孟 超，李寶臣，葉曼曼，周 飛，李肖梁，方維煥

(1.浙江大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，浙江杭州310058;2.浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司;3.寧波大學(xué))

鴨傳染性漿膜炎，又稱鴨疫里默氏桿菌病，是由鴨疫里默氏桿菌(RA)引起，危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疫病之一。1932年，美國學(xué)者Hendrickson 和Hilbert首次報(bào)道該病［1］，1936年，美國伊利諾斯州的一個商品鴨場發(fā)生該病，曾被稱為“鴨敗血癥”，Dougherty(1955)［2］等，經(jīng)全面病理學(xué)研究后，將該病命名為“傳染性漿膜炎”。Leibovitz(1972)［3］提議使用“鴨疫里默氏桿菌感染”名稱。

我國自1982年郭玉璞(1982)［4］等從北京郊區(qū)鴨場首次分離到鴨疫里默氏桿菌以來，所有養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎均有該病的發(fā)生，鴨、鵝及火雞等多種禽類易感，是一種接觸性傳染病，多呈急性或慢性敗血癥過程，以纖維素性肝周炎、心包炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎為主要特征，傳播速度快，死亡率較高，對抗生素的耐藥性不斷增加，疫苗免疫是控制該病的有效方法之一。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 鴨疫里氏桿菌血清1 型SG4 株和血清2 型ZZY7 株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供;鴨傳染性漿膜炎二價滅活疫苗(1 型SG4 株+2 型ZZY7 株)由浙江某生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供，批次分別為201305、201306 和201307。

試驗(yàn)動物為3日齡雛鴨，由紹興某種鴨場提供，品種為紹興麻鴨。

試驗(yàn)在杭州某生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2 安全性檢驗(yàn) 選取3日齡玻板凝集試驗(yàn)為RA血清抗體陰性的雛鴨，免疫劑量為每羽0.25 mL 和0.5 mL，每一劑量組各免疫雛鴨30 羽，免疫途徑為頸部皮下注射。30 羽作為空白對照，相同條件下飼養(yǎng)觀察35 d。

每日觀察供試鴨精神、采食、糞便及臨床變化;每周分別撲殺5 羽，觀察接種部位的吸收情況及其他異常狀況。

1.3 攻毒效果試驗(yàn) 主要通過免疫攻毒方法進(jìn)行，每批次疫苗選取3日齡玻板凝集試驗(yàn)為RA 血清抗體陰性的雛鴨50 羽，隨機(jī)分為5 組，每組10 羽。其中兩組為免疫組，免疫劑量為0.25 mL/羽;另兩組為未免疫攻毒對照組，第五組為不免疫和攻毒對照組。

免疫途徑為頸部皮下注射，動物隔離器內(nèi)飼養(yǎng)觀察21 d。免疫組與未免疫攻毒組分別使用血清1型SG4 株和血清2 型ZZY7 株強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒，腿部肌內(nèi)注射1.0 ×1010CFU 的鴨疫里氏桿菌SG4 或1.0 ×105CFU 鴨疫里氏桿菌ZZY7 株菌液。攻毒后7 d 內(nèi)觀察發(fā)病和死亡情況。

1.4 微量凝集抗體檢測試驗(yàn) 將免疫后21 d 的供試鴨通過翅靜脈采血至1.5 mL 離心管內(nèi)，37℃溫箱中靜置1 h，然后8000 rpm 離心5 min，吸出析出血清，備用。將培養(yǎng)的鴨疫里默氏桿菌SG4 株和ZZY7 株菌液計(jì)數(shù)，然后用0.3%甲醛溶液滅活，再將滅活后的菌液5000 rpm 離心30 min。用生理鹽水離心洗滌3 次，最后一次菌懸液用生理鹽水調(diào)節(jié)至1.0 ×109CFU/mL，作為微量凝集抗體檢測試驗(yàn)用抗原。

試驗(yàn)步驟:將96 孔凝集板中加入50 μL 生理鹽水，再將第一孔加入50 μL 待檢血清，然后進(jìn)行倍比稀釋，直至212 次方。

每個血清樣品兩次稀釋，分別加入SG4 株和ZZY7 株抗原50 μL，混勻后密封，室溫條件靜置24 h 后觀察沉淀狀況。

1.5 無菌檢驗(yàn) 根據(jù)2010年版《中華人民共和國獸藥典》第三部所提供的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

將樣品量1 mL 接種含有50 mL 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h。然后將培養(yǎng)物移植至TG小管和GA 斜面(0.2 mL/支)，1 支在37℃培養(yǎng)，1支在25℃培養(yǎng)，另取1 支GP 0.2 mL/支，在25℃培養(yǎng)，觀察7 d，應(yīng)無菌生長。

1.6 劑型和黏度 劑型檢查主要確定劑型是油包水(O/W)或水包油(W/O)。方法是將疫苗乳劑先滴1 滴在水中，然后滴第2 滴，如果未出現(xiàn)擴(kuò)散，其劑型則為油包水劑型，若第2 滴出現(xiàn)擴(kuò)散則其劑型為水包油。

黏度檢測主要通過黏度計(jì)測定，其原理是將轉(zhuǎn)子浸入供試樣品溶液中，使轉(zhuǎn)子以一定的角速度旋轉(zhuǎn)，通過測量作用在轉(zhuǎn)子上的扭力矩，然后換算成黏度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 安全性檢驗(yàn) 詳見表1。

表1 三批鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗安全檢驗(yàn)結(jié)果

由表1可見，第5 周時，疫苗已基本吸收完全，僅殘留少量黃色干酪樣物。

2.2 體重變化 詳見表2。

表2 三批鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗安全檢驗(yàn)過程中的供試鴨體重變化

由表2可見，三批次疫苗免疫組鴨體重與未免疫組鴨體重未見明顯差異。

2.3 攻毒效果試驗(yàn) 詳見表3。

表3 三批鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗效力

由表3可見，血清1 型SG4 株為1 ×1010CFU/羽(復(fù)核后劑量為0.98 ×1010CFU/羽)，血清2 型ZZY7 株為1 ×105CFU/羽(復(fù)核后劑量為1.3 ×105CFU/羽)，腿部肌內(nèi)注射后觀察7 d，未免疫組鴨在攻毒后的死亡率達(dá)90%以上，免疫組所有供試鴨均未見死亡。

2.4 微量凝集抗體檢測結(jié)果 詳見表4。

表4 3 批次鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗免疫后凝集抗體檢測

由表4可見，免疫后21 d 血清凝集抗體檢測結(jié)果表明，SG4 株抗體效價均在7.7－8.5 log2 之間，顯著高于ZZY7 株抗體效價(3.0－3.4 log2)。三個批次疫苗間的抗體效價基本穩(wěn)定。

2.5 無菌檢驗(yàn) 將三批疫苗進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，菌檢結(jié)果均為陰性。

2.6 劑型、黏度和穩(wěn)定性檢驗(yàn) 將疫苗1 滴滴于水中，然后滴第2 滴，呈圓形，均未出現(xiàn)擴(kuò)散，說明該疫苗劑型屬油包水劑型(W/O)。

經(jīng)黏度計(jì)檢測三批疫苗的黏度值分別為48.5 cP、55.0 cP、53.5 cP。3000 rpm 離心15 min 后，劑型穩(wěn)定(不破乳)。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)經(jīng)過全項(xiàng)檢驗(yàn)，證明三個批次疫苗抗體效價基本穩(wěn)定，在使用安全性劑量免疫時，對3日齡雛鴨未見任何明顯影響，35 d 左右即可完全吸收，且經(jīng)過免疫后28 d 觀察，雛鴨體重增長情況處于正常水平。

馬遜(2010)［5］和王小蘭(2012)［6］等均將RA疫苗通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)得到良好保護(hù)，說明RA 有著良好的免疫原性。

本次攻毒效果試驗(yàn)結(jié)果表明，鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗能夠較好保護(hù)鴨疫里默氏桿菌血清1型和血清2 型的強(qiáng)毒攻擊，抗體效價基本穩(wěn)定。無菌檢驗(yàn)、黏度檢測、穩(wěn)定性和劑型檢測都處于良好水平。

綜合上述結(jié)果，表明浙江某生物技術(shù)有限公司試制的鴨疫里默氏桿菌二價滅活疫苗安全、穩(wěn)定、有效，具有良好的推廣應(yīng)用價值。

［1］鄭龍光.鴨傳染性漿膜炎的研究進(jìn)展［J］.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2012，6:57－58.

［2］Dougherty E，Saunders LZ，Parsons EH.The pathology of infectious serositis of ducks［J］.American Journal of Pathology，1955，31:475－487.

［3］Lebovitz L.A survey of the so-called ‘a(chǎn)natipestifer syndrome’［J］.Avian Diseases，1972，16:836－851.

［4］郭玉璞，陳德威，范國雄，等.北京鴨傳染性漿膜炎的調(diào)查研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1982，13(2):106－112.

［5］馬遜.鴨傳染性漿膜炎油乳劑滅活疫苗與不同佐劑二聯(lián)滅活疫苗的免疫原性比較研究［D］.成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010:18－23.

［6］王小蘭.鴨疫里默氏桿菌多價油乳劑滅活疫苗的研制［D］.上海:上海獸醫(yī)研所，2012:30－44.