上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科，上海 200233

微小RNA-214在胰腺癌中的表達及臨床意義研究

朱宏達 馬塵超 艾開興

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科，上海 200233

背景與目的：微小RNAs(microRNAs，miRNA，miR)在多種腫瘤中異常表達，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，被認(rèn)為可能起癌基因或抑癌基因的作用。該研究旨在檢測miR-214在胰腺癌組織中的表達情況，并探討其臨床意義。方法：實時定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)法檢測36例胰腺癌組織與相應(yīng)癌旁組織中miR-214的表達水平，分析miR-214表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：miR-214在69.4%(25/36)的胰腺癌組織中相對高表達，表達水平為3.45(1.73～5.13)，癌旁組織中的表達水平為1.52(1.09～2.12)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，并且在T3、T4期患者中的表達水平顯著高于T1、T2期患者(P=0.018)。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-214表達水平越高，患者生存期越短(P=0.032)。結(jié)論：miR-214在胰腺癌組織中的表達上調(diào)與胰腺癌的臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān)，miR-214可能成為胰腺癌診斷及預(yù)后判斷的新的分子標(biāo)志。

胰腺腫瘤；微小RNAs；預(yù)后；miR-214

胰腺癌是目前已知的惡性程度最高的腫瘤之一，其死亡率和發(fā)病率之比接近0.99∶1，在美國癌癥死亡原因中，胰腺癌居第四位，5年生存率＜5%［1］。在中國，胰腺癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢，逐漸接近西方國家水平。目前，胰腺癌的治療仍首選手術(shù)切除，但由于早期診斷率低，僅10%～20%的患者在診斷時能夠得到根治性切除，且術(shù)后生存率僅為20%［2］。近年來，一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的非蛋白編碼微小RNAs(microRNAs，miRNA，miR)的研究，給胰腺癌的診斷與治療帶來了新的啟示。miRNA是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)的互補序列相配對，降解或抑制mRNA的翻譯，導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中具有重要作用［3］。目前大量研究結(jié)果顯示miRNA能夠通過調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯，促進或抑制各種腫瘤的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織和非癌組織中miRNAs表達譜存在明顯差異的［4-6］，提示miRNA可能與胰腺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、藥物抵抗等生物學(xué)行為相關(guān)，因此其可能在胰腺癌診斷、治療和預(yù)后判斷中具有一定的應(yīng)用價值［7］。本研究旨在檢測miR-214在胰腺癌組織中的表達，探討其與臨床病理特征、臨床預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

胰腺癌標(biāo)本36例，取自2009年1月—2010年12月于我院普外科行胰腺癌手術(shù)切除的患者，均知情同意，并簽署書面知情同意書。其中男性23例，女性13例，年齡40～83歲，中位年齡為61歲。按腫瘤部位(胰頭和胰體尾)、腫瘤大小(≤2 cm，＞2 cm)、浸潤深度(T1、T2及T3、T4)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤、血管浸潤、周圍神經(jīng)浸潤、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ，Ⅲ～Ⅳ)、CA199水平(≤37 ng/mL，＞37 ng/mL)進行臨床病理資料分析，其中TNM分期依照美國癌癥委員會(AJCC)胰腺癌TNM分期(2010)標(biāo)準(zhǔn)進行。每例患者的手術(shù)標(biāo)本均在標(biāo)本離體后10 min內(nèi)予鋒利刀片迅速切取胰腺癌及相應(yīng)癌旁組織(距癌組織＞3 cm)各5塊。所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療、放療或免疫治療，術(shù)后病理檢查均由2位病理醫(yī)師共同診斷，且病理診斷結(jié)果顯示均為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)。組織標(biāo)本離體后立即放入液氮，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；實時定量PCR(real-time PCR RTPCR)試劑盒All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR檢測試劑盒、U6、miR-214引物購自美國復(fù)能基因有限公司；無水乙醇、甲醇、異丙醇、氯仿、鹽酸均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；槍頭，EP管，離心管均購自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

將收集的胰腺癌及癌旁組織標(biāo)本從液氮罐中取出，剪切成綠豆大小塊狀，放入研缽中研磨，隨后裝入加有1 mL TRIzol的EP管，靜置5 min，加氯仿0.2 mL，混勻靜置5 min，離心(4 ℃，12 000×g，15 min)，吸取上清液，加入0.5 mL異丙醇，靜置15 min，離心(4 ℃，12 000×g，15 min)，可見RNA沉淀, 棄上清液, 加750 mL/L乙醇1 mL混勻，離心(4 ℃，7 500×g，5 min)，棄上清液，加入RNase free water溶解RNA沉淀。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量、紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。

1.2.2 RT-PCR檢測miR-214的表達

取總RNA 2 μg進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：16 ℃，30 min，42 ℃，30 min，85 ℃，10 min。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行實時定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)熱2 min；95 ℃預(yù)變性10 min(95 ℃變性15 s；60 ℃延伸1 min)共40個循環(huán)；95 ℃終延伸15 s。以上各步驟中，反應(yīng)體系以及試劑用量均嚴(yán)格按照說明書進行。RT-PCR結(jié)果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt比較各樣品間miR-214的表達差異［8］，ΔCt=待檢樣品的miR-214 Ct值-該樣品的U6 Ct值，ΔΔCt值=腫瘤組織的 ΔCt 值-癌旁組織的ΔCt值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

非正態(tài)數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，兩組間配對樣本采用Wilcoxon檢驗，獨立樣本采用Mann-Whitney檢驗；正態(tài)數(shù)據(jù)以表示，采用配對t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線以及Log-rank檢驗比較生存率差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-214在胰腺癌組織中高表達

RT-PCR技術(shù)檢測36例胰腺癌組織和癌旁組織中miR-214的表達水平結(jié)果見圖1。

檢測結(jié)果顯示，miR-214在69.4%(25/36)的胰腺癌組織中相對高表達，表達水平為3.45(1.73～5.13)，癌旁組織的表達水平為1.52(1.09～2.12)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

2.2 miR-214的表達與胰腺癌臨床病理特征間的關(guān)系

圖1 RT-PCR檢測miR-214在胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達Fig. 1 RT-PCR was used to detect the miR-214 expressions in PDAC tissues and matched adjacent normal tissues

表1 胰腺癌組織中miR-214的表達與臨床病理特征間的關(guān)系Tab. 1 Correlation between miR-214 expression levels and clinic-pathological features in PDAC＃

以胰腺癌組織中miR-214表達量的中位數(shù)為分界點將其分為低表達組和高表達組［9］，分析兩組與臨床病理特征間的關(guān)系(表1)。結(jié)果表明，miR-214的表達水平與胰腺癌T分期密切相關(guān)，T3、T4期患者中miR-214高表達率為66.7%(14/21)，顯著高于T1、T2期患者的26.7%(4/15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤、血管浸潤、周圍神經(jīng)浸潤、TNM分期及CA199水平無明顯相關(guān)性(P＞0.05，表1)。

2.3 miR-214表達與預(yù)后的關(guān)系

以胰腺癌組織中miR-214表達量的中位數(shù)為分界點將其分為低表達組和高表達組，利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線以及Log-rank檢驗比較兩組之間生存率的差異。結(jié)果表明miR-214高表達患者的中位生存期為9.0個月，顯著低于miR-214低表達患者的20.0個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032，圖2)。

圖2 miR-214表達與胰腺癌患者的生存時間的關(guān)系Fig. 2 The relationship between the miR-214 expression and survival time of pancreatic cancer patients

3 討 論

自1993年文獻首次報道m(xù)iRNA以來，對miRNA的研究不斷深入。癌基因或抑癌基因的mRNA能夠成為miRNA的靶點，因此miRNA的失調(diào)會影響基因的表達，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。大量研究證實miRNA在乳腺癌［10］、肝癌［11］、胃癌［12］、胰腺癌［13］、結(jié)直腸癌［14］等多種惡性腫瘤中表達失調(diào)。一種miRNA往往可以調(diào)控多個靶基因，一個靶基因又可以被多種miRNA所調(diào)控，在腫瘤形成過程中，多條信號通路交錯形成復(fù)雜的信息網(wǎng)絡(luò)，因此不同腫瘤的miRNA的表達譜往往不同［15］。miRNA表達譜的特異性為腫瘤的篩查、診斷、治療提供了新的思路［16］。

miR-214位于人1號染色體長臂(1q24.3)的Dnm3基因內(nèi)，是miRNA家族中的一個重要分子［17］。近年來發(fā)現(xiàn)miR-214在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中表現(xiàn)尤為活躍，其在多種惡性腫瘤中表達失調(diào)，并且與患者的臨床病理特征關(guān)系密切。但在不同腫瘤中miR-214的表達情況卻不盡相同，具有一定的腫瘤特異性。Schwarzenbach等［18］發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者血清中miR-214呈低表達，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。Shih等［19］發(fā)現(xiàn)miR-214在肝細(xì)胞肝癌患者中低表達，且與患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后不良密切相關(guān)。Zhou等［20］發(fā)現(xiàn)miR-214在食管鱗癌中呈低表達并與食管鱗癌的病理分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。另一方面，miR-214在某些腫瘤中呈現(xiàn)高表達，通過促進腫瘤細(xì)胞的增殖、增強對化療藥物耐藥性發(fā)揮促癌作用。Zhang等［21］發(fā)現(xiàn)miR-214在胰腺癌中高表達，并能降低癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性，可能與胰腺癌患者化療效果差密切相關(guān)。Penna等［22］發(fā)現(xiàn)miR-214在黑色素瘤中高表達，并可通過調(diào)節(jié)功能基因TFAP2C、ITGA3及多種細(xì)胞表面分子的表達而促進腫瘤細(xì)胞的遷徙、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

本研究結(jié)果顯示胰腺癌組織中miR-214的表達水平較癌旁組織顯著增高，提示miR-214的表達上調(diào)可能參與了胰腺癌的發(fā)生，miR-214在胰腺癌發(fā)生中可能起癌基因的作用；胰腺癌組織中miR-214的表達水平與胰腺癌的浸潤深度(T分期)具有顯著相關(guān)性，與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤、血管浸潤、周圍神經(jīng)浸潤、TNM分期及CA199水平無明顯相關(guān)，但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者中有高表達傾向，說明miR-214的表達上調(diào)可能促進了胰腺癌的進展；胰腺癌組織中miR-214的表達水平與胰腺癌患者的生存期及臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，即表達水平越高，患者的生存期越短，這與Zhang等［21］報道的結(jié)果相似，至于是由于腫瘤本身生物學(xué)特性造成的生存期降低還是由于后期的化療干預(yù)造成的，有待進一步研究。這些結(jié)果表明miR-214在胰腺癌組織中表達顯著升高，并且與胰腺癌的惡性程度及臨床預(yù)后相關(guān)，因此對胰腺癌的診斷及患者臨床預(yù)后的預(yù)測具有一定的指導(dǎo)意義。但是，是否適合作為胰腺癌診斷及預(yù)后預(yù)測的組織分子標(biāo)志物尚需進一步深入研究。并且本研究獲取的樣本量較小，因而確切的結(jié)論需要更多的樣本進一步觀察驗證。

綜上所述，miR-214在胰腺癌組織中的表達上調(diào)與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miR-214可能成為胰腺癌診斷及預(yù)后判斷的新的分子標(biāo)志。

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The expression and clinical signi ficance of microRNA-214 in pancreatic cancer

ZHU Hong-da, MA Chen-chao, AI Kai-xing
(Department of General Surgery, Shanghai Jiao Tong University Affiliated 6thPeople’s Hospital, Shanghai 200233, China)

AI Kai-xing E-mail: akxing8258@gmail.com

Background and purpose: Aberrant expressions of microRNAs (miRNA, miR)are reported in various cancers and may associate with cancer occurrence, development, invasion and metastasis, thereby functioning as either tumor suppressors or oncogenes. This study attempted to observe the expression of miR-214 in pancreatic cancer and to explore its clinical signi ficance. Methods: Real-time PCR was used to detect the miR-214 expressions between pancreatic cancer tissues and matched adjacent tissues. The correlations of miR-214 expression with clinicpathological features and clinical prognosis were analyzed. Results: MiR-214 expression was up-regulated in 69.4% (25/36) of tumor tissue specimens. The relative expression level of miR-214 was signi ficantly higher in tumor tissues than in matched adjacent tissues (3.45 vs 1.52, P＜0.01). Higher miR-214 level was strongly associated with T3-T4stage (P=0.018). The Kaplan-Meier analysis revealed that patients with higher expression of miR-214 had a shorter survival time (P=0.032). Conclusion: The expression of miR-214 is associated with clinic-pathological features and patient’s clinical prognosis, so it may be used as a potential diagnostic biomarker and a prognostic predictor in patients with pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; MicroRNAs; Prognosis; MiR-214

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.08.006

R735.9

A

1007-3639(2014)08-0594-05

2014-05-16

2014-06-16）

艾開興 E-mail:akxing8258@gmail.com