張照然　禹虹霞　馬彥嬌等

摘要 [目的]對(duì)引起三七細(xì)菌性葉斑病的病原菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。[方法]以2011及2012年在云南文山及石林縣的三七苗圃采集的三七細(xì)菌性葉斑病病株為材料，采用柯赫氏法則，檢測(cè)分離菌株致病性并重新分離得到病原菌。通過(guò)病菌形態(tài)觀察、致病性測(cè)定、16S rDNA序列分析及生理生化特性分析（Biolog系統(tǒng)）對(duì)其進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]確定三七細(xì)菌性葉斑病病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae）。[結(jié)論]該研究為三七細(xì)菌性葉斑病菌詳細(xì)鑒定的國(guó)內(nèi)首報(bào)。

關(guān)鍵詞 三七細(xì)菌性葉斑病；丁香假單胞菌；病原菌鑒定

中圖分類號(hào) S435.67 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）05-01351-02

Abstract [Objective] To identify bacterial leaf spot disease caused by Pseudomonas syringae pv. syningae on Panax notoginsng. [Method] The tested materials were collected from Wenshan and Shilin County in Yunnan Province in 2011 and 2012， using Kochs rule， through morphology observation， pathogenicity test， 16S rDNA sequence analysis and biochemical and physiological characters， the identification was conducted. [Result] The pathogen was identified as Pseudomonas syringae pv. syringae according to the characters of cultural colonies， morphological observation， 16S rDNA sequences analysis and biochemical and physiological identification （Biolog carbon source utilization analysis）. [Conclusion] This was the first report of Pseudomonas syringae pv. syringae caused bacterial leaf spot of Panax notoginsng in China.

Key words Panax notoginsng； Pseudomonas syringae pv. syringae； Pathogens identification

三七（Panax notoginsng （Burk）F.H Chen）是我國(guó)的名貴中藥材，主產(chǎn)地為云南省文山縣，但長(zhǎng)達(dá)3年的生長(zhǎng)周期，使三七遭受了各類病蟲(chóng)害的侵染。目前文山三七主產(chǎn)區(qū)主要病害有軟腐病、圓斑病、細(xì)菌性青枯病、疫霉病、灰霉病[1-2]、根結(jié)線蟲(chóng)病[3]等。2011年8月及2012年7月，筆者先后在云南省文山縣和石林縣的三七種植片區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種新的葉片病害——三七細(xì)菌性葉斑病暴發(fā)，且影響程度越來(lái)越嚴(yán)重，大有蔓延流行的趨勢(shì)。這種病害在初期雖然只引起葉斑癥狀，但后期可引起葉片局部枯萎壞死和整株死亡。目前國(guó)內(nèi)并無(wú)關(guān)于三七細(xì)菌性葉斑病詳細(xì)鑒定的相關(guān)研究。為此，筆者從形態(tài)鑒定、致病性測(cè)定、16S rDNA序列分析及生理生化特性分析對(duì)引起三七細(xì)菌性葉斑病的病原菌進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，以期為提高三七的品質(zhì)、產(chǎn)量及病害防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為SQYB12（云南文山）和SQYB13（云南石林）；供試三七植株采自云南省文山縣和石林縣的三七種植區(qū)；供試培養(yǎng)基、試劑及儀器參照周麗洪等人研究[4]。

1.2 方法

1.2.1

標(biāo)樣采集。2011年8月與2012年7月分別從云南省文山縣和石林縣的三七種植基地采集具典型細(xì)菌性葉斑病癥狀的三七標(biāo)本。

1.2.2

分離培養(yǎng)及形態(tài)鑒定。

采用平板劃線分離，具體操作參照王敏等人研究[5]。純化保存方法參照白學(xué)慧等人研究[6]。兩次分離共獲得8株細(xì)菌菌株，編號(hào)分別為SQYB11、SQYB12、SQYB13、SQYB14、SQYB15、SQYB16、SQYB17、SQYB18。該試驗(yàn)采用的菌株為SQYB12及SQYB13。病原菌形態(tài)鑒定方法參照王永吉等人研究[7]。

1.2.3

致病性測(cè)定。致病性測(cè)定采用噴霧接種法接種，具體步驟參照姬廣海等人研究[8]。對(duì)照三七噴霧接種無(wú)菌水。待癥狀出現(xiàn)后，采集病斑重新分離。

1.2.4

生理生化鑒定。

生理生化測(cè)定試驗(yàn)采用Biolog公司的MicrostationTM V4.01系統(tǒng)和革蘭氏陰性菌微孔板（GN）來(lái)鑒定，具體鑒定方法參照吳亞鵬等的報(bào)道[9-11]。

1.2.5

16S rDNA序列同源性分析。細(xì)菌的基因組DNA提取采取細(xì)菌快速微量提取法進(jìn)行[12]，然后利用瓊脂糖電泳檢測(cè)提取DNA濃度和純度。16S rDNA的通用引物27F/1492R對(duì)SQYB12和SQYB13進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及程序參照劉娜等人研究[13]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，檢測(cè)擴(kuò)增后的目的條帶。用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，對(duì)SQYB12和SQYB13的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化克?。ㄔ噭┖匈?gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，純化克隆步驟均參照試劑盒）。將克隆后的大腸桿菌菌液送去測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序后將目的片段剪切下來(lái)，然后同時(shí)采用GenBank Blast以及DNAMAN進(jìn)行序列同源性比較[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀觀察及致病性測(cè)定

健康三七噴霧接種SQYB12和SQYB13 15 d后，三七葉片有輕微的發(fā)病癥狀，開(kāi)始出現(xiàn)淡綠色水漬小點(diǎn)。21 d后，葉片上的小斑點(diǎn)開(kāi)始聚集成棕色不規(guī)則大病斑，病斑直徑3～10 mm，周圍出現(xiàn)黃色退綠暈圈。30 d后，不規(guī)則大片病斑逐漸變褐，形成枯斑（圖1）。40 d 后三七葉片開(kāi)始失水萎蔫，甚至枯萎落葉。對(duì)照三七植物上始終未觀測(cè)到發(fā)病癥狀。

經(jīng)觀察，噴霧接種后各時(shí)期發(fā)病癥狀均與三七細(xì)菌性葉斑病自然發(fā)病癥狀相似。葉斑初期常見(jiàn)于葉緣，常引起葉片退綠并形成褐色病斑。濕度高時(shí)，發(fā)病情況加重且侵染速度加速。發(fā)病后再分離出的3株菌株分別命名為SQYB21、SQYB22、SQYB23。

3 結(jié)論與討論

綜合病害癥狀觀察和病菌分離、病菌形態(tài)觀察、病菌Biolog生理生化測(cè)定、16S rDNA序列分析等鑒定方法，可將引起三七細(xì)菌性葉斑病病原菌鑒定為丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv.syringae）[17-19]。該病害癥狀為發(fā)病初期葉片邊緣出現(xiàn)不規(guī)則病斑，病斑周圍有退綠黃色暈圈，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可引起全株枯萎。高溫高濕環(huán)境下，病害擴(kuò)展迅速，可在短期內(nèi)造成三七成片死亡。

從Biolog微生物鑒定系統(tǒng)顯示結(jié)果，以明確試驗(yàn)菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)各類碳氮源利用率的差異。標(biāo)準(zhǔn)菌株部分利用，但試驗(yàn)菌株可完全利用的碳源有乳果糖（B9）、D甘露醇（B11）；試驗(yàn)菌株部分利用，但標(biāo)準(zhǔn)菌株可完全利用的碳源有α-酮戊二酸（E4）、γ-氨基丁酸（G12）；試驗(yàn)菌株可部分利用，但標(biāo)準(zhǔn)菌株不能利用的碳源有L-亮氨酸（G3）、龍膽二糖（B5）。雖然了解了試驗(yàn)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)各類碳氮源利用率的差異，

但是造成這種差異的原因目前還不明確，筆者猜測(cè)是由于細(xì)菌的進(jìn)化和分化所造成的。另外，筆者將收集多個(gè)地區(qū)的三七細(xì)菌性葉斑病病原菌，對(duì)其致病力、生化型及致病型[20]進(jìn)行研究，以了解病菌的多樣性，同時(shí)利用repPCR分子指紋技術(shù)[21] 對(duì)病菌遺傳多樣性進(jìn)行分析。目前三七葉斑病菌的拮抗細(xì)菌菌株的篩選[19]試驗(yàn)工作已經(jīng)開(kāi)展，期望能達(dá)到預(yù)防和控制三七細(xì)菌性葉斑病利于三七產(chǎn)業(yè)的效果。

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