何錫忠　李春華　潘潔　張婉華　彭麗英　倪建平　張春玲　蔣鳳英　徐偉林

摘 要：通過生物反應(yīng)器制備豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV），研究了感染復(fù)數(shù)（MOI）、微載體濃度、病毒感染時間（TOI）和病毒維持液對病毒效價的影響，結(jié)果表明，分別以1：500稀釋種毒（8.0 LgTCID50/mL）后接種、接種72 h的ST細胞、5 mg/mL微載體濃度和維持液低糖DMEM+0.2 %水解乳蛋白（LH）的參數(shù)培養(yǎng)方式效果最為理想。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒；參數(shù)；ST細胞；生物反應(yīng)器

中圖分類號：S852.65 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）06-0048-03

豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）是豬的一種高度接觸傳染性腸道疾病，以引起2周齡以下仔豬嘔吐、嚴重腹瀉和高死亡率（通常100 %）為特征[1]。目前，國內(nèi)一般采用克氏瓶或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)ST細胞生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎（TGE）疫苗，存在勞動強度大、病毒毒價低和疫苗質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點。應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)貼壁細胞具有高比表面積、細胞產(chǎn)量高，便于監(jiān)測、控制和取樣，生產(chǎn)規(guī)模容易放大，不易染菌等優(yōu)點。生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞繁殖狂犬病病毒，病毒最大滴度能達到1.38×108 pfu/mL[2，3]，應(yīng)用激流式生物反應(yīng)器可以實現(xiàn)HP-PRRSV抗原的高滴度生產(chǎn)[4]，且生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量達到WHO要求。為此，本文對生物反應(yīng)器系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)ST細胞制備豬傳染性胃腸炎病毒進行研究，以探討利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)ST細胞生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎病毒的技術(shù)可行性，為進一步優(yōu)化培養(yǎng)過程和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和培養(yǎng)基

豬睪丸（ST）細胞由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所研發(fā)中心提供；培養(yǎng)基為含100 mL/L新生牛血清（Hyclone公司）的DMEM（GIBCO公司）；病毒繁殖培養(yǎng)基為含2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM（LG-DMEM）、MEM和高糖DMEM（HG-DMEM）。

1.1.2 病毒

TGEV由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所研發(fā)中心分離、鑒定和保存。

1.1.3 微載體（Cytodex TM 3）

購自Amersham pharmacia Biotch AB公司；CT-3微載體，經(jīng)無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液浸泡，121 ℃高壓滅菌30 min，再浸泡在含100 mL/L新生牛血清的DMEM的培養(yǎng)基中，置37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱過夜，待用。

1.1.4 生物反應(yīng)器

1.5L CelliGen生物反應(yīng)器（New Brunswick Scientific Co. LTD USA公司），工作體積1.2 L，溶氧（DO）和pH由壓縮Air、O2、N2和CO2 4種氣體控制，籠式攪拌槳由磁力驅(qū)動器驅(qū)動。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

適量T-50方瓶ST細胞，長滿單層時，先用含 0.2 g/L EDTA的PBS液清洗3次，再加入含2.5 g/L胰酶消化片刻，傾去胰酶，加含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打備用。安裝好反應(yīng)器和管路后，分別用pH值為4.00和6.86的標準pH溶液在25 ℃下標定pH 電極。在罐內(nèi)加入PBS液，121 ℃高壓滅菌。冷卻后安裝到反應(yīng)器控制系統(tǒng)上，連接好壓縮Air、O2、N2和CO2 4種氣體管線，校正DO電極后，將罐內(nèi)PBS液壓出，工作體積為1.2 L，加入不同濃度的微載體和細胞 于1.5 L生物反應(yīng)器中，控制DO為40 %空氣飽和度，攪拌速度為55 r/min，溫度為37 ℃，pH值為7.2，進行培養(yǎng)。

1.2.2 TGEV病毒培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化

TGEV在不同參數(shù)下的病毒效價情況進行優(yōu)化比較。

在感染時間（TOI）為72 h細胞、微載體濃度為 5 mg/mL、接種細胞密度為2.64×105 個/mL和維持液含 2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM條件下，比較不同感染復(fù)數(shù)（MOI）[1：100、1：500和1：5 000稀釋的病毒原液（8.0 LgTCID50/mL）]對TGEV增殖的影響。

TOI為72 h細胞、接種細胞密度為2.64×105 個/mL、MOI以1：500稀釋的病毒液和維持液含2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM條件下，比較不同微載體濃度 （3 mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL）對TGEV增殖的影響。

接種細胞密度為2.64×105個/mL、在微載體濃度 為5 mg/mL、MOI以1：500稀釋的病毒液和維持液含2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM條件下，比較不同TOI（48、72和96 h）對TGEV增殖的影響。

在微載體濃度為5 mg/mL、MOI以1：500稀釋的病毒液、TOI為72 h細胞，比較不同病毒維持液（MEM、HG-DMEM和LG-DMEM）對TGEV增殖的影響。

1.2.3 TGEV病毒TCID50的測定

采用96孔板測定TCID50，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

2 結(jié)果

2.1 MOI對TGEV增殖的影響

病毒100和500倍稀釋后接種ST細胞病毒效價均為11.5LgTCID50/mL，而病毒5 000倍稀釋后接種產(chǎn)生的病毒效價僅為9.0LgTCID50/mL（表1），可見MOI較高時，24 h時間內(nèi)微載體上幾乎所有細胞被病毒粒子感染，病毒效價的峰值出現(xiàn)得早且高；MOI較低時，病毒效價的峰值出現(xiàn)得晚且低。

2.2 微載體濃度對TGEV增殖的影響

不同微載體濃度對TGEV增殖影響的試驗結(jié)果見 表2。從理論上講微載體濃度越高細胞密度越大，繁殖TGEV的介質(zhì)就越多，TGEV的效價就越高。但5 mg/mL和10 mg/mL微載體濃度所對應(yīng)TGEV效價無顯著影響。 3 mg/mL微載體濃度時TGEV效價略低為9.0 LgTCID50/mL。

2.3 TOI對TGEV病毒增殖的影響

由上表3可知，分別在細胞培養(yǎng)后第48、72 和96 h接種病毒，其所對應(yīng)的最高病毒滴度分別為10.5、11.5和9.0 LgTCID50/mL。這可能是與細胞的生理狀態(tài)有關(guān)，由于TGEV的病毒復(fù)制較快且容易失活，盡可能確保細胞同步感染和病毒同步復(fù)制，使單位細胞產(chǎn)量在較短時間內(nèi)達到最高。

2.4 維持液體對TGEV病毒增殖的影響

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對TGEV病毒增殖的影響見表4。在各種培養(yǎng)基中，以DMEM為病毒維持液的病毒效價較高；低糖DMEM添加20 mL/L小牛血清后作為維持液產(chǎn)生的病毒效價略低，而添加2 g/L水解乳蛋白產(chǎn)生的病毒效價最高，為11.0 LgTCID50/mL。

3 討論

3.1 MOI大小決定著每個宿主細胞被病毒感染的機會，直接影響著細胞失活速率或接毒后細胞的生長情況，同時也決定著病毒對細胞的感染方式[5]。MOI較高時，每個細胞被病毒感染的機會高，且以同步感染的方式進行，24 h時間內(nèi)病毒效價的峰值出現(xiàn)得早且高；MOI較低時，造成細胞發(fā)生二次感染，病毒繁殖不同步，病毒效價的峰值出現(xiàn)得晚且低。因此，對于復(fù)制較快且容易失活的TGEV，宜采用高MOI接種，盡可能確保細胞同步感染，使病毒產(chǎn)量在一定時間內(nèi)達到最大，以縮短生產(chǎn)周期。為了確保生產(chǎn)過程中病毒效價，應(yīng)選擇1：500稀釋種毒后接種ST細胞生產(chǎn)TGEV。

3.2微載體濃度越高，細胞生長期越長，采用10 mg/mL微載體培養(yǎng)達到最高細胞密度所需要的天數(shù)長，高濃度微載體的表面積未能充分被利用。為了更快更經(jīng)濟地獲得較高密度的健康細胞，在大規(guī)模培養(yǎng)ST細胞時，應(yīng)選擇5 mg/mL的微載體濃度。

3.3 細胞活力參數(shù)P可以用來衡量細胞生理狀況，P值越大，細胞生理狀況越好；反之P值越小，細胞生理狀況越差[6]。隨著細胞培養(yǎng)時間增加，細胞活力參數(shù)P越小，由于TGEV的病毒復(fù)制較快且容易失活，盡可能確保細胞同步感染和病毒同步復(fù)制，使單位細胞產(chǎn)量在較短時間內(nèi)達到最高，因此確定生產(chǎn)過程中TOI以接種72 h的ST細胞為宜。

3.4 DMEM中豐富的維生素、氨基酸對病毒毒價的提高有一定的幫助。補充血清反而使病毒毒價降低，這是因為血清中含有抑制病毒復(fù)制的成分。水解乳蛋白（LH）也含有分豐富的氨基酸和維生素等物質(zhì)有利于病毒繁殖，同時由于水解乳蛋白價格稍便宜且成分較血清簡單，制備疫苗后可降低過敏反應(yīng)風險。因此，疫苗生產(chǎn)工藝中病毒維持液可選用含2 g/L LH的無血清低糖DMEM培養(yǎng)基。

試驗結(jié)果表明，通過優(yōu)化工藝參數(shù)可以促進TGEV在ST細胞中的繁殖；采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)TGEV對于提高病毒效價和節(jié)約生產(chǎn)成本是可行的，為病毒的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)?！酢?/p>

參考文獻略：（6篇，略）