曹建敏,于衛(wèi)松,黃 建,郭承芳,方 松,夏冰冰,2,姜振玲,2,邱 軍*
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266101;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081;3. 江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,南昌 330096)
烤煙致香物質(zhì) GC/MS 指紋圖譜在產(chǎn)區(qū)識(shí)別中的應(yīng)用
曹建敏1,于衛(wèi)松1,黃 建3,郭承芳1,方 松1,夏冰冰1,2,姜振玲1,2,邱 軍1*
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266101;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081;3. 江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,南昌 330096)
為研究 GC/MS 指紋圖譜在烤煙產(chǎn)區(qū)識(shí)別中的應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)采用同時(shí)蒸餾萃取烤煙中香氣物質(zhì),GC/MS 檢測(cè),構(gòu)建了湖南、廣西、貴州3個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙的致香物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。隨機(jī)選取這3個(gè)產(chǎn)區(qū)及廣東、河南的部分烤煙樣品對(duì)建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,驗(yàn)證樣品與其所屬產(chǎn)區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度較高,而與其他產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度較低,從而能準(zhǔn)確的識(shí)別其所屬產(chǎn)區(qū)。將幾個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙樣品的指紋圖譜進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,不同產(chǎn)區(qū)的烤煙能夠很好的聚合到一類,表明構(gòu)建的指紋圖譜能夠反映不同產(chǎn)區(qū)烤煙的風(fēng)格特色,進(jìn)一步驗(yàn)證了利用 GC/MS 指紋圖譜結(jié)合系統(tǒng)聚類法對(duì)樣品進(jìn)行產(chǎn)區(qū)識(shí)別及風(fēng)格特色定位的可行性。
烤煙;致香物質(zhì);聚類分析;指紋圖譜;產(chǎn)區(qū)識(shí)別
我國(guó)煙區(qū)幅員遼闊生態(tài)多樣,使得不同產(chǎn)區(qū)的煙葉風(fēng)格各異[1-2],煙葉原料是發(fā)展“中式卷煙”的重要基礎(chǔ)[3-4]。通過將不同產(chǎn)區(qū)煙葉進(jìn)行組合配比,可以調(diào)制出風(fēng)格迥異的卷煙產(chǎn)品。目前,行業(yè)對(duì)煙葉風(fēng)格特色的定位、評(píng)價(jià)主要依靠感官評(píng)吸,易受評(píng)吸主觀影響,評(píng)價(jià)結(jié)果往往存在差異。指紋圖譜技術(shù)是近些年來出現(xiàn)的控制中藥材質(zhì)量的較好方法之一,以指紋圖譜作為中藥(天然藥物)提取物及其制劑的質(zhì)量控制方法[5-10],已成為國(guó)際共識(shí)。本研究旨在借助指紋圖譜技術(shù),建立起不同產(chǎn)區(qū)煙葉的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,并結(jié)合系統(tǒng)聚類分析的模式識(shí)別,用于指導(dǎo)、篩選和鑒定煙葉產(chǎn)區(qū)。
目前的研究表明,煙草致香物質(zhì)對(duì)煙草的風(fēng)格特色有著十分重要的影響[11-13],為了尋找不同香型特色煙葉的特征化學(xué)成分,中國(guó)煙葉公司 2010 年啟動(dòng)了“特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)”重大專項(xiàng),將“煙葉香型風(fēng)格的特征化學(xué)成分研究”項(xiàng)目作為專項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容。但由于形成香氣的物質(zhì)非常復(fù)雜,要從眾多成分中,找出影響煙葉風(fēng)格特色的關(guān)鍵物質(zhì),實(shí)非易事,目前尚未確定不同風(fēng)格特色煙葉的獨(dú)特化學(xué)成分。煙草指紋圖譜技術(shù),為從整體上評(píng)價(jià)煙草風(fēng)格特色提供了一種新技術(shù),因此,探索烤煙致香物質(zhì)指紋圖譜技術(shù),從“整體性”、“模糊性”的角度對(duì)煙葉的風(fēng)格特色定位,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)煙葉樣品的產(chǎn)區(qū)識(shí)別,有著積極的意義。
1.1 材料和儀器
1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)所用烤煙樣品為 2012 年采收,等級(jí)均為 C3F,采自湖南(郴州、永州)、廣西(河池、百色)、貴州(遵義、畢節(jié))、廣東(南雄)和河南(三門峽)5個(gè)產(chǎn)區(qū)。二氯甲烷為色譜純,氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純。
1.1.2 實(shí) 驗(yàn) 儀 器 氣 質(zhì) 聯(lián) 用 儀 : Agilent 7890A-5975C;同時(shí)蒸餾萃取裝置(安徽天長(zhǎng)華玻公司);氮吹儀(美國(guó) OA 公司);BS214S 天平(德國(guó) Sartorius);水浴鍋,電熱套。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 致香物質(zhì)測(cè)定 致香物質(zhì)的檢測(cè)采用同時(shí)蒸餾萃取-氣相色譜質(zhì)譜法(GC/MS)[14-15]。
1.2.2 相似度計(jì)算 采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度,計(jì)算公式參照曹建敏等[14]的方法。
1.2.3 感官評(píng)吸 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所評(píng)吸委員會(huì)參照 GB 5606.4—2005 卷煙第 4 部分[16]感官技術(shù)要求,對(duì)實(shí)驗(yàn)所用烤煙樣品卷制的單料煙進(jìn)行評(píng)吸,并對(duì)單料煙香型進(jìn)行評(píng)判。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用 DPS 13.5 軟件進(jìn)行。
2.1 不同產(chǎn)區(qū)烤煙致香物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜建立
不同產(chǎn)區(qū)烤煙一般都具有不同的風(fēng)格特色,因此,不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品即使經(jīng)感官評(píng)吸評(píng)判的香型相同,其風(fēng)格特色也不盡相同。從湖南、廣西、貴州 3 個(gè)產(chǎn)區(qū) 2012 年采收烤煙樣品中,根據(jù)評(píng)吸結(jié)果選取以上3個(gè)產(chǎn)區(qū)具有代表性的樣品,其中湖南 25 個(gè),香型以濃偏中、中偏濃和濃香型為主,廣西 25 個(gè),香型以中偏濃、濃偏中為主,貴州 25個(gè),香型以中偏清、清偏中、中間型為主,共 75個(gè)樣品。按照 1.2.1 方法進(jìn)行處理,通過 GC/MS 做全掃描,根據(jù)譜庫檢索結(jié)果,選擇匹配率大于 800的色譜峰共 130 個(gè),在選擇離子模式下進(jìn)行檢測(cè),對(duì)各樣品的 GC/MS 結(jié)果進(jìn)行分析,其中 75 個(gè)樣品具有 124 個(gè)共有峰(除內(nèi)標(biāo)),將這 124 個(gè)共有峰做相關(guān)性分析,將相關(guān)系數(shù)大于 0.70 的色譜峰合并,得到 101 個(gè)特征峰,參照文獻(xiàn)[17]方法計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。將這 101 個(gè)特征峰作為特征指紋峰,得到了這 75 個(gè)樣品的致香物質(zhì)指紋圖譜,利用平均數(shù)法,分別得到這3個(gè)產(chǎn)區(qū)的烤煙標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
2.2 不同產(chǎn)區(qū)烤煙致香物質(zhì)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)
將選取的烤煙樣品的指紋圖譜看做是以 101 個(gè)特征峰為維數(shù),以相對(duì)峰面積為物質(zhì)含量的空間 101維向量,分別計(jì)算 3個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙樣品與所屬產(chǎn)區(qū)及其他 2 個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度(表1)。
將每個(gè)產(chǎn)區(qū)中所有樣品與該產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的類內(nèi)相似度最小值定義為閾值,由此可知,湖南、廣西、貴州地區(qū)烤煙標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的閾值分別為 0.751、0.755、0.759。這樣以來,在鑒別不同產(chǎn)區(qū)烤煙樣品時(shí),分別計(jì)算未知樣品與3個(gè)產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度,再將每個(gè)相似度值跟與之相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)區(qū)閾值進(jìn)行比較,如果相似度值大于閾值,就認(rèn)為該未知樣品屬于這個(gè)產(chǎn)區(qū),反之,就不屬于該產(chǎn)區(qū)。從表1可以看出,除廣西8號(hào)樣品與湖南烤煙標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的類間相似度值略大于湖南地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的閾值外,其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)與另外兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的類間相似度均小于其類內(nèi)相似度的閾值。這說明建立的3個(gè)產(chǎn)區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜能夠?qū)⒉煌a(chǎn)區(qū)的烤煙樣品區(qū)分開來。
表1 湖南、廣西、貴州 3 產(chǎn)區(qū)建標(biāo)樣品與 3 產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜程度相似度結(jié)果Table 1 The similarity degree of fingerprint of flue-cured tobacco from different areas
2.3 不同產(chǎn)區(qū)烤煙指紋圖譜驗(yàn)證
為了驗(yàn)證3個(gè)產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜在產(chǎn)區(qū)識(shí)別中的可行性和準(zhǔn)確性,從湖南、廣西、貴州、河南、廣東選取 20 個(gè)具有產(chǎn)區(qū)代表性的烤煙樣品,其中湖南 3 個(gè)(評(píng)吸結(jié)果判定香型為中偏濃)、廣西 3個(gè)(評(píng)吸結(jié)果判定香型為中偏濃),貴州 4 個(gè)(評(píng)吸結(jié)果判定為中間香型)、廣東 5 個(gè)(評(píng)吸結(jié)果判定為濃香型)、河南 5 個(gè)(評(píng)吸結(jié)果判定為濃偏中),按照 1.2.1 和 2.1 方法進(jìn)行處理,得到 20 個(gè)烤煙樣品的特征指紋圖譜,分別計(jì)算這 20 個(gè)樣品指紋圖譜與3個(gè)產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度值,如表2所示,再結(jié)合 3 個(gè)產(chǎn)區(qū)的閾值,可以得出,1#、2#、3#為湖南產(chǎn)區(qū)樣品,4#、5#、6#為廣西產(chǎn)區(qū)樣品,7#、8#、9#、10#為貴州產(chǎn)區(qū)樣品,11#~20#與 3 個(gè)產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度均低于其閾值,因此不屬于這3個(gè)產(chǎn)區(qū)。由驗(yàn)證結(jié)果可以看出,每個(gè)樣品與其所屬產(chǎn)區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度較高,而與其他產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度較低,從而準(zhǔn)確的識(shí)別出其所屬產(chǎn)區(qū)。
2.4 不同產(chǎn)區(qū)烤煙樣品系統(tǒng)聚類分析
對(duì)湖南、廣西、貴州 75 個(gè)建標(biāo)樣品,廣東、河南 10 個(gè)驗(yàn)證樣品,共計(jì) 85 個(gè)烤煙樣本的 101 個(gè)特征峰,相對(duì)參比峰的峰面積進(jìn)行量化,得到85*101 價(jià)原始數(shù)據(jù)矩陣,運(yùn)用 DPS 軟件,對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后,采用絕對(duì)值距離,離差平方和聚類方法,進(jìn)行聚類分析。圖1為系統(tǒng)聚類譜系圖,由圖1可以看出,不同產(chǎn)區(qū)烤煙樣品能夠很好的聚合到一起,界限較為明顯,與指紋圖譜的判斷結(jié)果基本一致。當(dāng) 85 個(gè)樣品分為兩大類時(shí),湖南、廣東、河南、廣西的 60 個(gè)樣品聚為一類,貴州的 25 個(gè)樣品聚為一類,說明貴州烤煙樣品與其他4個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙風(fēng)格特色差異較大。表明構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的致香物質(zhì)種類能夠反映不同產(chǎn)區(qū)烤煙的風(fēng)格特色,從而更好的驗(yàn)證了利用致香物質(zhì)指紋圖譜對(duì)樣品進(jìn)行產(chǎn)區(qū)識(shí)別和風(fēng)格特色評(píng)價(jià)的可行性。
表2 不同產(chǎn)區(qū)烤煙指紋圖譜驗(yàn)證Table 2 Verification of fingerprint of flue-cured tobacco from different areas
圖1 不同地區(qū)烤煙系統(tǒng)聚類分布圖Fig. 1 Hierarchical clustering dendrogram of fingerprint of flue-cured tobacco from different areas
本研究通過借鑒中藥質(zhì)量控制研究領(lǐng)域指紋圖譜技術(shù),建立了湖南、廣西、貴州3個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙致香物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜,分別計(jì)算這3個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙樣品與所屬產(chǎn)區(qū)及其他兩個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的類內(nèi)和類間相似度值,相似度結(jié)果越大表明該樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似程度越高。從相似度計(jì)算結(jié)果可以看出,每個(gè)產(chǎn)區(qū)內(nèi)樣品與該產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的類內(nèi)相似度值較高,而與其他產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的類間相似度值偏低,說明同一產(chǎn)區(qū)烤煙樣品的風(fēng)格特色相似程度較高,而與其他產(chǎn)區(qū)差異較大。將每個(gè)產(chǎn)區(qū)建標(biāo)樣品與該產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的類內(nèi)相似度最小值定義為閾值,分別計(jì)算未知樣品與3個(gè)產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度,再將相似度值跟與之相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)區(qū)閾值進(jìn)行比較,可以對(duì)烤煙樣品的產(chǎn)地進(jìn)行識(shí)別。
文中又選取了湖南、廣西、貴州、廣東、河南5個(gè)產(chǎn)區(qū)共20個(gè)烤煙樣品對(duì)湖南、廣西、貴州3個(gè)產(chǎn)區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,除廣西8號(hào)樣品與湖南烤煙標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的類間相似度值略大于湖南地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的閾值外,其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)與另外兩個(gè)產(chǎn)區(qū)的類間相似度均小于其類內(nèi)相似度的閾值,另外,驗(yàn)證樣品與其所屬產(chǎn)區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度較高,而與其他產(chǎn)區(qū)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度較低,從而能準(zhǔn)確的識(shí)別出其所屬產(chǎn)區(qū),將不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品區(qū)分開來。
在中藥原材料質(zhì)量控制中,聚類分析、主成分分析等化學(xué)模式識(shí)別可作為相似度評(píng)價(jià)方法的有益補(bǔ)充,從而更客觀的評(píng)價(jià)中藥內(nèi)在質(zhì)量的真實(shí)性和一致性[18],目前這種研究方法在石斛蘭和靈芝的質(zhì)量控制和產(chǎn)地識(shí)別中都有應(yīng)用[19-20]。本研究運(yùn)用系統(tǒng)聚類分析對(duì) 85 個(gè)烤煙樣品的指紋圖譜進(jìn)行了模式識(shí)別,從系統(tǒng)聚類譜系圖可以看出,不同產(chǎn)區(qū)烤煙由于具有不同的風(fēng)格特色,能夠很好的聚合到一類,分析結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算結(jié)果一致。
本研究建立的烤煙致香物質(zhì) GC/MS 指紋圖譜方法,能夠有效的對(duì)烤煙產(chǎn)區(qū)進(jìn)行識(shí)別,從而將不同產(chǎn)區(qū)的烤煙樣品區(qū)分開來。此外,將指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)方法結(jié)合系統(tǒng)聚類的化學(xué)模式識(shí)別,可以直觀的顯示各個(gè)產(chǎn)區(qū)烤煙的分布,對(duì)不同煙區(qū)烤煙進(jìn)行空間識(shí)別,從而進(jìn)一步驗(yàn)證了利用致香物質(zhì)指紋圖譜對(duì)烤煙樣品進(jìn)行產(chǎn)區(qū)識(shí)別和風(fēng)格特色評(píng)價(jià)的可行性。
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Application of Aroma Component GC/MS Fingerprint in Identifying Producing Areas of Flue-cured Tobacco
CAO Jianmin1, YU Weisong1, HUANG Jian3, GUO Chengfang1, FANG Song1, XIA Bingbing1,2, JIANG Zhengling1,2, QIU Jun1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2.Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3. China Tobacco Jiangxi Industrial Co., Ltd., Nanchang 330096, China)
In order to explore the potential of identifying flue-cured tobacco producing areas and controlling leaf quality by using GC/MS fingerprint, SDE combined with GC/MS was used to construct three standard fingerprints on aroma component of flue-cured tobacco from three areas (Hunan, Guangxi and Guizhou). Random samples from the 3 areas were used to tested and samples from Guangdong and Henan were used to verify the standard fingerprints. The results showed that there was high similarity among samples in the same producing area for the 3 areas, while low similarity was exist among samples from different areas. The sample similarity from Guangdong, Henan with the other 3 areas were lower than the threshold value of the standard fingerprint. It suggested that the system could discriminate effectively producing areas of flue-cured tobacco. Hierarchical cluster analysis was also carried out to analyze the aroma component of the flue-cured tobacco. The results showed that it was basically the same as the fingerprint identification results, which further proved the feasibility of identification of the producing areas and the characteristic of flue-cured tobacco based on GC/MS fingerprint and combined hierarchical cluster analysis.
flue-cured tobacco; aroma component; hierarchical cluster analysis; fingerprint chromatography; origin discrimination
S572.01
1007-5119(2014)06-0085-05
10.13496/j.issn.1007-5119.2014.06.017
公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)資助(201203091)
曹建敏,女,碩士,助研,研究方向?yàn)闊煵莼瘜W(xué)與煙草質(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail:caojianmin11@163.com。*通信作者,E-mail:qjun1975@126.com
2014-05-29
2014-11-27