申欣，田美，孟學(xué)平，程漢良，閻斌倫

（1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005；2.中國(guó)科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院，北京 100101）

鰭足類線粒體基因的選擇壓力比較及進(jìn)化關(guān)系探討

申欣1，2，田美1，孟學(xué)平1，程漢良1，閻斌倫1

（1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005；2.中國(guó)科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院，北京 100101）

鰭足類Pinnipeds是海洋哺乳動(dòng)物的重要類群，現(xiàn)存種類包括海象科Odobenidae、海獅科Otariidae和海豹科Phocidae的所有物種。在海豹屬Phoca中，atp8基因的Ka／Ks最高，僅為0.084 7（遠(yuǎn)小于1），因而海豹屬所有線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的選擇壓力均非常高。對(duì)于群海豹屬Pusa，cox1、cox2和nad3基因的Ka／Ks均為0，表明在這3個(gè)基因中，所有的核苷酸的替換均為同義替換，沒有出現(xiàn)氨基酸的改變?？苾?nèi)、屬內(nèi)基因變異位點(diǎn)的分析表明，nad5、nad4和nad2基因可以作為cox1和cob基因輔助的分子標(biāo)記。線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，強(qiáng)烈支持食肉目所有12個(gè)科均為單系群，并且鰭足類（海獅科、海象科和海豹科）為食肉目Carnivora內(nèi)部的一個(gè)單系群（BPM＝100，BPP＝100）。在鰭足類內(nèi)部，海獅科與海象科親緣關(guān)系最近，聚類為海獅總科Otarioidea，然后與海豹科聚類：（海獅科＋海象科）＋海豹科。在海豹科內(nèi)部，線粒體基因組的證據(jù)支持將海豹科劃分為2個(gè)亞科，即僧海豹亞科Monachinae和海豹亞科Phocinae。線粒體基因組的證據(jù)，強(qiáng)烈支持鼬科Mustelidae與浣熊科Procyonidae關(guān)系最近，臭鼬科Mephitidae與熊貓科Ailuridae近緣，同時(shí)，鰭足類與［（鼬科＋浣熊科）＋（臭鼬科＋熊貓科）］為姊妹群，而與熊科Ursidae較遠(yuǎn)。犬科Canidae在犬型亞目Caniformia中分化較早，位于犬型亞目的基部。

海獅科；海豹科；海象科；鰭足類；系統(tǒng)發(fā)育；線粒體基因組

1 引言

鰭足類Pinnipeds是海洋哺乳動(dòng)物的重要類群，現(xiàn)存種類包括海象科Odobenidae、海獅科Otariidae和海豹科Phocidae的所有物種［1—2］。鰭足類身體呈紡錘或流線形，四肢被肥厚的蹼膜連成鰭狀。鰭足類的毛皮和肉都具有很高的價(jià)值，從而遭受了人類幾個(gè)世紀(jì)的狂捕濫殺，導(dǎo)致不少種類自然種群的數(shù)量不斷減少甚至滅絕。以加勒比僧海豹Monachus tropicalis為例，數(shù)量最多時(shí)曾超過25萬只，然而由于人類的大量獵殺和棲息地的破壞，最后一次的野外紀(jì)錄是在1952年，目前已經(jīng)完全滅絕，與此同時(shí)，還有些鰭足類物種處于滅絕的邊緣［3—4］。因此，對(duì)鰭足類自然種群的保護(hù)及其遺傳背景的認(rèn)識(shí)刻不容緩。通常認(rèn)為鰭足類動(dòng)物起源于一類（或多類）陸生食肉目動(dòng)物，在約2 000萬年前逐漸進(jìn)入并適應(yīng)海洋生活，從而開始了由陸地環(huán)境到海洋環(huán)境的進(jìn)化歷程［5］。事實(shí)上，鰭足類本身是否為單一起源（單系群）一直存在激烈爭(zhēng)議，另外，鰭足類現(xiàn)存的3個(gè)科與陸生食肉目現(xiàn)存類群之間的關(guān)系仍然具有諸多分歧［6—7］。后生動(dòng)物的基因組除了核基因組外，還包括線粒體基因組。線粒體基因組具有基因排列緊湊、成本較低及易于完成等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用到后生動(dòng)物分子系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳及生物地理的研究［7—11］。本文全面的分析比較現(xiàn)有的24個(gè)鰭足類物種線粒體基因組，系統(tǒng)分析鰭足類線粒體基因組的選擇壓力和分子標(biāo)記；同時(shí)，結(jié)合陸生食肉目9個(gè)科的線粒體基因組，全面、系統(tǒng)地分析了鰭足目的起源及其內(nèi)部的進(jìn)化關(guān)系。

2 材料和方法

2.1 鰭足類線粒體基因組

目前共有24個(gè)鰭足類線粒體基因組，分別為海象科Odobenidae的唯一現(xiàn)存種：海象Odobenus rosmarus rosmarus，海獅科Otariidae的紐西蘭海狗Arctocephalus forsteri、南非海狗Arctocephalus pusillus、瓜達(dá)盧佩海狗Arctocephalus townsendi、北海狗Callorhinus ursinus、北海獅Eumetopias jubatus、澳洲海獅Neophoca cinerea、新西蘭海獅Phocarctos hoo犽eri、加州海獅Zalophus californianus，以及海豹科Phocidae的冠海豹Cystophora cristata、髯海豹Erignathus barbatus、灰海豹Halichoerus grypus、豹斑海豹Hydrurga leptonyx、威德爾氏海豹Leptonychotes weddellii、食蟹海豹Lobodon carcinophaga、南象海豹Mirounga leonina、夏威夷僧海豹Monachus schauinslandi、環(huán)海豹Phoca fasciata、琴海豹Phoca groenlandica、斑海豹Phoca largha、港海豹Phoca vitulina、里海海豹Pusa caspica、環(huán)斑海豹Pusa hispida和貝加爾海豹Pusa sibirica［12—16］。

2.2 線粒體基因組選擇壓力分析

在檢測(cè)鰭足類線粒體基因組的選擇壓力時(shí)，以海獅科3個(gè)南非海狗屬物種（紐西蘭海狗、南非海狗與瓜達(dá)盧佩海狗）、海豹科4個(gè)海豹屬物種（環(huán)海豹、琴海豹、斑海豹與港海豹）以及3個(gè)群海豹屬物種（里海海豹、環(huán)斑海豹與貝加爾海豹）為數(shù)據(jù)群。然后，分別借助于Clustal X 2.1軟件［17］，對(duì)線粒體13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（atp6、atp8、cox1-3、cob、nad1-4、nad4L、nad5和nad6）進(jìn)行多重序列比對(duì)（默認(rèn)參數(shù)）。同義替換率（Ks）和非同義替換率（Ka）的計(jì)算則是通過DnaSP 5.10.1軟件［18］完成。

2.3 基因差異性分析

以8種海獅科與15種海豹科物種線粒體基因組分別作為數(shù)據(jù)群，統(tǒng)計(jì)了2個(gè)科內(nèi)部的基因變異位點(diǎn)，同時(shí)，以3個(gè)南非海狗屬物種、4個(gè)海豹屬物種和3個(gè)群海豹屬物種分別作為數(shù)據(jù)群，統(tǒng)計(jì)了3個(gè)屬內(nèi)的基因變異位點(diǎn)。借助于Clustal X 2.1軟件［17］對(duì)15個(gè)主編碼基因分別進(jìn)行多重序列比對(duì)。隨后，線粒體單基因的變異位點(diǎn)，則是通過DnaSP 5.10.1軟件［18］來完成。

2.4 進(jìn)化關(guān)系分析

除了24個(gè)鰭足類線粒體基因組外，17個(gè)陸生食肉目的線粒體基因組（小熊貓Ailurus fulgens、川西小熊貓Ailurus fulgens styani、灰狼Canis lupus、豹Cuon alpinus、臭鼬Mephitis mephitis、東部斑臭鼬Spilogale putorius、海獺Enhydra lutris、水獺Lutra lutra、南美浣熊Nasua nasua、北美浣熊Procyon lotor、大熊貓Ailuropoda melanoleuca、北極熊Ursus maritimus、獵豹Acinonyx jubatus、華南虎Panthera tigris amoyensis、紅頰獴Herpestes javanicus、鬣狗Crocuta crocuta和縞鬣狗Hyaena hyaena）也加入到系統(tǒng)發(fā)育分析中。首先提取41個(gè)物種（共代表食肉目12個(gè)科）的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸序列，然后首尾相連，進(jìn)而通過Clustal X 2.1軟件［17］做多重序列比對(duì)。對(duì)于多重序列比對(duì)結(jié)果，借助于j Model Test 2.1.3軟件［19］進(jìn)行替換模型的計(jì)算比較，當(dāng)最適替換模型（GTR＋I(xiàn)＋V）確定后，分別采取最大似然法與貝葉斯法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建，使用的軟件分別為Phy ML 3.0［20］和MrBayes 3.2［21］。在最大似然樹構(gòu)建時(shí)，使用自展值檢驗(yàn)法（Bootstrap＝1 000），來評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹中每個(gè)分支的可靠性。在貝葉斯分析中，運(yùn)算1 000 000代，以保證足夠的時(shí)間達(dá)到收斂。

3 結(jié)果和討論

3.1 鰭足類線粒體基因組的主要特征

海獅科8個(gè)物種線粒體基因組長(zhǎng)度相差較大，介于15 413 bp（紐西蘭海狗）和16 736 bp（澳洲海獅）之間，差距達(dá)到2 323 bp。與此相比，海豹科15個(gè)物種線粒體基因組的長(zhǎng)度較為保守，琴海豹的線粒體基因組最短（16 551 bp），南象海豹的線粒體基因組最長(zhǎng)（16 970 bp）。海象線粒體基因組的長(zhǎng)度與此相當(dāng)（16 565 bp）（表1）。

現(xiàn)有鰭足類線粒體基因組的基因組成和基因排列非常保守，均共享脊椎動(dòng)物典型的基因排列。8種海獅線粒體主編碼鏈的A＋T含量相差較少，介于58.75%（新西蘭海獅）和59.69%（北海狗）之間。與此相比，海豹科線粒體基因組A＋T含量差異較大，貝加爾海豹的A＋T含量最低（58.12%），南象海豹的A＋T含量最高（60.76%）。海象線粒體基因組主編碼鏈的A＋T含量為59.41%（表1）。

表1 鰭足類線粒體基因組的基本特征

3.2 鰭足類線粒體基因的選擇壓力分析

在南非海狗屬中，cox1基因的Ka／Ks最低，為0.007 7，其次為cox2、nad6和nad3基因（分別為0.014 1、0.015 1和0.019 0），說明在南非海狗線粒體基因組中，這些基因的選擇壓力較高；而atp8基因的Ka／Ks最高，為0.181 6，其次為nad2、nad5和nad4基因（分別為0.087 2、0.085 7和0.058 6），從而說明它們的選擇壓力較小。對(duì)于海豹屬，cox1基因的Ka／Ks最低，為0.005 5，其次為nad3、cox2和nad4L基因（分別為0.006 5、0.017 4和0.018 5）；而atp8基因的Ka／Ks最高，僅為0.084 7，因此海豹屬線粒體基因組中，所有蛋白質(zhì)編碼基因的選擇壓力均非常高。在群海豹屬，cox1、cox2和nad3基因的Ka／Ks均為0，說明在這3個(gè)基因中，所有核苷酸的替換均為同義替換，沒有出現(xiàn)氨基酸的改變；而nad4L基因的Ka／Ks最高，為0.2603，其次為atp6、atp8和nad2基因（分別為0.110 9、0.085 9和0.071 6），從而說明這些基因的選擇壓力較?。▓D1）。

圖1 南非海狗屬、海豹屬和群海豹屬線粒體基因選擇壓力分析

3.3 鰭足類線粒體基因的分子標(biāo)記分析

南非海狗屬內(nèi)部線粒體基因的變異位點(diǎn)結(jié)果表明，nad5基因的變異位點(diǎn)數(shù)最多（222個(gè)），其次為nad4、cox1、cob和nad2基因，變異位點(diǎn)的數(shù)目分別為148、147、127和125個(gè)。海豹屬和群海豹屬線粒體變異位點(diǎn)數(shù)的分析結(jié)果與南非海狗屬類似，nad5、nad4、cox1、cob和nad2基因的變異位點(diǎn)數(shù)位于前列。在海獅科線粒體基因組中，nad5基因的變異位點(diǎn)數(shù)最多（524個(gè)），其次為nad4、cox1、cob和nad2基因，變異位點(diǎn)的數(shù)目分別為384、347、274和265個(gè)。在海豹科15個(gè)線粒體基因組單基因的變異位點(diǎn)分析中，nad5基因的變異位點(diǎn)數(shù)最多（635個(gè)），其次為nad4、cox1、cob和nad2基因，變異位點(diǎn)的數(shù)目分別為475、469、360和351個(gè)。綜合屬內(nèi)與科內(nèi)基因變異位點(diǎn)的分析結(jié)果，均支持nad5、nad4和nad2基因作為cox1 和cob基因輔助的分子標(biāo)記，為鰭足類群體遺傳及分子生態(tài)的研究提供有價(jià)值的遺傳信息。

3.4 進(jìn)化關(guān)系分析

與其他食肉目動(dòng)物相比，鰭足類在形態(tài)和生活方式上差異巨大，鰭足類動(dòng)物到底作為一個(gè)目與食肉目并列，還是作為食肉目下的一個(gè)類群，長(zhǎng)期以來一直存在爭(zhēng)議［22—24］。目前數(shù)據(jù)庫中共有24個(gè)鰭足類線粒體基因組全序列；除了鰭足類線粒體基因組外，17個(gè)陸生食肉目的線粒體基因組也包含在系統(tǒng)發(fā)育分析中（共41個(gè)線粒體基因組，代表12個(gè)科），以利于從線粒體基因組層次全面系統(tǒng)的了解食肉目的進(jìn)化歷史。

以線粒體所有蛋白質(zhì)編碼基因?yàn)閿?shù)據(jù)群，采用2種建樹方法（最大似然法和貝葉斯法），所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致。線粒體基因組的數(shù)據(jù)支持鰭足類作為食肉目?jī)?nèi)部的一個(gè)類群（見圖2）。同時(shí)，根據(jù)化石的證據(jù)來看，最早的鰭足類動(dòng)物的化石是中新世時(shí)期，而哺乳綱其他各目最晚出現(xiàn)在始新世，這也支持鰭足類不能單列為一個(gè)目［5］。食肉目下分為2個(gè)分支：貓型亞目和犬型亞目（BPM＝100，BPP＝100）。

鰭足類本身是否為單系群，以及鰭足類3個(gè)科之間的關(guān)系存在較多爭(zhēng)議［6—7，25］。線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，強(qiáng)烈支持食肉目所有12個(gè)科均為單系群，并且鰭足類（海獅科、海象科和海豹科）為單系群（BPM＝100，BPP＝100）。在鰭足類內(nèi)部，海獅科與海象科親緣關(guān)系最近，聚類為海獅總科Otarioidea，然后與海豹科聚類：（海獅科＋海象科）＋海豹科（見圖2）。在海豹科內(nèi)部，線粒體基因組的證據(jù)支持將海豹科劃分為2個(gè)亞科，即僧海豹亞科和海豹亞科。僧海豹屬M(fèi)onachus、象海豹屬M(fèi)irounga、食蟹海豹屬Lobodon、豹海豹屬Hydrurga和威德爾海豹屬Leptonychotes聚在一支，組成僧海豹亞科（BPM＝100，BPP＝100）。同時(shí)，髯海豹屬Erignathus、冠海豹屬Cystophora、海豹屬Phoca、灰海豹屬Halichoerus和群體海豹屬Pusa聚在另外一支，組成海豹亞科（BPM ＝100，BPP＝100）。

除了鰭足類是否為單系群的問題外，鰭足類3個(gè)科與陸生食肉目各科之間的親緣關(guān)系一直以來存在激烈爭(zhēng)議［7，25］。線粒體基因組的證據(jù)，強(qiáng)烈支持鼬科與浣熊科關(guān)系最近（BPM＝100，BPP＝100），臭鼬科與熊貓科近緣（BPM＝65，BPP＝100），（鼬科＋浣熊科）與（臭鼬科＋熊貓科）互為姊妹群（BPM＝99，BPP ＝100）。同時(shí)，在陸生食肉目中，鰭足類與［（鼬科＋浣熊科）＋（臭鼬科＋熊貓科）］親緣關(guān)系最近（BPM＝78，BPP＝100），而與熊科較遠(yuǎn)。犬科在犬型亞目中分化較早，位于犬型亞目的基部（見圖2）。

圖2 基于線粒體蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建的進(jìn)化關(guān)系樹

4 結(jié)論

現(xiàn)有鰭足類線粒體基因組的基因組成和基因排列非常保守，均共享脊椎動(dòng)物典型的基因排列。在南非海狗屬中，cox1基因的Ka／Ks最低，其次為cox2、nad6和nad3基因，說明在南非海狗線粒體基因組中，這些基因的選擇壓力較高；而atp8基因的Ka／Ks最高，其次為nad2、nad5和nad4基因，從而說明這些基因存在較小的選擇壓力和功能束縛。對(duì)于海豹屬，cox1基因的Ka／Ks最低，其次為nad3、cox2和nad4L基因；而atp8基因的Ka／Ks最高且遠(yuǎn)小于1，因此海豹屬線粒體基因組中，所有蛋白質(zhì)編碼基因的選擇壓力均非常高。在群海豹屬，cox1、cox2和nad3基因的Ka／Ks均為0，說明在這3個(gè)基因中，所有核苷酸的替換均為同義替換，沒有出現(xiàn)氨基酸的改變。綜合屬內(nèi)與科內(nèi)基因變異位點(diǎn)的分析結(jié)果，均支持nad5、nad4和nad2基因作為cox1和cob基因輔助的分子標(biāo)記。線粒體基因組的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果，強(qiáng)烈支持鰭足類作為食肉目?jī)?nèi)部的一個(gè)類群。同時(shí)，強(qiáng)烈支持食肉目所有12個(gè)科均為單系群，并且鰭足類（海獅科、海象科和海豹科）本身為單系群。在鰭足類內(nèi)部，海獅科與海象科親緣關(guān)系最近，聚類為海獅總科，然后與海豹科聚類：（海獅科＋海象科）＋海豹科。在海豹科內(nèi)部，線粒體基因組的證據(jù)支持將海豹科劃分為2個(gè)亞科，即僧海豹亞科和海豹亞科。線粒體基因組的證據(jù)，強(qiáng)烈支持鼬科與浣熊科關(guān)系最近，臭鼬科與熊貓科近緣，同時(shí)，鰭足類與［（鼬科＋浣熊科）＋（臭鼬科＋熊貓科）］為姊妹群，而與熊科較遠(yuǎn)。

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Selection pressure comparison and evolutionary relationships exploration of pinnipeds mitochondrial genes

Shen Xin1，2，Tian Mei1，Meng Xueping1，Cheng Hanliang1，Yan Binlun1
（1．JiangsuKey Laboratory of Marine Biotechnology，College of Marine Science，HuaihaiInstitute of Technology，Lianyungang 222005，China；2．BeijingInstitutes of Life Science，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China）

Current pinnipeds is one important group of marine mammals，which including all species in three families （Odobenidae，Otariidae and Phocidae）.In the genus Phoca，theKa／Ks rate of atp8 gene is highest and only 0.084 7（much less than 1），so all Phoca mitochondrial protein-coding genes bear very high selection pressure.In Pusa，Ka／Ks rates of three genes（cox1，cox2 and nad3）are equal to 0，indicating that replacement of all nucleotides in these three genes are synonymous substitutions and none amino acid change.Analyses of genetic variations within family and genus indicted that nad5，nad4，and nad2 genes can be used as molecular markers assisted to cox1 and cob gene.Phylogenetic results based on mitochondrial genomes strongly support that all 12 families from Carnivora are monophyletic group，and pinnipeds（Otariidae，Odobenidae and Phocidae）are one monophyletic group within Carnivora（BPM＝100，BPP＝100）.Within the pinnipeds，the relationship between Otariidae and Odobenidae is close（Otarioidea），then cluster with Phocidae：（Otariidae＋Odobenidae）＋Phocidae.Evidences of mitochondrial genomes support that Phocidae are divided into two subfamilies（Monachinae and Phocinae）.Mitochondrial genomic evidence strongly supports close relationship between Mustelidae and Procyonidae.Meanwhile，Mephitidae clustering with Ailuridae is supported powerfully.Pinnipeds as a sister group to［（Mustelidae＋Procyonidae）＋（Mephitidae＋Ailuridae）］，then cluster with the family Ursidae.Canidae is differentiation earliest and is located in base position of the suborder Caniformia.

Otariidae；Phocidae；Odobenidae；Pinnipeds；phylogeny；mitochondrial genome

Q915.874

A

0253-4193（2014）06-0087-07

2013-07-01；

2013-09-02。

國(guó)家自然科學(xué)基金（40906067）；香江學(xué)者計(jì)劃（XJ2012056）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2012M510054，2012T50218）；中央財(cái)政支持地方高校發(fā)展專項(xiàng)資金（CXTD04）；江蘇省“青藍(lán)工程”人才基金資助項(xiàng)目（蘇教師［2010］27號(hào)）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

申欣（1981—），男，山東省成武縣人，副教授，博士，主要從事基因組學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究。E-mail：shenthin＠163.com

申欣，田美，孟學(xué)平，等.鰭足類線粒體基因的選擇壓力比較及進(jìn)化關(guān)系探討［J］.海洋學(xué)報(bào)，2014，36（6）：87—93，

10.3969／j. issn.0253-4193.2014.06.011

Shen Xin，Tian Mei，Meng Xueping，et al.Selection pressure comparison and evolutionary relationships exploration of pinnipeds mitochondrial genes［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（6）：87—93，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.06.011