鄒麗婷　宋洪元

摘要 來源于鏈霉菌屬噬菌體（streptomyces phage）的phiC31定點(diǎn)重組酶系統(tǒng)可誘導(dǎo)重組位點(diǎn)attB（細(xì)菌基因組）和attP（噬菌體）之間DNA序列的重組，該重組酶是繼Cre/lox重組酶系統(tǒng)和FLP/frt重組酶系統(tǒng)之后的又一種新型位點(diǎn)重組酶系統(tǒng)，在原核和真核生物基因整合、刪除和倒位等方面得到廣泛應(yīng)用。文中主要對phiC31重組酶系統(tǒng)的來源、結(jié)構(gòu)特性以及在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為phiC31定點(diǎn)重組酶的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 phiC31重組酶系統(tǒng)；基因整合；基因刪除；基因倒位

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01298-04

Abstract phiC31 sitespecific recombination system that derived from Streptomyces phage can mediate recombination of the DNA sequences between the recognition sites of attB site （from bacterial genome） and attP site （from phage）， which is one of new type sitespecific recombinant system discovered after Cre/lox recombinant system and FLP/frt reorganization system， which has been widely used in gene integration， gene elimination and DNA inversion in prokaryotic and eukaryotic organism. This review described the origin， structural characteristics of the phiC31 sitespecific recombinant system and its applications in plant transgenic research.

Key words phiC31 sitespecific recombination system； Gene integration； Gene elimination； Gene inversion

位點(diǎn)特異重組酶系統(tǒng)（site-specific recombination system）是由單個(gè)多肽酶識別特定的DNA序列而發(fā)生重組的遺傳操作系統(tǒng)。整個(gè)系統(tǒng)主要由2個(gè)部分構(gòu)成：重組酶和特異性識別位點(diǎn)。重組酶僅能催化特異性位點(diǎn)間的重組，不能催化其他任何2條同源或非同源序列之間的重組，重組具有高度的特異性和保守性。在生物體內(nèi)或者離體細(xì)胞中，位點(diǎn)重組酶均能誘導(dǎo)特定識別位點(diǎn)之間的基因序列發(fā)生高效、精確的重組反應(yīng)，獲得穩(wěn)定的重組產(chǎn)物[1]。根據(jù)重組酶特異識別位點(diǎn)在染色體上的位置以及兩個(gè)識別序列的排列方向，重組發(fā)生后可產(chǎn)生以下3種結(jié)果：①當(dāng)重組識別位點(diǎn)位于不同的染色體上時(shí)，重組導(dǎo)致2條染色體發(fā)生易位、交換；②當(dāng)重組識別位點(diǎn)位于同一染色體上且排列方向一致時(shí)，識別位點(diǎn)之間的DNA序列被刪除；③當(dāng)重組識別位點(diǎn)位于同一染色體上且排列方向相反時(shí)，重組后導(dǎo)致識別位點(diǎn)間DNA序列發(fā)生倒位[2]（圖1）。目前，來自Pl噬菌體Cre/lox [3]、酵母2μ質(zhì)粒FLP/frt[4]和鏈霉菌屬噬菌體phiC31[5]等重組酶系統(tǒng)的重組功能已在原核生物、動(dòng)物、植物等多種生物體中得到了驗(yàn)證。

根據(jù)重組酶氨基酸的同源性以及催化產(chǎn)物的生化特性，重組酶分為酪氨酸重組酶（tyrosine recombinase）和絲氨酸重組酶（serine recombinase）2大類。其中，酪氨酸重組酶又稱為“λ重組酶”家族，在酪氨酸重組酶的催化結(jié)構(gòu)域中，都有一個(gè)保守的酪氨酸殘基負(fù)責(zé)攻擊核苷酸骨架結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)單鏈斷裂切口，產(chǎn)生5-OH末端和3-磷酸基-絡(luò)氨酸的切割中間體，類似于同源重組中產(chǎn)生的Holliday模型[6]。Cre/lox和FLP/frt重組酶系統(tǒng)是該家族中具有代表性的2個(gè)成員。絲氨酸重組酶具有更為保守的催化結(jié)構(gòu)域，其近N端為活性區(qū)域，包含一個(gè)絲氨酸，該絲氨酸殘基攻擊DNA骨架使其交錯(cuò)切割，形成3-OH的雙鏈斷裂末端，而5-磷酸基與重組酶共價(jià)鍵連接形成聯(lián)會(huì)中間體，隨后發(fā)生翻轉(zhuǎn)再重新連接，該重組過程類似于雙鏈斷裂重組模型（double-stand breakage）[7]。文中主要介紹的phiC31重組系統(tǒng)即是來源于該類家族中分子量較大的大型絲氨酸重組酶的亞家族[8]。

1 噬菌體phiC31重組酶重組特點(diǎn)

噬菌體phiC31重組酶由613個(gè)氨基酸構(gòu)成，能夠識別來自噬菌體自身的attP（39 bp）位點(diǎn)和來自細(xì)菌基因組的attB（34 bp）位點(diǎn)。attP和attB識別位點(diǎn)均具有7 bp的核心序列（crossover site）及位于其核心序列兩側(cè)7 bp的反向重復(fù)序列（inverted repeats）（attP中稱C、C′，attB中稱B、B′）。其中的attP位點(diǎn)還包含臂型結(jié)合位點(diǎn)（arm-type sites，分別為P1、P2、P′1、P′2和P′3）。重組過程中，上述結(jié)合位點(diǎn)均參與phiC31重組酶的結(jié)合。此外，還包括3個(gè)宿主因子（Integration host factor，IHF；分別為H1、H2和H′）、3個(gè)解離酶（excisionase， Xis）結(jié)合位點(diǎn)以及1個(gè)輔助因子（factor for invertion stimulation， Fis）結(jié)合位點(diǎn)[9]。上述復(fù)雜的phiC31重組酶識別序列組成，保證了phiC31重組酶介導(dǎo)重組反應(yīng)的精確進(jìn)行。在Cre/lox系統(tǒng)和FLP/frt系統(tǒng)中，重組酶識別位點(diǎn)除了核心序列（8 bp）和兩側(cè)完全對稱的反向重復(fù)序列外，沒有其他任何輔助因子的結(jié)合位點(diǎn)，且重組反應(yīng)發(fā)生前后識別位點(diǎn)基因序列不會(huì)發(fā)生改變，由于生物體內(nèi)時(shí)刻進(jìn)行著分子間的相互作用，在相應(yīng)重組酶存在的條件下，重組反應(yīng)會(huì)向著刪除和整合2個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，即Cre/lox系統(tǒng)和FLP/frt系統(tǒng)所誘導(dǎo)的重組反應(yīng)是可逆的。通過對Cre/lox系統(tǒng)中識別位點(diǎn)的改造，Albert等設(shè)計(jì)了縮短的loxP位點(diǎn)，有效降低了逆向重組反應(yīng)的進(jìn)行，但同時(shí)其正向重組效率也被大大降低[10]。而phiC31重組酶體系，不僅對酶底物DNA的核心序列同源性要求十分嚴(yán)格，且識別位點(diǎn)attP與attB自身即為結(jié)構(gòu)具有差異的結(jié)合位點(diǎn)，重組發(fā)生后產(chǎn)生phiC31重組酶不能識別的attR和attL序列，從而嚴(yán)格控制重組反應(yīng)的單方向進(jìn)行[11]。

2 噬菌體phiC31重組酶系統(tǒng)在植物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

2.1 噬菌體phiC31重組酶介導(dǎo)的基因定點(diǎn)整合

從20世紀(jì)80年代以來，人類成功實(shí)現(xiàn)外源目的基因?qū)胫参锛?xì)胞基因組中并穩(wěn)定表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)，在世界范圍25個(gè)國家生產(chǎn)出13 400萬t的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品[12]。研究表明，外源基因的插入位點(diǎn)會(huì)影響目的基因表達(dá)的水平以及表達(dá)的穩(wěn)定性，即所謂的位置效應(yīng)。因此研究者在如何將外源基因精確導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中以及解決基因沉默等問題上進(jìn)行了深入的探索與研究。在植物基因工程操作中，利用位點(diǎn)重組酶系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)外源基因的精確、單拷貝的插入[10]。

目前，基于重組酶介導(dǎo)的特定位點(diǎn)間的重組反應(yīng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在外源DNA整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和高等植物細(xì)胞核基因組中[13-14]。Vergunst等最早利用Cre/lox重組酶系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了將T-DNA整合到擬南芥染色體上預(yù)期位置。首先獲得一個(gè)35S-loxP-Cre目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株（Target line），該植株表達(dá)Cre重組酶。隨后2次轉(zhuǎn)化的整合載體T-DNA含一個(gè)loxP –NPTII- loxP結(jié)構(gòu)，在Cre重組酶參與下發(fā)生位點(diǎn)間的重組，整合載體中的loxP-NPTII- loxP替換位于Target line中35S啟動(dòng)子下游的Cre基因表達(dá)盒，NPTII基因上游獲得35S啟動(dòng)子而得到表達(dá)，成功整合的個(gè)體獲得對卡拉霉素的抗性[15]。然而，基于Target line 上單一的識別位點(diǎn)的基因整合將導(dǎo)致2次轉(zhuǎn)化載體上的非目標(biāo)序列的同時(shí)整合。Louwerse 等利用loxP和改造的lox5171識別位點(diǎn)，在Cre重組酶的參與下實(shí)現(xiàn)兩位點(diǎn)間表達(dá)盒的交換，即RMCE（recombinase-mediated cassette exchage）[16]。將Bar基因表達(dá)盒置于2個(gè)反向排列的loxP和lox5171位點(diǎn)之間，并置于35S啟動(dòng)子的下游轉(zhuǎn)化擬南芥后獲得Target line。上游缺少啟動(dòng)子的NPTII編碼框被同樣置于2個(gè)反向排列的loxP和lox5171位點(diǎn)之間2次轉(zhuǎn)化Target line，Cre介導(dǎo)RMCE后，NPTII基因取代Target line中的Bar基因，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，盒交換發(fā)生的植株將被優(yōu)先篩選，從而在擬南芥中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的RMCE。

相對上述Cre/lox重組系統(tǒng)，phiC31重組酶系統(tǒng)具有的單向重組特點(diǎn)，在基因定點(diǎn)整合和RMCE中的應(yīng)用具有更好的前景。Lutz等將phiC31重組酶系統(tǒng)與Cre/lox重組酶系統(tǒng)相結(jié)合將目標(biāo)基因精確整合到煙草葉綠體基因組中[17]。在該項(xiàng)研究中，首先將一個(gè)attB位點(diǎn)以及位于loxP位點(diǎn)之間的壯觀霉素抗性基因aadA通過基因槍轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入煙草葉綠體，然后將Cre重組酶基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入上述植株，Cre重組酶表達(dá)后，刪除了位于loxP位點(diǎn)間的aadA標(biāo)記基因，獲得葉綠體基因組不含aadA篩選標(biāo)記基因的但具有attB/loxP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，該植株隨后被導(dǎo)入重組酶phiC31基因。構(gòu)建含有attP位點(diǎn)并與卡那霉素抗性基因neo連鎖質(zhì)粒載體，基因槍轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入上述植株。結(jié)果從轉(zhuǎn)化的45個(gè)葉片中獲得237株對卡那霉素具有抗性的獨(dú)立株系；對其中113株進(jìn)行檢測，在81株中檢測到與attP位點(diǎn)連鎖的neo基因被整合到受體植株葉綠體基因組的attB位點(diǎn)處，整合效率大約為72%。另外，在煙草細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)phiC31重組酶，也成功將壯觀霉素抗性基因aadA和除草劑抗性基因Bar整合到煙草質(zhì)體基因組中，實(shí)現(xiàn)了重組酶基因在植物體胞質(zhì)內(nèi)的瞬時(shí)表達(dá)并誘導(dǎo)重組反應(yīng)的進(jìn)行。近來，結(jié)合Cre/lox系統(tǒng)刪除功能和phiC31重組系統(tǒng)的單向整合功能，De Paepe等發(fā)展了一種可重復(fù)位點(diǎn)整合系統(tǒng)（Iterative site-specific integration system，ISSI），利用該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)基因順次整合到基因組上同一位點(diǎn)，達(dá)到基因聚合（Gene stacking）的目的[18]。

2.2 噬菌體phiC31重組系統(tǒng)介導(dǎo)的基因刪除

植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，篩選標(biāo)記基因是為了篩選到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株而插入到質(zhì)粒載體中的一段編碼對某種抗生素、除草劑具有抗性的基因序列。轉(zhuǎn)基因植株中含有篩選標(biāo)記基因可能會(huì)給環(huán)境帶來生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)以及引發(fā)食品安全問題[19]。同時(shí)為了獲得具有多個(gè)優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植株，通常需要進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化，每一個(gè)目的基因的導(dǎo)入都與一個(gè)篩選標(biāo)記基因連鎖，操作過程中不僅受到標(biāo)記基因數(shù)量的限制，而且隨著篩選基因在基因組中的不斷堆積會(huì)加大基因沉默的幾率，為此有必要對轉(zhuǎn)基因植物所攜帶的篩選標(biāo)記基因進(jìn)行刪除。

目前，常見刪除篩選標(biāo)記基因的方法主要有以下3種：①利用Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因刪除[20]；②將標(biāo)記基因和目的基因以共轉(zhuǎn)化的途徑導(dǎo)入受體植株中，經(jīng)過后代的基因分離獲得無篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株[21]；③利用位點(diǎn)重組系統(tǒng)刪除篩選標(biāo)記基因[22]。Cre/loxP位點(diǎn)重組酶系統(tǒng)在無篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物中應(yīng)用最為廣泛[23]。但由于生物基因組中往往具有假lox位點(diǎn)，在Cre重組酶存在的情況下會(huì)導(dǎo)致重復(fù)序列間基因組的缺失、重排[24]；另外，由于Cre酶存在的情況下可誘導(dǎo)反應(yīng)的逆向進(jìn)行，即刪除與整合反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；同時(shí)刪除不徹底現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生嵌合體現(xiàn)象[25]。近年來，phiC31重組系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于植物質(zhì)體、細(xì)胞核目的基因的刪除。Kittiwongwattana等利用phiC31重組酶系統(tǒng)，成功將位于煙草葉綠體基因組中的篩選標(biāo)記基因刪除[26]。先將位于同向排列的attP、attB識別位點(diǎn)之間的壯觀霉素抗性基因aadA通過基因槍轉(zhuǎn)化插入煙草葉綠體基因組，隨后表達(dá)phiC31重組酶基因的質(zhì)粒載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的2次轉(zhuǎn)化導(dǎo)入上述植株，在獲得的32株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株中，29株轉(zhuǎn)基因植株中的篩選標(biāo)記基因aadA被完全刪除，3株表現(xiàn)為刪除不完全，而刪除不徹底的原因可能是這些植株中相應(yīng)的phiC31重組酶表達(dá)量太低所導(dǎo)致。

phiC31重組酶的刪除功能除了可被用于刪除位于重組位點(diǎn)間篩選標(biāo)記基因以外，還可以用來刪除阻礙基因表達(dá)的片段，從而啟動(dòng)下游目的基因的表達(dá)。Thomson等將760 bp大小的non-coding stuffer序列置于2個(gè)同向排列的attP、attB位點(diǎn)之間，形成attP-non-coding stuffer-attB結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)上游為一個(gè)35S啟動(dòng)子，下游為gusA基因編碼區(qū)域[27]。該載體轉(zhuǎn)化擬南芥后gusA基因不表達(dá)。通過2次轉(zhuǎn)化或雜交導(dǎo)入phiC31重組酶基因，attP、attB位點(diǎn)之間的non-coding stuffer序列被刪除，激活了下游gusA基因的表達(dá)。Kapusi等用類似的方法，將GFP基因及下游的終止子置于同向排列的attB，attP位點(diǎn)之間，GFP基因上游為Pact啟動(dòng)子，下游則是GUS基因及終止子[28]。該載體轉(zhuǎn)化大麥后獲得正常表達(dá)GFP但不表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)基因植株。該植株與表達(dá)phiC31重組酶植株雜交后，位于attB，attP位點(diǎn)之間的GFP-Tnos結(jié)構(gòu)被刪除，激活了下游GUS基因的表達(dá)，雜交F1代刪除效率達(dá)到25%。對196株自交F2代進(jìn)行PCR檢測，其中139株具有重組刪除位點(diǎn)（70%），基本符合雜合子的分離比例，即重組位點(diǎn)會(huì)隨著植株的有性繁殖穩(wěn)定遺傳到下一代。

利用phiC31重組酶介導(dǎo)的基因刪除，也可實(shí)現(xiàn)目的基因等位基因的構(gòu)建。Gils等首先利用phiC31重組系統(tǒng)結(jié)合內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)和功能重建在擬南芥中構(gòu)建了“雙組分”雄性不育系統(tǒng)[29]。將Barnase和ALS基因拆分為無活性的N和C端多肽后分別與來自集胞藻的DnaB和DnaE內(nèi)含肽N端和C端融合獲得Bar-N：：DnaB-N、DnaB-C：：Bar-C、ALS-N：：DnaE-N和DnaE-C：：ALS -C 4個(gè)融合基因。植物表達(dá)載體上同向排列重組位點(diǎn)attP1-attB1-attB2-attP2。將Bar-N：：DnaB-N和ALS-N：：DnaE-N表達(dá)盒置于attP1-attB1之間；DnaB-C：：Bar-C和DnaE-C：：ALS-C表達(dá)盒置于attB2-attP2之間。該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥后，在內(nèi)含子的剪切作用下重建完整的不育基因barnase以及除草劑抗性基因ALS，獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥為雄性不育并抗除草劑。而表達(dá)重組酶phiC31的植株與其雜交后會(huì)發(fā)生attP-attB位點(diǎn)之間的重組刪除反應(yīng)。發(fā)生在attP1與attB1 或attB2之間的刪除會(huì)產(chǎn)生含DnaB-C：：Bar-C和DnaE-C：：ALS -C表達(dá)盒的A1系；發(fā)生在attP2與attB1或attB2之間的刪除會(huì)產(chǎn)生含Bar-N：：DnaB-N和ALS-N：：DnaE-N表達(dá)盒的A2系。產(chǎn)生的A1系和A2系中的轉(zhuǎn)基因元件位于染色體上同一位置，為等位基因。分別自交后獲得可育純系A(chǔ)1A1和A2A2。而兩者雜交后獲得的A1A2在內(nèi)含肽的反式剪切下生成完整的barnase和ALS，表現(xiàn)雄性不育和抗除草劑。將A1A2不育系作為母本與非轉(zhuǎn)基因植株雜交，A1和A2等位基因發(fā)生分離，因此F1代均為可育植株。隨后，Kempe等在單子葉植物小麥中也實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)目標(biāo)基因互為等位基因的構(gòu)建[30]。

2.3 噬菌體phiC31重組系統(tǒng)介導(dǎo)的基因倒位

phiC31重組酶系統(tǒng)中，當(dāng)重組識別位點(diǎn)attP、attB位于同一染色體上，并反向排列時(shí)，重組酶可介導(dǎo)位于識別位點(diǎn)之間的基因序列發(fā)生倒位。將控制乳糖操縱子原件lacZpo的啟動(dòng)子Plac與λ噬菌體終止子nutL位點(diǎn)串聯(lián)置于反向排列的重組位點(diǎn)attP和attB之間，將galK目的基因與一個(gè)強(qiáng)終止子和N基因連鎖，由于插入方向與啟動(dòng)子方向相反，在沒有重組酶參與的環(huán)境下目的基因處于“關(guān)閉”的狀態(tài)；而將攜帶有熱敏系統(tǒng)調(diào)控的重組酶基因phiC31的噬菌體侵染含上述質(zhì)粒大腸桿菌D1210（cI857Int-xis+）獲得溶源性細(xì)菌，42 ℃熱激處理后的菌體中檢測到galK基因的大量表達(dá)，即在大腸桿菌內(nèi)重組酶基因的瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)了位點(diǎn)間啟動(dòng)子的倒位，目的基因“打開”[31]。除了將啟動(dòng)子位于重組位點(diǎn)之間控制目標(biāo)基因的表達(dá)外，還可以通過固定啟動(dòng)子方向而將目的基因插入反向排列的重組位點(diǎn)間，重組酶誘導(dǎo)下使結(jié)合位點(diǎn)間的目的基因序列發(fā)生倒位[32]。

Thomson等在真核生物酵母細(xì)胞中驗(yàn)證了phiC31重組系統(tǒng)的倒位功能，通過對Cre、CinH、ParA、Tn1727、Tn5053、phiC31、TP9011、Bxb1和U153等重組系統(tǒng)倒位效率的比較，發(fā)現(xiàn)phiC31重組酶介導(dǎo)下的基因倒位效率為100%，而Cre重組酶誘導(dǎo)的倒位效率僅為phiC31重組酶誘導(dǎo)的1/2，產(chǎn)生這種現(xiàn)象是因?yàn)镃re誘導(dǎo)的重組反應(yīng)是可逆的[33]。2008年，Rubtsova等在小麥中驗(yàn)證了phiC31重組系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA序列倒位功能[34]。將一個(gè)與小麥wheat dwarf virus （WDV）病毒復(fù)制相關(guān)的元件Rep5置于反向排列的attB和attP識別位點(diǎn)之間，phiC31重組酶介導(dǎo)的Rep5倒位激活了WDV病毒的復(fù)制功能，導(dǎo)致報(bào)告基因GFP的表達(dá)。

3 小結(jié)與展望

在眾多的重組酶系統(tǒng)中，phiC31重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)重組反應(yīng)的精確性、高效性以及穩(wěn)定性的特點(diǎn)為其在植物基因工程研究中的廣泛應(yīng)用提供了良好的前景。從目前的研究成果來看，phiC31重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的基因整合及基因刪除功能已在多種植物中得到驗(yàn)證，而其介導(dǎo)的基因倒位功能在植物基因工程操作中還鮮有報(bào)道。因此，利用phiC31重組酶介導(dǎo)的倒位功能設(shè)計(jì)“基因開關(guān)”，phiC31重組酶系統(tǒng)與其他類型重組系統(tǒng)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物外源基因的精確調(diào)控將是未來的重點(diǎn)研究方向之一。

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