類鑒定、隱種的發(fā)現(xiàn)、種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性等方面的分析［124—126］。

5.8 其他類群無(wú)脊椎動(dòng)物DNA條形碼的研究進(jìn)展

輪蟲(chóng)的種類鑒定常依賴于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下的顯微觀察，而對(duì)其表型與生殖隔離、環(huán)境變化的關(guān)系尚不得而知，因此，利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)該類群的隱存種及種群分布進(jìn)行研究具有重大意義。Birky以COⅠ片段分析了多個(gè)輪蟲(chóng)類群，指出該片段在輪蟲(chóng)中有著理想的進(jìn)化速率，可作為該類群條形碼的標(biāo)準(zhǔn)基因［127］。

多毛類大多營(yíng)底棲生活，其幼體須經(jīng)過(guò)浮游階段，主要分布于沿岸低鹽水域，也有少數(shù)類群終生浮游。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)去認(rèn)為的許多廣布種類實(shí)際上可分為諸多近緣種，Carr等應(yīng)用COⅠ分析了加拿大周邊太平洋、大西洋和北冰洋三大海域的多毛類多樣性，發(fā)現(xiàn)屬間類群的遺傳距離超過(guò)屬內(nèi)的40倍，指出該片段是有效的物種鑒定工具，有助于物種的準(zhǔn)確識(shí)別［128］。

作為階段性浮游生物，浮游幼蟲(chóng)有著較強(qiáng)的擴(kuò)散能力，是一種重要的資源補(bǔ)充途徑。對(duì)于缺乏必要形態(tài)分類信息的浮游幼蟲(chóng)，DNA條形碼的應(yīng)用使得該類群生物的物種多樣性評(píng)估水平顯著提高。由于海洋浮游幼蟲(chóng)涵蓋了多毛類、甲殼動(dòng)物、棘皮動(dòng)物、軟體動(dòng)物和紐形動(dòng)物等諸多類群，一般使用兩個(gè)或兩個(gè)以上條形碼基因能更準(zhǔn)確進(jìn)行物種鑒定。例如，結(jié)合COⅠ和16S片段成功鑒定出了新西蘭海域24種浮游幼蟲(chóng)［129］和香港海域的網(wǎng)采浮游蝦蛄幼體［130］；Heimeier等結(jié)合16S和18S序列共鑒定出53個(gè)分子操作分類單元（molecular operation taxonomic Unit，MOTU，即最低可能分類學(xué)單元），極大地提高了浮游動(dòng)物幼蟲(chóng)的鑒定水平［131］；Webb等比較了COⅠ、16S和18S后發(fā)現(xiàn)COⅠ的擴(kuò)增成功率最高，比較適合作為首選片段，以促進(jìn)浮游幼蟲(chóng)多樣性的評(píng)估［132］。

另外，隨著全球貿(mào)易的進(jìn)一步發(fā)展，壓艙水?dāng)y帶入侵生物排放的問(wèn)題日益加劇。對(duì)許多海洋生物類群，休眠卵的存在使其得以渡過(guò)不良環(huán)境，保持種群生存，同時(shí)也賦予它們跟隨壓艙水?dāng)U散至陌生水域的能力。Briski等應(yīng)用16S和COⅠ片段分析了五大湖區(qū)壓艙水帶入的休眠卵，其中約64%的個(gè)體鑒定到種，其余36%的個(gè)體到屬或者科級(jí)別，證實(shí)了使用DNA條形碼可以快速檢測(cè)出壓艙水中入侵浮游動(dòng)物的休眠卵［133］。

5.9 海洋無(wú)脊椎動(dòng)物DNA條形碼研究存在的不足

總的來(lái)說(shuō)，海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的DNA條形碼研究工作已經(jīng)在物種鑒定、隱種和亞種甄別、種群系統(tǒng)地理學(xué)等方向逐步展開(kāi)。但是，值得注意的是，當(dāng)前海洋無(wú)脊椎動(dòng)物各主要類群的條形碼研究進(jìn)展極不平衡，在研究較為熱門的類群，比如甲殼動(dòng)物、軟體動(dòng)物和毛顎動(dòng)物，其標(biāo)準(zhǔn)基因基本確定，相應(yīng)的應(yīng)用工作也廣泛展開(kāi)；在原生動(dòng)物中，基于18S和28S基因的系統(tǒng)學(xué)分析和新種鑒定已獲得廣泛共識(shí)，其相關(guān)的條形碼工作已具備堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；而在海綿、珊瑚、櫛水母、浮游幼蟲(chóng)等類群，由于形態(tài)鑒定難度大和線粒體基因進(jìn)化速率的異常，使得研究者們一直在努力尋求更適合的條形碼基因。另外，作為脊索動(dòng)物的某些類群（文昌魚(yú)綱、海樽綱等）序列信息的過(guò)于稀少，也嚴(yán)重影響了此類群條形碼研究進(jìn)程［6］。

6 海洋魚(yú)類DNA條形碼研究進(jìn)展

魚(yú)類是脊椎動(dòng)物中最具多樣性的類群，幾乎占了脊椎動(dòng)物總數(shù)的一半。截至2013年10月，F(xiàn)ishBase記錄的魚(yú)類多達(dá)32 700種（http：／／www.fishbase. org／）。由于魚(yú)類早期發(fā)育過(guò)程復(fù)雜多樣且“同種異形”和“異種同形”現(xiàn)象普遍存在，加大了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類鑒定的難度，另有許多魚(yú)類的早期發(fā)育過(guò)程非常類似，其卵子、幼體形態(tài)特征種間差異不顯著，從而導(dǎo)致了魚(yú)卵仔稚魚(yú)分類鑒定難度較大，DNA條形碼的研究則為解決這些難題提供了重要保障。近年來(lái)人們甚至嘗試用水體中的DNA（掉入水體中的體表細(xì)胞或分泌物）來(lái)檢測(cè)魚(yú)類的種群分布和活動(dòng)范圍［134］，使條形碼技術(shù)成為魚(yú)類遷徙、洄游等相關(guān)研究的便利工具。

6.1 國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)收錄魚(yú)類DNA條形碼進(jìn)展

在短短10年時(shí)間內(nèi)，魚(yú)類DNA條形碼研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展和巨大成就。截至2013年10月，BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了近17.75萬(wàn)條輻鰭魚(yú)綱（Actinopterygii）魚(yú)類的DNA條形碼序列信息，隸屬于46個(gè)目1.48萬(wàn)種（見(jiàn)表1）。其中DNA條形碼序列數(shù)最多的類群為魚(yú)類中最大目——鱸形目（Perciformes），占輻鰭魚(yú)綱魚(yú)類DNA條形碼總數(shù)的44%。位居第二和第三的分別是鯉形目與鲇形目，分別占輻鰭魚(yú)綱魚(yú)類DNA條形碼總數(shù)的10%和6%。BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中的魚(yú)類DNA條形碼采自全球95個(gè)國(guó)家和地區(qū)，其中貢獻(xiàn)最大的國(guó)家是美國(guó)，提交了1.3萬(wàn)余條序列；而中國(guó)提交的魚(yú)類DNA條形碼序列數(shù)僅為1 354條，居第16位（表2）。

表1 2013年10月為止BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的46個(gè)目魚(yú)類DNA條形碼序列數(shù)量Tab.1 DNA barcoding sequences of 46 orders of fish in the BOLD database as of October 2013

表2 2013年10月止為BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)提交魚(yú)類DNA條形碼序列排名前20位的國(guó)家和地區(qū)Tab.2 The top 20 countries and regians that provided most DNA barcoding sequences of fish in the BOLD database as of October 2013

由BOLD發(fā)起的魚(yú)類DNA條形碼計(jì)劃（Fish Barcode of Life，F(xiàn)ISH-BOL），目標(biāo)是獲取全球3萬(wàn)多種魚(yú)類的DNA條形碼信息并建立魚(yú)類DNA條形碼信息網(wǎng)（http：／／www.fishbol.org／）。當(dāng)前FISHBOL已收錄了9萬(wàn)多條魚(yú)類DNA條形碼，隸屬于6個(gè)亞綱的1萬(wàn)種魚(yú)類（表3），完成了三分之一的工作目標(biāo)。BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)與FISH-BOL數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的魚(yú)類DNA條形碼信息將極大地方便科學(xué)家系統(tǒng)而準(zhǔn)確地掌握魚(yú)類在分類地位、遺傳結(jié)構(gòu)、分布地區(qū)和進(jìn)化歷史等方面的信息，為開(kāi)展魚(yú)類種質(zhì)資源研究和生物多樣性保護(hù)工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

表3 2013年10月止FISH-BOL數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的魚(yú)類DNA條形碼序列數(shù)量Tab.3 The number of DNA barcoding sequences of fish documented in the FISJH-BOL database as of October 2013

6.2 魚(yú)類DNA條形碼的應(yīng)用

COⅠ基因是魚(yú)類DNA條形碼研究最常用的標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于物種鑒別和多樣性分析。目前BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的魚(yú)類DNA條形碼信息基本上都來(lái)自于此基因。Ward等利用COⅠ基因成功區(qū)分了澳大利亞、北大西洋陸架等地區(qū)的不同種類［20，135］，并通過(guò)重建系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)一步驗(yàn)證了COⅠ基因序列作為海洋魚(yú)類DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列的可行性。在我國(guó)，COⅠ在南海硬骨魚(yú)類、鲌屬魚(yú)類、石首魚(yú)科Sciaenidae、鰈形目Pleuronectiformes等類群的分類鑒定中也取得了較好的成效［136—138］。另外，COⅠ序列作為條形碼還被廣泛用于鑒別市場(chǎng)上出售的食用魚(yú)片的真?zhèn)危?39］。

為了估測(cè)魚(yú)類群落的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)以及每種魚(yú)類在群落中的營(yíng)養(yǎng)水平，進(jìn)一步研究生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈和食物網(wǎng)上的物質(zhì)循環(huán)和能流格局，現(xiàn)代魚(yú)類生態(tài)學(xué)中采用胃含物分析法開(kāi)展魚(yú)類的食性研究。近年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)已在胃含物分析研究中發(fā)揮了一定的作用。Dunn等利用該技術(shù)分析6個(gè)物種的深海鯊魚(yú)的胃含物組成，能夠區(qū)分上述種類在捕食對(duì)象上存在的顯著差異［140］。DNA條形碼技術(shù)能夠更快速準(zhǔn)確的鑒定海洋生物幼體物種。分布于北極和亞北極的鮭科魚(yú)類，尤其是其仔稚魚(yú)，難以依據(jù)形態(tài)學(xué)特征加以區(qū)分辨別，但Schlei等對(duì)其3個(gè)屬的49個(gè)體進(jìn)行了COⅠ基因序列分析，發(fā)現(xiàn)其中48個(gè)體都能夠被正確鑒定［141］。Webb等的研究結(jié)果證明DNA條形碼技術(shù)可以用于鑒定南極洲物種的幼體，但是其分辨力受到DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中可用于序列比對(duì)的成體序列數(shù)量的局限，因此建立一個(gè)海洋生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)十分必要［132］。

然而，目前部分研究表明COⅠ基因并非適用于所有的魚(yú)類種類鑒別，Kruck等發(fā)現(xiàn)僅憑外部形態(tài)特征和COⅠ基因很難鑒別鱚屬的兩個(gè)近緣種S.analis和S.ciliata，只有利用多基因條形碼（multi-gene barcoding）技術(shù)，集合線粒體ND2、ATP酶及核基因RAG2序列，才能對(duì)S.analis和S.ciliata進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，并發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的樣品中存在著雜交個(gè)體［23］。Page等評(píng)估了COⅠ、COB、ATPase及控制區(qū)等4個(gè)線粒體基因片段作為條形碼基因在檢測(cè)澳大利亞昆斯蘭東南區(qū)域淡水魚(yú)類種類鑒別的適用性，發(fā)現(xiàn)前3個(gè)基因都能準(zhǔn)確鑒別各科屬魚(yú)類，在進(jìn)化速率上ATPase稍快于COⅠ和COB，而控制區(qū)則不適合進(jìn)行種間鑒別［142］。此外，某些特定類群的魚(yú)類容易發(fā)生種間雜交現(xiàn)象，而僅憑線粒體DNA很難對(duì)雜交個(gè)體進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，如石斑魚(yú)科魚(yú)類，已被廣泛證實(shí)易于發(fā)生種間雜交，而利用多基因條形碼技術(shù)，使用核基因RYR3結(jié)合線粒體基因序列，則可以鑒別出雜交個(gè)體及其雙親種類（未發(fā)表資料）。因此我們認(rèn)為，對(duì)魚(yú)類某些類群來(lái)說(shuō)，采用多基因條形碼技術(shù)可能是一個(gè)更合理的方案。

7 研究總結(jié)與展望

目前我國(guó)已發(fā)現(xiàn)的海洋生物約占全球已知海洋生物物種的10%［4］，還有眾多物種未被發(fā)現(xiàn)或還屬于隱存種。DNA條形碼技術(shù)使物種鑒定過(guò)程能夠?qū)崿F(xiàn)信息化和標(biāo)準(zhǔn)化，在較短時(shí)間內(nèi)建立易于利用的分類系統(tǒng)有助于我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)這些新物種及隱存種，讓人們對(duì)海洋生物多樣性有全新的認(rèn)識(shí)，并顯著地提升人類監(jiān)測(cè)、理解、保護(hù)以及利用海洋生物資源的能力。

從DNA條型碼概念提出迄今已超過(guò)10年，其在海洋生物中的應(yīng)用得到較快發(fā)展。雖然COI在動(dòng)物界應(yīng)用較廣，但并不適用所有生物。已被嘗試的基因較多，因生物類別而異；除COI及其他線粒體DNA片段（如16S），主要有28SD2／D3、ITS、rbcL、tufA、UPA等（表4）。已有的研究表明，海洋生物的許多大類群很難尋求到像動(dòng)物界一樣較為統(tǒng)一的條形碼基因，我們需要根據(jù)不同的海洋生物類群，去確立具有針對(duì)性的，適合于該類群的，且通過(guò)長(zhǎng)期研究驗(yàn)證并被國(guó)際所認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因。某些復(fù)雜的類群如藻類，還要篩選出較為通用且合適的輔助條形碼片段（如28S的D1-D3區(qū)）。針對(duì)不同類群確立2～3個(gè)有效的條型碼基因可能是確保條型碼技術(shù)分類、鑒定準(zhǔn)確性的必要手段。另外，使用不同條形碼基因?qū)ν活惾哼M(jìn)行鑒定時(shí)可能會(huì)得到不同的結(jié)果，其原因可能是該類群復(fù)雜的生殖方式（如線粒體的母性或父性遺傳），基因內(nèi)部的插入缺失變異或某些基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中信息量的不足等，這就需要我們一方面選擇更多的不同遺傳水平的條形碼基因進(jìn)行更大規(guī)模的分析，一方面對(duì)形態(tài)特征進(jìn)行更加細(xì)微的觀察，從而對(duì)問(wèn)題類群進(jìn)行全面整體的評(píng)測(cè)。

隨著生物多樣性保護(hù)、藥物開(kāi)發(fā)、食品安全及資源調(diào)查等方面的社會(huì)需求日益增長(zhǎng)，選擇DNA條形碼還必須有一定的針對(duì)性和兼顧性，在節(jié)約高效的前提下考慮到不同領(lǐng)域的特殊需求，努力使DNA條形碼的選擇滿足于不同的科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用。因此充分利用物種的遺傳（大部分物種沒(méi)有基因組）信息，在動(dòng)物、植物和微生物中篩選適宜的DNA條形碼基因，仍然是今后一段時(shí)間內(nèi)國(guó)際DNA條形碼研究的主要任務(wù)。當(dāng)然，DNA條形碼技術(shù)是傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)的有力而且必要的補(bǔ)充，物種標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼的確定必須以形態(tài)分類學(xué)研究為佐證；DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)不僅僅收錄物種的DNA條形碼，還包括物種形態(tài)分類學(xué)的信息，每一個(gè)物種的鑒定須依靠分子證據(jù)和形態(tài)分類學(xué)結(jié)果的相互參照及驗(yàn)證。傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)和現(xiàn)代分子分類學(xué)的有機(jī)結(jié)合是DNA條形碼研究的發(fā)展的正確方向。

DNA條形碼技術(shù)不僅有助于對(duì)物種多樣性的認(rèn)識(shí)，還對(duì)物種間群落關(guān)系多樣性（如食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性）的研究提供了有力工具。近年來(lái)利用分子標(biāo)記分析甲殼動(dòng)物等的食性及食物組成的研究正在興起［143—146］，相信隨著DNA條型碼技術(shù)的不斷成熟完善，我們對(duì)海洋食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)多元性的認(rèn)識(shí)將顯著提高。

當(dāng)然，任何技術(shù)都有其相應(yīng)的局限性和缺點(diǎn)，此技術(shù)在應(yīng)用于某些特殊群體（雜交種，近期分化種，混合種，進(jìn)化速率較低的物種）時(shí)還存在諸多問(wèn)題，另外，假基因的存在［147］、基因差異性拷貝造成的多態(tài)、通用引物的難以獲取［36］、基因的滲入現(xiàn)象［148］、易于污染的操作流程、遺傳差異計(jì)算的不統(tǒng)一性等，都阻礙了DNA條形碼技術(shù)快速的前進(jìn)步伐。我們還需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究與實(shí)踐，具有針對(duì)性的解決這些問(wèn)題，為條形碼技術(shù)的穩(wěn)步發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

表4 在主要海洋生物類別嘗試過(guò)的條形碼基因Tab.4 The genes that have been attempted as barcodes in major groups of marine organisms

續(xù)表4

致謝：本文在廈門大學(xué)籌建海洋生物多樣性與全球變化研究中心過(guò)程中，以及在中心召開(kāi)的“鄭重生物多樣性論壇”2013年（首屆）學(xué)術(shù)研討會(huì)蘊(yùn)釀而成期間得到許多同行特別是國(guó)家海洋局第三海洋研究所的林茂研究員，廈門大學(xué)的李少菁、許振祖、黃加祺教授，劉敏、王德祥、李凌等副教授及孟珊珊的大力支持，特此感謝。

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Current status and future prospect of DNA barcoding in marine biology

Lin Senjie1，Wang Lu1，Zheng Lianming1，Dong Yunwei1，Liu Shufang2，Ding Shaoxiong1，
Ye Naihao2，Cao Wenqing1，Zhuang Zhimeng2
（1.Marine Biodiversity and Global Change Research Center，Xiamen University，Xiamen 361005，China；2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China）

Marine organisms are highly diverse，widely distributed，with high complexity and homoplasy.To enable fast and accurate identification of species，it is imperative to establish molecular techniques，to complement the traditional morphological metbodology.DNA barcoding provides digitalized criteria and effective means for species identification，and is becoming an important technical tool in the research on taxonomy and biodiversity.In this review，we summarize the major recent progress and current trend in DNA barcoding，particularly as it applies to the fields of marine phytoplankton（Rhodophyte，Phaeophyta，Chlorophyta，Bacillariophyta and Dinophyta），invertebrates（Spongia，Cnidaria，Custacea，Mollusca，etc.）and fish.We provide an overview of the deffectiveness and suitability of different barcoding markers in different groups of marine organisms.We also discuss current challenges and future prospects of marine DNA barcoding in hope to provide a framework for future marine DNA barcoding research in China.

DNA barcoding；marine biology；morphological taxonomy；molecular evolution；barcoding marker

S917.4

A

0253-4193（2014）12-0001-17

林森杰，王路，鄭連明，等.海洋生物DNA條形碼研究現(xiàn)狀與展望［J］.海洋學(xué)報(bào)，2014，36（12）：1—17，

10.3969／j.issn.0253-4193.2014.12.001

Lin Senjie，Wang Lu，Zheng Lianming，et al.Current status and future prospect of DNA barcoding in marine biology［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（12）：1—17，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.12.001

2014-06-26；

2014-08-15。

國(guó)家自然科學(xué)基金“通過(guò)生態(tài)基因組學(xué)分析探索東海原甲藻的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制”重點(diǎn)項(xiàng)目（41330959）；國(guó)家海洋可再生能源”海洋微藻生物柴油規(guī)?；苽潢P(guān)鍵技術(shù)與裝置的優(yōu)化、耦聯(lián)及應(yīng)用研究”專項(xiàng)資金項(xiàng)（ME2011SW03）；外高層次人才引進(jìn)計(jì)劃；科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)“我國(guó)重要漁業(yè)生物DNA條形碼信息采集及其數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建”（2013FY110700）。

林森杰（1964—），男，教授，主要從事海洋浮游生物多樣性及生態(tài)基因組學(xué)研究。E-mail：senjie.lin＠xmu.edu.cn