陳 兵，胡運(yùn)發(fā)，孫 潔，陳書(shū)琨，劉建利，曾少靈，曹琛福，張彩虹，阮周曦，林慶燕，呂建強(qiáng)，楊俊興，花群義，盧體康，秦智鋒＊

新城疫病毒實(shí)時(shí)熒光RTLAMP檢測(cè)方法的建立*

陳 兵1，胡運(yùn)發(fā)1，孫 潔2，陳書(shū)琨1，劉建利2，曾少靈1，曹琛福2，張彩虹2，阮周曦2，林慶燕1，呂建強(qiáng)1，楊俊興1，花群義1，盧體康1，秦智鋒1＊

（1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳 518045；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳 518001）

新城疫是影響家禽養(yǎng)殖業(yè)的重大動(dòng)物疫病，建立現(xiàn)場(chǎng)快速分子學(xué)檢測(cè)方法是其防控關(guān)鍵。借助熱裂解法抽提病毒RNA，在篩選出最佳核酸染料Calcein的基礎(chǔ)上，建立新城疫病毒（NDV）實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（rRT-LAMP）檢測(cè)法，并對(duì)該法進(jìn)行特異性、敏感性及準(zhǔn)確性分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所建立的NDV-rRT-LAMP方法可有效鑒別NDV，其敏感性可檢測(cè)至50個(gè)基因拷貝，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)法一致；該法特異性強(qiáng)，與AIV、IBV等常見(jiàn)禽呼吸道傳染病病原無(wú)交叉反應(yīng)。小規(guī)模田間試驗(yàn)顯示，該法用于NDV的普查監(jiān)測(cè)，結(jié)果可靠。結(jié)果表明，建立的NDV-rRT-LAMP檢測(cè)法可滿足NDV現(xiàn)場(chǎng)快速分子檢測(cè)需求。

新城疫病毒；實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一類(lèi)主要感染禽類(lèi)的烈性傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)防控的重大動(dòng)物疫病［1］。發(fā)病率和病死率較高，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染?。?6－18］。建立適合基層和現(xiàn)場(chǎng)使用的快速靈敏的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，成為相關(guān)部門(mén)防控該病的重要技術(shù)支撐［1］。

LAMP自2000年發(fā)明以來(lái)，在各個(gè)核酸檢測(cè)領(lǐng)域進(jìn)行了大量的使用［2－5］。本實(shí)驗(yàn)室已初步建立了口蹄疫病毒RT-LAMP檢測(cè)方法［6］和H5亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP檢測(cè)法［7］，并得到了一定的應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，建立了基于現(xiàn)場(chǎng)熱裂解抽提核酸的 NDV RT-LAMP（real-time RT-LAMP，rRT-LAMP）檢測(cè)法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)毒株 新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9（NDV-F48E9）、新城疫凝集抗原（NDV-HI）、新城疫Ⅰ系疫苗（Mukteswar株，NDV-Ⅰ））、新城疫Ⅳ系疫苗（La Sota株，NDV-Ⅳ）、H5亞型禽流感抗原（AIV-Re-6）、傳染性支氣管炎活疫苗（IBV-LDT3-A株）、傳染性法氏囊病活疫苗（IBDV-Gt株）等抗原，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀，EZ1核酸抽提儀，ESEQuant Tube Scanner儀；RNase free H2O（TaKaRa），10× Bst polymerase buffer（New England Biolabs），large fragment Bst DNA polymerase（New England Biolabs），AMV（TaKaRa），25mmol／L MgSO4（TaKaRa），Betaine（Sigma），10mmol／L dNTPs（Sigma），500μmol／L MnCl2（Sigma），EZ1Viral RNA Mini Kit v2.0（Qiagen），qRT-PCR Kit（Applied Biosystems），Calcein（Fluka）。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 融合蛋白基因（F基因）是新城疫病毒的重要免疫原蛋白基因，對(duì)新城疫的診斷具有重要意義。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中NDV F基因的核苷酸序列，使用DNA Star分析選出6個(gè)高特異性的保守核苷酸區(qū)域，通過(guò)Primer Premier 5設(shè)計(jì)外引物（F3和B3）、內(nèi)引物（FIP和BIP）等2對(duì)引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，相應(yīng)序列見(jiàn)表1。用前將1mmol／L各引物貯存液按FIP／BIP∶F3／B3∶LPF／LBF為8∶1∶4混勻備用。

1.2.2 NDV核酸抽提及克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 用EZ1核酸抽提儀抽提 NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ各毒株 RNA，洗脫體積為90μL。采用NDV-rRT-LAMP外引物F3和B3分別作為上游和下游引物，以 NDV-F48E9RNA為模板進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 45min；95 ℃10min；94℃45s，56℃60s，72℃60s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。分離純化擴(kuò)增產(chǎn)物，使用pMD18-T Vector構(gòu)建pMD18-T-F重組質(zhì)粒并測(cè)定濃度，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 NDV-rRT-LAMP檢測(cè)引物Table 1 Primers for NDV-rRT-LAMP

1.2.3 NDV-rRT-LAMP檢測(cè)方法 參考相關(guān)報(bào)道［6，7，14］，用 RNase free H2O 配 制 500 μmol／L MnCl2，25μmol／L Calcein儲(chǔ)存液，二者按2.5∶1混勻作為Calcein工作液。取 NDV-F48E9、NDVHI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ 病 毒 尿 囊 液 各 20μL，于100℃熱裂解2min，離心并取2μL作為模板。NDV-rRT-LAMP反應(yīng)體系為25μL，其中10×Bst DNA buffer 2.5μL，Bst DNA Polymerase 1μL，Amv 1μL，Mg2＋0.6μL，dNTPs 3.5μL，Betaine 5μL，Primers mix 1μL，Calcein-Mn2＋1μL，RNase free H2O 8.5μL。反應(yīng)體系混勻后瞬時(shí)離心，于ESEQuant Tube Scanner儀上63℃反應(yīng)50min。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)病毒尿囊液）和空白對(duì)照（RNase free H2O）。

1.2.4 NDV-rRT-LAMP可視化檢測(cè)方法 重新進(jìn)行1.2.3中的 NDV-rRT-LAMP反應(yīng)。在制備反應(yīng)液時(shí)，取0.5μL SYBR GreenⅠ作為染色劑，于反應(yīng)前小心滴加于反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，小心操作避免掉入反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后顛倒反應(yīng)管以混入染料，觀察顏色變化。將反應(yīng)液置于紫外燈下，觀察顏色變化。

1.2.5 NDV-rRT-LAMP檢測(cè)法的評(píng)價(jià)

1.2.5.1 NDV-rRT-LAMP敏感性試驗(yàn) 將 NDVHI抗原原液10倍系列稀釋?zhuān)瑹崃呀夥ǔ樘岷怂岷笸瑫r(shí)進(jìn)行 NDV-rRT-LAMP 和實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR（real-time RT-PCR，rRT-PCR），對(duì)比2種檢測(cè)方法的敏感性。將pMD○R18-T-H5從105拷貝開(kāi)始進(jìn)行10倍倍比稀釋并進(jìn)行NDV-rRT-LAMP，確定該法可檢測(cè)的最低基因拷貝數(shù)。

1.2.5.2 NDV-rRT-LAMP特異性試驗(yàn) 取 NDVHI、AIV-Re-6、IBV-LDT3-A、IBDV-Gt等病毒經(jīng)核酸抽提儀抽提核酸，同時(shí)進(jìn)行NDV-rRT-LAMP檢測(cè)和可視化檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.2.5.3 NDV-rRT-LAMP田間樣品檢測(cè) 隨機(jī)采取雞喉頭／泄殖腔棉拭子浸出液20份，熱裂解法抽提核酸并進(jìn)行 NDV-rRT-LAMP；同時(shí)采用EZ1抽提RNA，參照新城疫實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，探討該方法的田間實(shí)用性及可靠性。

2 結(jié)果

2.1 NDV-rRT-LAMP實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果

以 NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ直接熱裂解模板為核酸，于儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。4個(gè)新城疫毒株檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，出現(xiàn)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線；陰性尿囊液（NTC）和空白水對(duì)照（BTC）的檢測(cè)結(jié)果為陰性，檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 熱裂解法NDV-rRT-LAMP實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking

2.2 NDV-rRT-LAMP可視化檢測(cè)結(jié)果

各毒株在儀器上實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP檢測(cè)結(jié)束后，取出肉眼觀察，各反應(yīng)管液比較清晰，很少觀察到混濁沉淀。將反應(yīng)液倒置，反應(yīng)前將SYBR GreenⅠ預(yù)滴加于管蓋內(nèi)側(cè)的0.5μL SYBR GreenⅠ混入反應(yīng)液，觀察發(fā)現(xiàn) NDV-F48E9、NDV-HI、NDV-Ⅰ、NDV-Ⅳ等實(shí)時(shí)熒光陽(yáng)性的反應(yīng)液呈現(xiàn)黃綠色，紫外光下為翠綠色；陰性尿囊液和空白水對(duì)照等實(shí)時(shí)熒光陰性反應(yīng)液呈現(xiàn)為淡橙色，紫外光下為淡綠色（圖2）。

圖2 熱裂解法NDV-rRT-LAMP肉眼檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking observed with naked eyes

2.3 NDV-rRT-LAMP檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 NDV-rRT-LAMP 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將NDV-HI 10倍系列稀釋?zhuān)瑹崃呀夥ǔ樘岷怂岷笾苯舆M(jìn)行 NDV-rRT-LAMP 和 rRT-PCR 檢測(cè)。結(jié)果NDV-rRT-LAMP最低檢測(cè)限為10－5稀釋度，與新城疫rRT-PCR檢測(cè)靈敏度相當(dāng)（圖3）。將pMD○R18-T-F重組質(zhì)粒從105μL開(kāi)始進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)M(jìn)行NDV-rRT-LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示該法最低檢測(cè)限在101～102，計(jì)算約為50個(gè)基因拷貝。

圖3 熱裂解法NDV-rRT-LAMP靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity test results of NDV-rRT-LAMP with thermal cracking

2.3.2 NDV-rRT-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果 NDV-rRT-LAMP特異性試驗(yàn)表明，所建立的方法無(wú)論進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP檢測(cè)，還是加入染料后進(jìn)行肉眼觀察，均與 AIV-Re-6、IBV-LDT3-A、IBDV-Gt等病原體無(wú)交叉反應(yīng)，表明所建立的方法特異性強(qiáng)。

2.4 田間樣品檢測(cè)結(jié)果

20份田間樣品同時(shí)進(jìn)行NDV-rRT-LAMP和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種檢方法均特異性檢測(cè)出NDV陽(yáng)性4份，陰性16份，檢測(cè)結(jié)果完全一致。

3 討論

LAMP方法自2001年發(fā)明以來(lái)，引發(fā)了廣大科研人員的關(guān)注，有關(guān)LAMP檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用也十分廣泛［2－14］。LAMP在非洲受到了廣泛關(guān)注，被制定成標(biāo)準(zhǔn)方法用于人的非洲錐蟲(chóng)病的診斷。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）也對(duì)禽流感病毒RT-LAMP技術(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，認(rèn)為該方法簡(jiǎn)便實(shí)用，同時(shí)也指出該法存在漏檢現(xiàn)象。

在LAMP的引物設(shè)計(jì)中，目前多采用設(shè)計(jì)環(huán)引物來(lái)提升檢測(cè)速度。在本研究中，如果再加入2個(gè)環(huán)引物，則需要找到8個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域，非常困難。所以在找到6個(gè)相對(duì)保守的區(qū)域情況下，沒(méi)有設(shè)計(jì)環(huán)引物而直接進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)盡管不采用環(huán)引物，仍然在1h內(nèi)可以得到檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)速度仍然快于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)。

LAMP傳統(tǒng)結(jié)果判定方法有兩種，一種是通過(guò)在終反應(yīng)液中加入核酸染料，觀察熒光及顏色變化并結(jié)合凝膠電泳判斷檢測(cè)結(jié)果；另一種是通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)液中白色焦磷酸鎂濁度而進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。但采用一種小型便攜式儀器，將實(shí)時(shí)與肉眼觀察結(jié)合起來(lái)，以便在現(xiàn)場(chǎng)或基層進(jìn)行快速分子生物學(xué)檢測(cè)，是LAMP進(jìn)一步推廣使用的制約條件。我們通過(guò)反應(yīng)前在RT-LAMP反應(yīng)體系中加入熒光染色劑Calcein，在管蓋內(nèi)側(cè)滴加SYBR GreenⅠ，使用ESEQuant Tube Scanner儀進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，反應(yīng)后倒置混勻進(jìn)行肉眼觀察，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)熒光和肉眼觀察的同時(shí)檢測(cè)。由于SYBR GreenⅠ具有核酸擴(kuò)增的抑制性，所以在反應(yīng)前不能將其混入反應(yīng)液，而需要滴加于管蓋內(nèi)側(cè)靠邊的位置。LAMP由于擴(kuò)增效率極高，打開(kāi)蓋后會(huì)出現(xiàn)氣溶膠污染，所以反應(yīng)結(jié)束后嚴(yán)禁打開(kāi)管蓋。我們?cè)鴩L試在實(shí)時(shí)熒光RTLAMP檢測(cè)前，在反應(yīng)液表面滴加石蠟油來(lái)防止打開(kāi)蓋時(shí)的氣溶膠污染。但發(fā)現(xiàn)石蠟油對(duì)ESEQuant Tube Scanner儀的實(shí)時(shí)檢測(cè)有影響，熒光信號(hào)非常低，且不穩(wěn)定。

本試驗(yàn)針對(duì)NDV的F基因中高保守且特異性強(qiáng)核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)采用簡(jiǎn)并引物來(lái)避免漏檢，可用于NDV基層的分子生物學(xué)快速檢測(cè)。同時(shí)本試驗(yàn)成功將熱裂解法［15］與 NDV-rRT-LAMP結(jié)合，大幅度縮短了待檢樣品處理時(shí)間。

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Establishment of Real-time Fluorescent Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification for Newcastle Disease Virus Detection

CHEN Bing1，HU Yun-fa1，SUN Jie2，CHEN Shu-kun2，LIU Jian-li2，ZENG Shao-ling2，CAO Chen-fu2，ZHANG Cai-hong2，RUAN Zhou-xi2，LIN Qing－yan1，LüJian-qiang2，YANG Jun-xing2，HUA Qun-yi2，LU Ti-kang1，QIN Zhi-feng1

（1.ShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Shenzhen，Guangdong，518045，China；2.ShenzhenInspectionandQuarantineScienceResearchInstitute，Shenzhen，Guangdong，518001，China）

Newcastle disease virus（NDV）is a major causative agent and a rapid and sensitive molecular biological diagnosis is crucial to prevent and control Newcastle disease.NDV real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（NDV-rRT-LAMP）was established by means of heat treatment of the samples.The sensitivity，specificity and repeatability of this method were evaluated.The results showed the sensitivity of this method was equal to the NDV real-time RT-PCR assay，and the detection limit was fifty gene copy per reaction.This method had no cross-reactivity with other avian disease agents such as AIV，IBV et al.Small-scale tests for field samples indicated this method was reliable for survey monitoring of N5on site.

Newcastle disease virus；real-time fluorescent reverse transcription loop-mediated isothermal amplification；detection on site

S852.659.5；Q789

A

1007-5038（2014）07-0011-04

2013-12-17

科技部質(zhì)檢公益項(xiàng)目（201210018-4）；深圳市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（JC201105190875A）

陳 兵（1981－），男，河南人，碩士研究生，主要從事進(jìn)出境動(dòng)物檢疫研究。＊通訊作者