李順福，胡恒康，張秋露，徐艷玲，張啟香

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

山核桃Carya cathayensis是果木兼用的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)樹種，主要分布在浙皖交界的天目山區(qū)[1]。目前，山核桃主要采用實(shí)生苗繁殖與嫁接繁殖。實(shí)生苗繁殖難以保持品種的優(yōu)良特性[2]。山核桃體細(xì)胞胚具有完整的兩極結(jié)構(gòu)，能一次再生形成完整植株[3]。因?yàn)樯a(chǎn)對良種苗木的需要，山核桃的離體繁殖技術(shù)已得到了較深入的研究[4]。表觀遺傳是指在DNA序列不改變的情況下發(fā)生的可遺傳的基因表達(dá)改變，DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種方式[5]，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶，不改變DNA一級結(jié)構(gòu)對基因序列進(jìn)行修飾而影響基因的表達(dá)，影響其功能，這種甲基修飾主要發(fā)生在CpG雙核甘酸序列的胞嘧啶上[6]。已有眾多證據(jù)表明：DNA甲基化參與了植物不同發(fā)育階段的生長調(diào)控[7]。研究發(fā)現(xiàn)，以山核桃幼胚為外植體進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，不同發(fā)育時(shí)期幼胚胚性感受態(tài)差異較大，其中自然授粉后8～10周可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈合組織，11～12周可從幼胚子葉表面直接誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚[8]。山核桃不同程度胚性感受態(tài)是否由于不同發(fā)育時(shí)期幼胚基因組表觀遺傳的變化引起，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，ISSR）DNA分子標(biāo)記技術(shù)對山核桃幼胚生長過程中DNA甲基化變化動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究，揭示山核桃幼胚發(fā)育過程中甲基化變化規(guī)律，以期對建立高效的山核桃體細(xì)胞胚發(fā)生體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

7月上旬于浙江省臨安市板橋鄉(xiāng)羅塘村采集自然授粉后9，10，11，12，13周的山核桃幼果（分別以樣本第9周，第10周，第11周，第12周，第13周代替）。將幼果帶回實(shí)驗(yàn)室中剪去花柱及柱頭，洗滌劑洗凈表面后，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇涮洗30 s，自來水沖洗干凈，于超凈工作臺上去除果皮和種皮后取出完整的幼胚，提取基因組DNA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山核桃幼胚DNA的提取 用改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取實(shí)驗(yàn)材料的基因組 DNA[9]。

1.2.2 哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的引物的篩選 用提取的不同時(shí)期培養(yǎng)的山核桃幼胚的一組DNA為模版，所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)網(wǎng)站公布的第9套ISSR引物序列，對100個(gè)引物進(jìn)行篩選，選取擴(kuò)增條帶多而清晰、分離度高的引物。本實(shí)驗(yàn)共篩選出共17個(gè)引物，分別是：UBC808， 809， 815， 816， 817， 822，825， 827， 830， 834， 840， 855， 858，862，867，888，889。17個(gè)引物序列如表1。

1.2.3 DNA酶切 取5個(gè)不同時(shí)期培養(yǎng)得幼胚DNA樣品，分別用HapⅡ和MSPⅠ等2種酶切，反應(yīng)體系為30 μL，所用DNA質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，為了使酶切完全，加入3倍完全酶切的用量，酶切過夜后在65℃水浴鍋10 min使酶失活。

1.2.4 ISSR-PCR建立 分別以各個(gè)材料未酶切，HapⅡ和MSPⅠ等2種酶切的基因組DNA為模版，以篩選的17個(gè)UBC引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，適溫退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0 g·kg-1瓊脂糖凝膠電泳檢測[10]。

1.2.5 山核桃幼胚基因組DNA甲基化水平分析 MspⅠ和HapⅡ?qū)ο嗤盖形稽c(diǎn)甲基化的敏感程度不同以及ISSR是顯性標(biāo)記是分析甲基化變異的理論基礎(chǔ)[11]。同裂酶MspⅠ和HpaⅡ的酶切位點(diǎn)均為“CCGG/GGCC”，由于兩者對該位點(diǎn)胞嘧啶甲基化的敏感程度不同，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增多態(tài)性片段就反映出該位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)及程度。MspⅠ能切割無甲基化和內(nèi)甲基化位點(diǎn)而不能切割外甲基化位點(diǎn)，HpaⅡ能切割無甲基化和單鏈甲基化（雙鏈中只有鏈甲基化）而不能切割雙鏈甲基化[12]。因而DNA分別用MspⅠ和HpaⅡ酶切后選擴(kuò)，根據(jù)帶型的有無可能出現(xiàn)4種甲基化類型，Ⅰ型：都有帶，代表該位點(diǎn)存在外側(cè)胞嘧啶全（雙鏈）甲基化或無CCGG位點(diǎn)；Ⅱ型：都無帶，代表該CCGG位點(diǎn)無甲基化或?yàn)閮?nèi)側(cè)胞嘧啶半（單鏈）甲基化；Ⅲ型：HpaⅡ有帶而MspⅠ無帶，代表該位點(diǎn)為內(nèi)側(cè)胞嘧啶半（雙鏈）甲基化；Ⅳ型：HpaⅡ無帶而MspⅠ有帶，代表該位點(diǎn)為外側(cè)胞嘧啶半（單鏈）甲基化。由表2可知：Ⅲ型為全甲基化，Ⅳ型為半甲基化，但Ⅰ型和Ⅱ型的全/半甲基化狀態(tài)僅根據(jù)條帶位點(diǎn)還不確定，需進(jìn)一步根據(jù)不同時(shí)期同一引物的同一位點(diǎn)條帶差異來判斷胞嘧啶全/半甲基化變異（表3）。

表1 篩選的引物序列Table1 Primers for ISSR

表2 ISSR未酶切和甲基化敏感酶HpaⅡ和Msp I酶切產(chǎn)生的條帶類型Table2 DNA methylation band types of uncut,HpaⅡand Msp I of ISSR

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃幼胚不同發(fā)育時(shí)期對DNA甲基化類型的影響

17個(gè)引物在各個(gè)發(fā)育時(shí)期山核桃幼胚樣品中共擴(kuò)增檢測到的128個(gè)甲基化位點(diǎn)。5個(gè)時(shí)期幼胚甲基化比例依次為23.44%，25.78%，28.90%，40.62%和42.19%。甲基化比例隨著胚的發(fā)育逐漸升高。研究結(jié)果同時(shí)表明，5個(gè)時(shí)期幼胚甲基化類型較豐富，4種甲基化類型均存在（圖1-1～4）。由表4可知：在17個(gè)引物中，引物809擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多，為11個(gè)，其中，第9周的Ⅰ～Ⅳ類型的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)分別為7，4，0，0；第10周的Ⅰ～Ⅳ類型的位點(diǎn)數(shù)分別為7，4，0，0；第11周的Ⅰ～Ⅳ型的位點(diǎn)數(shù)分別為7，4，0，0；第12周的Ⅰ～Ⅳ型的位點(diǎn)數(shù)分別為6，4，1，0；第13周的Ⅰ～Ⅳ型的位點(diǎn)數(shù)分別為6，4，1，0。圖2表明：隨著幼胚的發(fā)育，4種DNA甲基化類型呈現(xiàn)規(guī)律性變化。第1種類型位點(diǎn)數(shù)最多，從第9周至13周DNA甲基化類型Ⅰ呈逐漸上升趨勢，而Ⅳ型呈逐漸下降趨勢；但在Ⅱ型、Ⅲ型中，各發(fā)育階段變化相對平穩(wěn)（圖2）。

表3 Ⅰ型和Ⅱ型甲基化狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)Table3 DNA methylation of typeⅠand typeⅡ

2.2 山核桃幼胚不同發(fā)育時(shí)期對胞嘧啶全/半甲基化變異的影響

進(jìn)一步分析表明：5個(gè)時(shí)期均存在全甲基化位點(diǎn)和半甲基化位點(diǎn)。5個(gè)時(shí)期全甲基化位點(diǎn)數(shù)分別為10，11，21，31，32，所占比例分別為7.81%，8.59%，16.40%，24.22%和25.00%；5個(gè)時(shí)期半甲基化位點(diǎn)數(shù)分別為 20，22，16，21，22，所占比例分別為 15.62%，17.19%，12.50%，16.41%，17.19%。由此可知：山核桃幼胚5個(gè)發(fā)育時(shí)期在基因組DNA甲基化水平上存在著較大差異，不同時(shí)期幼胚之間基因組DNA全/半甲基化位點(diǎn)的絕對數(shù)量和相對數(shù)量都有不同程度的改變。盡管總甲基化比例及全甲基化位點(diǎn)比例隨著胚齡的增加而逐漸升高；半甲基化位點(diǎn)所占比例呈小幅波動(dòng)并基本持平狀態(tài)（表 5）。

圖1 山核桃幼胚不同發(fā)育時(shí)期的DNA甲基化類型Figure1 DNA methylation band types of different development stages of immature embryos of Carya cathayensis

3 討論

DNA甲基化是植物正常生長發(fā)育所必需的，但是甲基化水平不足，也會導(dǎo)致不正常生長[13]。在高等植物基因組中，DNA甲基化在發(fā)育過程中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化之中，同一物種在不同的發(fā)育時(shí)期，甲基化水平會發(fā)生變化，而且不同植物的變化趨勢是不一樣的[14]。越來越多的試驗(yàn)結(jié)果表明，DNA甲基化對植物正常發(fā)育起重要作用。對某些植物的研究發(fā)現(xiàn)：如果在基因組的重要位點(diǎn)上誘導(dǎo)產(chǎn)生或自然發(fā)生DNA甲基化的變異，就會引起廣泛的發(fā)育異?，F(xiàn)象[15]。油菜Brassica campestris種子在萌發(fā)時(shí)伴隨著大量的去甲基化事件，導(dǎo)致甲基化水平的降低[16]。在同一植株的同一發(fā)育時(shí)期在不同組織中，DNA甲基化也有所差異，研究發(fā)現(xiàn)水稻Oryza sativa在幼苗時(shí)期的甲基化水平高于旗葉[17]。在不同的植物之間，同源的 DNA序列的甲基化水平差異也非常明顯，對11個(gè)不同被子植物的 25S rDNA的甲基化研究發(fā)現(xiàn)，這些物種的甲基化水平差異較大，其中擬南芥Arabidopsis thaliana低至4%，而豌豆Pisum sativum和洋蔥Allium cepa高達(dá)80%和90%[18]。前人的研究資料表明[19]，植物在發(fā)育過程中，胞嘧啶的甲基化對基因具有重要的表達(dá)調(diào)控作用，在基因的內(nèi)部或鄰近區(qū)域發(fā)生甲基化可以抑制這些基因的表達(dá)，而去甲基化后又可以激活基因的表達(dá)。

本研究用適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增反應(yīng)從100個(gè)ISSR引物中篩選了17個(gè)引物，選擇引物的標(biāo)準(zhǔn)是它們能產(chǎn)生和再次產(chǎn)生清晰的、多態(tài)性豐富的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖3）。在5個(gè)時(shí)期山核桃幼胚中，17條ISSR標(biāo)記共產(chǎn)生了128個(gè)擴(kuò)增條帶。研究結(jié)果表明：5個(gè)發(fā)育時(shí)期山核桃發(fā)生了不同程度的甲基化模式和水平的變化，如DNA甲基化比例隨著幼胚的發(fā)育逐漸升高，暗示部分基因正在關(guān)閉。同時(shí)，對于這些基因而言，去甲基化可能是基因進(jìn)一步表達(dá)的必須步驟。這似乎表明：植物通過DNA甲基化和去甲基化的方式實(shí)現(xiàn)基因的有序表達(dá)[20]。根據(jù)全/半胞嘧啶甲基化均被觀察到的結(jié)果，我們推測甲基化變異可能與幼胚成熟的一些重要屬性有關(guān)。本研究在用 MspⅠ和 HapⅡ酶切 ISSR圖譜和未酶切圖譜比較時(shí)，還觀察到了一種特殊的現(xiàn)象，即酶切后出現(xiàn)了未酶切沒有的新條帶（圖3，箭頭所示）。理論上酶切ISSR圖譜的出現(xiàn)的條帶必然在未酶切ISSR圖譜中出現(xiàn)，這種情況可能由于未酶切基因組存在一定的構(gòu)象造成PCR引物結(jié)合困難，酶切后引物可以結(jié)合上去[21]。因此，盡管本研究已獲得山核桃幼胚發(fā)育DNA甲基化狀態(tài)的初步結(jié)果，但由于本研究尚未應(yīng)用特異條帶回收并雜交驗(yàn)證，關(guān)于山核桃幼胚不同發(fā)育階段基因表達(dá)與基因組DNA甲基化以及胚性感受態(tài)之間關(guān)系還需要進(jìn)一步探索。

圖2 發(fā)育時(shí)期對山核桃幼胚甲基化類型的影響Figure2 Effect of development stage on DNA methylation types of immature embryos of Carya cathayensis

表4 ISSR在不同發(fā)育階段幼胚的DNA甲基化類型統(tǒng)計(jì)Table4 DNA methylation types on different development stages of immature embryos of ISSR

表5 ISSR在不同發(fā)育階段幼胚的胞嘧啶甲基化變異位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table5 Total/half DNA methylation on different development stages of ISSR

圖3 引物分別在山核桃幼胚發(fā)育的5個(gè)時(shí)期材料中的擴(kuò)增結(jié)果Figure3 Amplification results of immature embryos in five development stages by different ISSR primers

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